Applicazione del sistema RatWalker per l'analisi dell'andatura in un modello genetico di ratto della malattia di Parkinson

Riepilogo

Qui descriviamo il sistema RatWalker, costruito riprogettando l'apparato MouseWalker per adattarsi alle maggiori dimensioni e peso dei ratti. Questo sistema utilizza la riflessione interna totale frustrata (FTIR), l'acquisizione video ad alta velocità e il software di analisi ad accesso aperto per tracciare e quantificare i parametri dell'andatura.

Abstract

La malattia di Parkinson (PD) è una malattia neurodegenerativa progressiva causata dalla perdita di neuroni dopaminergici (DA) nella pars compacta substantia nigra. Le anomalie dell'andatura, tra cui la diminuzione dell'oscillazione del braccio, la velocità di camminata più lenta e i passi più brevi sono comuni nei pazienti con PD e compaiono precocemente nel corso della malattia. Pertanto, la quantificazione dei pattern motori in modelli animali di PD sarà importante per la caratterizzazione fenotipica durante il decorso della malattia e dopo il trattamento terapeutico. La maggior parte dei casi di PD sono idiopatici; tuttavia, l'identificazione di forme ereditarie di PD ha scoperto mutazioni e varianti genetiche, come mutazioni con perdita di funzione in Pink1 e Parkin, due proteine coinvolte nel controllo della qualità mitocondriale che potrebbero essere sfruttate per creare modelli animali. Mentre i topi sono resistenti alla neurodegenerazione dopo la perdita di Pink1 e Parkin (delezione singola e combinata), nei ratti, Pink1 ma non la carenza di Parkin porta alla perdita del neurone DA nigrale e alla compromissione motoria. Qui, riportiamo l'utilità dell'imaging FTIR per scoprire i cambiamenti dell'andatura in ratti maschi giovani (2 mesi di età) che camminano liberamente con perdita combinata di Pink1 e Parkin prima dello sviluppo di una grossolana anomalia motoria visivamente apparente quando questi ratti invecchiano (osservati a 4-6 mesi), caratterizzati da trascinamento degli arti posteriori come precedentemente riportato nei ratti knockout (KO) Pink1.

Introduzione

La PD, la più comune malattia neurodegenerativa del movimento legata all'età, è causata dalla perdita di neuroni DA nella substantia nigra pars compacta. Questa perdita di neuroni DA nigrali e gli input di DA nello striato portano alle compromissioni osservate della funzione motoria osservate nei pazienti con PD ^1,2. Le caratteristiche motorie che definiscono i pazienti con PD, note collettivamente come parkinsonismo, includono rigidità, tremore a riposo, bradicinesia, instabilità posturale e micrografia³. Inoltre, i disturbi dell'andatura, che sono comuni nei pazienti con PD, compaiono precocemente nel corso della malattia ^1,4,5. Mentre alcuni stili di vita sono suggeriti per aiutare a rallentare la progressione del PD, come un'alimentazione sana e un regolare esercizio fisico, attualmente non esiste una cura per il PD, solo farmaci per gestire i sintomi. Ciò lascia spazio alla necessità di ulteriori indagini nella speranza di migliorare le terapie. Pertanto, la caratterizzazione del modello di andatura nei modelli animali di PD è uno strumento cruciale per caratterizzare la rilevanza del modello e il modo in cui i trattamenti terapeutici volti a controllare il PD stanno prevenendo o migliorando le menomazioni motorie.

Ci sono vari modelli animali PD che sono stati utilizzati per testare trattamenti terapeutici, tuttavia ognuno ha i suoi limiti. Ad esempio, modelli animali trattati con la neurotossina 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetraidropiridina (MPTP) hanno prodotto una grande quantità di informazioni sui processi importanti per la perdita dei neuroni DA nigrale e i successivi adattamenti striatali, e hanno indicato il ruolo dei mitocondri nella patogenesi della PD; tuttavia, il background patogenetico del modello MPTP è di natura tossica piuttosto che un processo neurodegenerativo come nel PD 6^umano. Ulteriori modelli chimicamente inducibili includono 6-idrossidopamina (6-OHDA) e rotenone. 6-OHDA è stato il primo agente utilizzato per indurre PD mediante accumulo selettivo del farmaco nei neuroni DA, che alla fine uccide i neuroni e porta a sintomi simili a PD. Questo modello è stato utilizzato per la prima volta per il monitoraggio della deplezione di DA esaminando il comportamento in risposta all'anfetamina e all'apomorfina⁷. Questo metodo di induzione del PD si è dimostrato utile per lo screening di agenti farmacologici che hanno un impatto su DA e sui suoi recettori⁸. Mentre il modello 6-OHDA è un ottimo modello per tracciare i deficit motori quantificabili, questo modello non mostra come la graduale perdita di neuroni e la formazione di corpi di Lewy influiscano sull'animale. L'altro metodo di induzione, il rotenone, ha dimostrato di avere una progressiva degenerazione dei neuroni nigrostriatali con la perdita di tirosina idrossilasi e trasportatore DA, consentendo un modello migliore per tracciare la perdita di neuroni nel tempo⁹. I ratti trattati con rotenone hanno mostrato bradicinesia, instabilità posturale e andatura instabile¹⁰. Tuttavia, questo metodo è risultato essere ampiamente variabile tra diversi ceppi di ratti, il che ha provocato dubbi sul fatto che il rotenone sia o meno un modello PD affidabile^11,12,13. Mentre l'analisi dell'andatura ha dimostrato di essere influenzata dall'induzione del PD nei ratti, fino ad oggi, i modelli di ratto PD geneticamente indotti non sono stati prontamente utilizzati per l'analisi dell'andatura camminando liberamente lungo una pista.

Un modo per analizzare la compromissione motoria nei roditori che camminano liberamente è l'analisi cinematica dell'andatura, che può essere eseguita utilizzando l'imaging FTIR. Questo metodo consolidato utilizza un sensore tattile ottico basato su FTIR, che registra e traccia le impronte dei roditori mentre si muovono lungo la pista^14,15,16. Rispetto ad altri metodi, FTIR non dipende da alcun marcatore sul corpo dell'animale che potrebbe interferire con le impronte delle zampe. La generazione dei dati video produce impronte digitali di zampe di tutti e quattro gli arti che possono essere combinate per creare un modello di camminata dinamico e riproducibile per vari modelli di roditori. Il principio dell'analisi dell'andatura basata sull'imaging è quello di prendere ogni singola zampa e misurare l'area di contatto nel tempo mentre il roditore cammina lungo la pista. Ogni posizione è rappresentata da un aumento dell'area della zampa (nella fase di frenata) e una diminuzione dell'area della zampa (nella fase di propulsione). Questo è proceduto dalla fase di oscillazione, che è quando non viene rilevato alcun segnale di zampa. Dopo la valutazione del video, vengono generati diversi parametri che possono essere utilizzati per confrontare il modello wild-type (WT) rispetto al modello PD. Alcuni esempi di parametri sono la lunghezza del passo (distanza che la zampa copre in un passo), la durata dell'oscillazione (durata del tempo in cui la zampa non è in contatto con la pista), la velocità di oscillazione (lunghezza del passo in funzione della durata dell'oscillazione) e il modello di passo (passi diagonali, gradini laterali o gradini della cintura).

Per dimostrare l'utilità della FTIR per scoprire i primi cambiamenti del modello di andatura nei ratti, abbiamo usato un modello genetico di ratto di PD. Mentre la maggior parte dei casi di PD sono idiopatici; l'identificazione di forme ereditarie di mutazioni e varianti genetiche scoperte per il PD, come le mutazioni con perdita di funzione in Pink1 e Parkin, due proteine coinvolte nel controllo della qualità mitocondriale¹⁷, che potrebbero essere sfruttate per creare modelli animali¹⁸. Sfortunatamente, i topi sono resistenti alla neurodegenerazione per perdita di queste proteine (singole e combinate)19,20,21. Nei ratti, il Pink1 ma non il deficit di Parkin porta alla perdita del neurone DA nigrale e a menomazioni motorie²², ma senza penetranza completa. Pertanto, abbiamo generato un modello combinato di ratto Pink1 / Parkin double knockout (DKO), che mostra il fenotipo di trascinamento degli arti posteriori visivamente evidente riportato nei ratti maschi Pink1 KO²², ma ora a un tasso più elevato: 100% contro 30-50% dei maschi tra 4-6 mesi.

Mentre questo metodo funziona bene per analizzare i deficit motori nei topi¹⁴, le specifiche del sistema di andatura di imaging FTIR per adattarsi alle dimensioni e al peso dei ratti non erano precedentemente disponibili non commerciali. Qui spieghiamo come costruire il RatWalker, un sistema di imaging dell'andatura FTIR modificato modellato sul MouseWalker¹⁴, tranne adattato per le dimensioni e il peso dei ratti. Questo sistema utilizza un effetto ottico, FTIR, per fornire un metodo per visualizzare e successivamente registrare le impronte degli animali per l'analisi. Il contatto del piede di un animale con la guida d'onda ottica (piattaforma) provoca interruzioni nel percorso della luce con conseguente effetto di dispersione visibile, che viene catturato utilizzando videografia domestica ad alta velocità ed elaborazione utilizzando software open source. Questo studio dimostra il potere dell'imaging FTIR nello studio dei cambiamenti dell'andatura nei modelli genetici di ratto di PD. Ad esempio, mentre i cambiamenti motori palesi visivamente evidenti (cioè il trascinamento degli arti posteriori) sono osservati nei ratti DKO maschi al più presto a 4 mesi, utilizzando FTIR siamo in grado di scoprire anomalie del gate nei ratti DKO maschi a 2 mesi di età.

Protocollo

Tutti gli studi sugli animali sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Università del Nebraska Medical Center.

1. Apparato di deambulazione

NOTA: Modellato dal MouseWalker¹⁴, il RatWalker è stato progettato con dimensioni proporzionali alla differenza di lunghezza del passo tra ratti e topi. È costituito da una retroilluminazione laterale, un involucro per passerella, una passerella ottica a guida d'onda, uno specchio e una telecamera (Figura S1). Strisce LED, orientate in posizione sfalsata, sono state utilizzate su ciascun lato della passerella e guide d'onda di retroilluminazione per accogliere il materiale extra. I materiali necessari per costruire l'apparato di andatura modificato possono essere trovati nella Tabella S1.

1. Utilizzare una retroilluminazione (Figura S2) per creare una silhouette dell'animale che viene utilizzata dal software per assegnare posizione, direzione del movimento e qualità morfometriche. La costruzione è composta da un pannello stratificato di un diffusore acrilico, guida d'onda ottica, riflettore e strisce luminose a LED assemblate all'interno di un telaio in alluminio di serie (Tabella S1).
2. Utilizzare un recinto per passerelle (Figura S3) per guidare l'animale lungo la piattaforma e dirigerlo verso la gabbia domestica. La costruzione è costituita da fogli acrilici trasparenti saldati a solvente con diclorometano (tabella S2).
3. Utilizzare la passerella (Figura S4) per fornire il mezzo per generare impronte illuminate. La passerella è costruita in acrilico trasparente, che è illuminato lateralmente con strisce LED e alloggiato in angolo di alluminio (Tabella S3).
4. Posizionare uno specchio (Figura S5) direttamente sotto la passerella con un angolo di 45 gradi per riflettere la parte inferiore della passerella per la videografia. È costruito da uno specchio di vetro spesso 1/4 "supportato da acrilico e staffe angolate disposte in fila (Tabella S4).
5. Esegui la videografia utilizzando una action cam ad alta velocità montata su treppiede, di qualità domestica.

2. Configurazione dell'attrezzatura

1. Allineare la retroilluminazione, la passerella e lo specchio secondo la Figura S1, sopra un piano di lavoro, un banco da lavoro o un carrello stabile. Assicurarsi che ogni componente sia centrato rispetto alla passerella.
2. Utilizzando un livello, assicuratevi che i componenti siano a piombo orizzontalmente.
3. Posizionare il recinto della passerella sulla parte superiore della passerella.
4. Pulire tutte le superfici di contatto con etanolo al 70%. Assicurarsi di utilizzare un asciugamano non abrasivo per evitare graffi della passerella.
5. Montare la fotocamera ad alta velocità su un treppiede da 57 pollici e posizionarla a metà linea rispetto allo specchio, distanziata abbastanza da catturare l'intera passerella all'interno del campo visivo. Dal menu delle impostazioni video, assicurati che la fotocamera ad alta velocità sia impostata sull'acquisizione lineare in modalità 1080p a 120 fotogrammi al secondo (fps) con qualsiasi tipo di regolazione automatica o ottimizzazioni disattivate.
6. Collegare e accendere le strisce luminose a LED per la retroilluminazione e la passerella. Potrebbe essere necessario attenuare la retroilluminazione per ridurre l'acquisizione dello sfondo.

3. Acclimatazione degli animali

NOTA: Una settimana prima del primo esperimento, eseguire gli animali attraverso l'apparato di andatura modificato.

1. Posiziona una gabbia domestica al capolinea della passerella.
2. Con il recinto installato e le luci spente, posizionare il topo alla fine della passerella di fronte alla gabbia domestica e consentirgli di attraversare la passerella in modo non forzato.
3. Esegui ogni topo attraverso l'apparato di andatura modificato più volte, fino a quando non possono attraversare agevolmente l'intera passerella.
4. Ripeti il processo due giorni prima dell'esperimento.

4. Procedura di andatura

1. Posiziona una gabbia domestica alla fine della passerella prima dell'inizio di ogni corsa per servire come spunto positivo per il topo per attraversare la passerella.
2. Spegni le luci della stanza, accendi la fotocamera e inizia a registrare diversi secondi prima che il topo venga posizionato sulla piattaforma.
   NOTA: assicurarsi di utilizzare una scheda di memoria ufficialmente raccomandata dal produttore della fotocamera. Una scheda di memoria non elencata potrebbe ancora funzionare, ma non è garantito che acquisisca al presunto frame rate.
3. Con il recinto installato, posizionare il topo alla fine della passerella di fronte alla gabbia domestica e consentirgli di attraversare la passerella in modo non forzato.
4. Interrompi la registrazione una volta che l'animale raggiunge il capolinea della passerella.
5. Pulire la passerella utilizzando etanolo al 70% e un asciugamano non abrasivo tra una corsa e l'altra e dopo che un animale urina o defeca, quindi lasciare evaporare l'etanolo prima di introdurre un altro animale.
6. Fai correre i ratti attraverso la passerella per un totale di 7 volte durante ogni periodo di osservazione, prendendo le prime tre corse che segnano come passaggio per l'analisi.
7. Segna una corsa come passaggio se l'animale fa quattro o più passi consecutivi in direzione della gabbia domestica senza interruzioni a causa di toelettatura, pause o movimenti erranti.
   NOTA: È buona norma registrare la massa degli animali prima di ogni ciclo di misure. Per il nostro studio, WT (n = 7) e DKO (n = 8) pesavano rispettivamente 200,3 ± 21,67 g e 296,6 ± 3,85 g (p = 0,004, test t spaiato con correzione di Welch). Non vediamo un problema con i ratti di qualsiasi età o dimensione.

5. Pre-elaborazione video

NOTA: I video catturati dalla fotocamera ad alta velocità sono renderizzati in formato mp4 a 120 fps e una risoluzione di 1080p. Per alleggerire il carico sul software analitico a valle, prima taglia le riprese non necessarie e rimuovi l'audio da ogni video usando il software LosslessCut (versione 3.23.7, https://github.com/mifi/lossless-cut), quindi converti il flusso video mp4 in una sequenza di immagini png usando il software open source FFmpeg (versione 4.2, http://ffmpeg.org/). Nota: altri formati Lossless come tiff possono essere utilizzati al posto di png.

1. Creare una directory per i video su un PC con Windows 7 o versione successiva, quindi trasferire i video dal dispositivo di archiviazione della videocamera ad alta velocità alla directory appena creata. Inoltre, copiare ffmpeg.exe nella stessa posizione.
2. In LosslessCut, trascina i video sull'interfaccia da aprire. Scartare l'audio, impostare i punti di taglio iniziale e finale in modo da includere solo la parte analiticamente rilevante del video, impostare il formato del fotogramma di acquisizione su png ed esportare. Una volta esportato il video, rinominare il file video utilizzando qualsiasi convenzione di denominazione seguita da "_trimmed".
3. Per convertire in batch i video in sequenze di immagini, aprire un prompt dei comandi, impostare la directory di lavoro sulla posizione dei video con "cd [percorso della directory]" ed eseguire i seguenti comandi:
   per %i in (*) do mkdir "%~ni_cropped"
   per %i in (*) do mkdir "%~ni_trimmed"
   for /f "tokens=1 delims=." %a in ('dir /B *_trimmed. MP4') do ffmpeg -i "%a.MP4" "%a/%a_%04d.png"
4. Al termine del processo batch, aprire ogni sequenza di immagini in ImageJ Fiji²³ e ritagliare la sequenza nella regione di interesse (ROI) che comprende l'area del pavimento all'interno della quale viene osservato il ratto.
5. Per ridurre lo sfondo dall'illuminazione della passerella, aumentare il bilanciamento del colore minimo del canale ciano a 76.
6. Salva come sequenza di immagini e cambia il suffisso "_trimmed" in "_cropped", salvando i file nella rispettiva cartella "_cropped".

6. Elaborazione dell'andatura

NOTA: i dati dell'andatura vengono elaborati e quantificati utilizzando il software disponibile gratuitamente, MouseWalker (http://biooptics.markalab.org/MouseWalker/)¹⁴.

1. Decomprimere e installare il software MouseWalker su un PC che esegue un ambiente Windows a 64 bit con Microsoft Excel installato.
2. Dopo aver avviato MouseWalker.exe, eseguire una calibrazione iniziale della scala per ogni set di esecuzioni. Carica una sequenza di immagini e utilizzando punti di riferimento o un righello catturato nel video, misura due punti di distanza nota. Calcola il numero di pixel per centimetro nel fotogramma video e inserisci questo valore nella sezione dei parametri del modulo delle impostazioni insieme alla frequenza fotogrammi di acquisizione video.
3. Allo stesso modo, misurare la testa, la coda e le zampe del ratto per determinare la lunghezza della testa, la larghezza e l'area massima della coda, l'area minima e massima del piede e altre caratteristiche necessarie per completare la sezione dei parametri di tracciamento del modulo delle impostazioni di MouseWalker. Vedere http://biooptics.markalab.org/MouseWalker/ per il manuale dell'utente e altra documentazione.
4. Per ottenere i valori dell'area del corpo, aprite la stessa sequenza di immagini in ImageJ, disegnate una selezione che delinea il ratto ed eseguite un conteggio dei pixel della regione di interesse (ROI).
5. Parametri e impostazioni utilizzati per questa pubblicazione (Figura S6).
   NOTA: i parametri vengono forniti a scopo illustrativo e dipendono dalla scala del video, dall'hardware di acquisizione e dalle condizioni. La calibrazione e la regolazione del software sono necessarie ogni volta che la telecamera o l'apparecchiatura viene riposizionata. L'acquisizione di un dispositivo di misura all'interno dell'acquisizione migliora la precisione e facilita la calibrazione.
6. Dopo la calibrazione, caricare ogni sequenza di immagini. Selezionando auto inizierà l'assegnazione autonoma delle impronte.
7. Scorri ogni fotogramma della sequenza, correggendo manualmente le impronte assegnate in modo errato. Salva una volta completato questo passaggio.
8. Infine, selezionare valuta per elaborare i dati relativi alla posizione dell'impronta e alla pressione. Una serie di grafici, immagini e un foglio di calcolo con metriche quantitative dell'andatura verranno esportati in una cartella dei risultati.

7. Analisi dei dati

1. Utilizza il foglio di calcolo esportato alla fine di ogni valutazione che contiene i dati quantitativi dell'andatura per ogni corsa. Concatenare i dati di ogni corsa e la media per ratto. Tracciare i dati medi e testare la significatività utilizzando GraphPad Prism versione 7.0a.

Risultati

Manutenzione delle colonie di ratti
La generazione e la caratterizzazione dei ratti Pink1 e Parkin single KO sono state descritte in precedenza²². I ratti KO singoli Pink1 e Parkin sono stati ottenuti da SAGE Labs (e ora disponibili da Envigo). I ratti DKO sono stati generati incrociando ratti Pink1-/- con ratti Parkin-/- per ottenere ratti Pink1+/-/Parkin+/-, che sono stati incrociati per ottenere ratti Pink1-/-/Parkin-

Discussione

I disturbi dell'andatura, tra cui una diminuzione dell'oscillazione del braccio, una velocità di camminata più lenta e passi più brevi, sono una caratteristica distintiva della malattia di Parkinson e si verificano all'inizio del decorso della malattia ^1,5. Nel corso degli anni sono stati sviluppati diversi metodi per osservare e registrare i passi per l'analisi dell'andatura nei modelli di PD dei roditori, con tecniche manuali per quantificare la posizione de...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminum
1.5” Aluminum Angle (1/8” - 6063)			Dimensions: 8' Qty: 8
1” Aluminum Square Tube (1/16” - 6063)			Dimensions: 8' Qty: 4
32 Gauge Aluminum Sheet			Dimensions: 10' Qty: 1
1” Aluminum Tube (1/8” - 6063)			Dimensions: 8' Qty: 1
Acrylic
7/32” Clear Acrylic Sheet			Dimensions: 4'x8' Qty: 2
1/8” White Acrylic Sheet 55% (2447)			Dimensions: 4'x8' Qty: 1
Mirror
7/32” Glass Mirror			Dimensions: 60"x12" Qty: 1
LED
5050 LED Tape Light (Green)			Dimensions: 16.4' Qty: 1
5050 LED Tape Light (Red)			Dimensions: 16.4' Qty: 1
Camera
GoPro Hero 6 Black			Qty: 1
Tripod			Dimensions: 57" Qty: 1