Aplicación del sistema RatWalker para el análisis de la marcha en un modelo genético de ratas de la enfermedad de Parkinson

Resumen

Aquí describimos el sistema RatWalker, construido mediante el rediseño del aparato MouseWalker para adaptarse al aumento de tamaño y peso de las ratas. Este sistema utiliza reflexión interna total frustrada (FTIR), captura de video de alta velocidad y software de análisis de acceso abierto para rastrear y cuantificar los parámetros de la marcha.

Resumen

La enfermedad de Parkinson (EP) es un trastorno neurodegenerativo progresivo causado por la pérdida de neuronas dopaminérgicas (DA) en la sustancia negra pars compacta. Las anomalías de la marcha, que incluyen disminución del balanceo del brazo, velocidad de marcha más lenta y pasos más cortos son comunes en pacientes con EP y aparecen temprano en el curso de la enfermedad. Por lo tanto, la cuantificación de los patrones motores en modelos animales de EP será importante para la caracterización fenotípica durante el curso de la enfermedad y durante el tratamiento terapéutico. La mayoría de los casos de EP son idiopáticos; sin embargo, la identificación de formas hereditarias de EP descubrió mutaciones y variantes genéticas, como mutaciones de pérdida de función en Pink1 y Parkin, dos proteínas involucradas en el control de calidad mitocondrial que podrían aprovecharse para crear modelos animales. Mientras que los ratones son resistentes a la neurodegeneración tras la pérdida de Pink1 y Parkin (deleción única y combinada), en ratas, la deficiencia de Pink1 pero no Parkin conduce a la pérdida de neuronas DA nigral y deterioro motor. Aquí, informamos la utilidad de las imágenes FTIR para descubrir cambios en la marcha en ratas macho jóvenes (2 meses de edad) que caminan libremente con pérdida combinada de Pink1 y Parkin antes del desarrollo de una anomalía motora aparente visual a medida que estas ratas envejecen (observada a los 4-6 meses), caracterizada por arrastre de las extremidades posteriores como se informó anteriormente en ratas Pink1 knockout (KO).

Introducción

La EP, el trastorno neurodegenerativo del movimiento más común relacionado con la edad, es causada por la pérdida de neuronas DA en la sustancia negra pars compacta. Esta pérdida de neuronas DA nigral y las entradas de DA en el cuerpo estriado conducen a las alteraciones de la función motora observadas observadas en pacientes con EP ^1,2. Las características motoras definitorias de los pacientes con EP, conocidas colectivamente como parkinsonismo, incluyen rigidez, temblor en reposo, bradicinesia, inestabilidad postural y micrografía³. Además, las alteraciones de la marcha, que son comunes en pacientes con EP, aparecen temprano en el curso de la enfermedad ^1,4,5. Si bien se sugieren ciertos estilos de vida para ayudar a retrasar la progresión de la EP, como una alimentación saludable y ejercicio regular, actualmente no existe una cura para la EP, solo medicamentos para controlar los síntomas. Esto deja espacio para la necesidad de más investigación con la esperanza de mejorar la terapéutica. Por lo tanto, la caracterización del patrón de marcha en modelos animales de EP es una herramienta crucial para caracterizar la relevancia del modelo, así como la forma en que los tratamientos terapéuticos dirigidos a controlar la EP están previniendo o mejorando las deficiencias motoras.

Hay varios modelos animales de EP que se han utilizado para probar tratamientos terapéuticos, sin embargo, cada uno tiene sus limitaciones. Por ejemplo, los modelos animales tratados con la neurotoxina 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP) han proporcionado una gran cantidad de información sobre procesos importantes para la pérdida de neuronas DA nigral y las posteriores adaptaciones estriatales, y han señalado el papel de las mitocondrias en la patogénesis de la EP; sin embargo, el fondo patogénico del modelo MPTP es de naturaleza tóxica más que un proceso neurodegenerativo como en la EP^{humana 6}. Los modelos adicionales inducibles químicamente incluyen 6-hidroxidopamina (6-OHDA) y rotenona. 6-OHDA fue el primer agente utilizado para inducir la EP por acumulación selectiva del fármaco en las neuronas DA, que eventualmente mata las neuronas y conduce a síntomas similares a la EP. Este modelo se utilizó por primera vez para el seguimiento del agotamiento de DA mediante el examen del comportamiento en respuesta a la anfetamina y la apomorfina⁷. Este método de inducción de DP ha demostrado ser útil para el cribado de agentes farmacológicos que impactan la DA y sus receptores⁸. Si bien el modelo 6-OHDA es un gran modelo para rastrear déficits motores cuantificables, este modelo no muestra cómo la pérdida gradual de neuronas y la formación de cuerpos de Lewy afectan al animal. El otro método de inducción, la rotenona, ha demostrado tener una degeneración progresiva de las neuronas nigroestriatales con la pérdida de tirosina hidroxilasa y transportador DA, lo que permite un mejor modelo para rastrear la pérdida de neuronas a lo largo del tiempo⁹. Las ratas tratadas con rotenona mostraron bradicinesia, inestabilidad postural y marcha inestable¹⁰. Sin embargo, se ha encontrado que este método es ampliamente variable entre las diferentes cepas de ratas, lo que ha provocado el cuestionamiento de si la rotenona es o no un modelo confiable de DP^11,12,13. Si bien se ha demostrado que el análisis de la marcha se ve afectado por la inducción de la EP en ratas, hasta la fecha, los modelos de ratas con EP inducidos genéticamente no se han utilizado fácilmente para el análisis de la marcha caminando libremente por una pista.

Una forma de analizar el deterioro motor en roedores que caminan libremente es el análisis cinemático de la marcha, que se puede realizar utilizando imágenes FTIR. Este método establecido utiliza un sensor táctil óptico basado en FTIR, que registra y rastrea las huellas de los roedores a medida que avanzan por la pista^14,15,16. En comparación con otros métodos, FTIR no depende de ningún marcador en el cuerpo del animal que pueda interferir con las huellas de las patas. La generación de los datos de video produce huellas digitales de las cuatro extremidades que se pueden combinar para crear un patrón de marcha dinámico y reproducible para varios modelos de roedores. El principio del análisis de la marcha basado en imágenes es tomar cada pata individual y medir el área de contacto a lo largo del tiempo a medida que el roedor camina por la pista. Cada postura está representada por un aumento en el área de la pata (en la fase de frenado) y una disminución en el área de la pata (en la fase de propulsión). Esto es precedido por la fase de oscilación, que es cuando no se detecta ninguna señal de pata. Después de la evaluación del video, se generan varios parámetros que se pueden usar para comparar el tipo salvaje (WT) con el modelo PD. Algunos ejemplos de los parámetros son la longitud del paso (distancia que cubre la pata en un solo paso), la duración del giro (duración del tiempo que la pata no está en contacto con la pista), la velocidad del giro (longitud del paso en función de la duración del giro) y el patrón de paso (pasos diagonales, pasos laterales o pasos de faja).

Para demostrar la utilidad de FTIR para descubrir cambios tempranos en el patrón de marcha en ratas, utilizamos un modelo genético de EP en ratas. Si bien la mayoría de los casos de EP son idiopáticos; la identificación de formas hereditarias de EP descubrió mutaciones y variantes genéticas, como mutaciones de pérdida de función en Pink1 y Parkin, dos proteínas involucradas en el control de calidad mitocondrial¹⁷, que podrían aprovecharse para crear modelos animales¹⁸. Desafortunadamente, los ratones son resistentes a la neurodegeneración tras la pérdida de estas proteínas (simples y combinadas)19,20,21. En ratas, la deficiencia de Pink1 pero no de Parkin conduce a la pérdida de neuronas DA nigral y alteraciones motoras²², pero sin penetrancia completa. Por lo tanto, generamos un modelo combinado de rata Pink1 / Parkin double knockout (DKO), que muestra el fenotipo de arrastre de extremidades posteriores visualmente aparente reportado en ratas macho Pink1 KO²² pero ahora a una tasa más alta: 100% versus 30-50% de los machos entre 4-6 meses.

Si bien este método funciona bien para analizar déficits motores en ratones¹⁴, las especificaciones del sistema de marcha de imágenes FTIR para acomodar el tamaño y el peso de las ratas anteriormente no estaban disponibles de manera no comercial. Aquí explicamos cómo construir el RatWalker, un sistema de imágenes de marcha FTIR modificado modelado a partir del MouseWalker¹⁴, excepto adaptado para el tamaño y peso de las ratas. Este sistema utiliza un efecto óptico, FTIR, para proporcionar un método para visualizar y posteriormente registrar huellas de animales para su análisis. El contacto del pie de un animal con la guía de onda óptica (plataforma) causa una interrupción en la trayectoria de la luz, lo que resulta en un efecto de dispersión visible, que se captura utilizando videografía de alta velocidad de grado doméstico y procesamiento utilizando software de código abierto. Este estudio demuestra el poder de las imágenes FTIR en el estudio de los cambios en la marcha en modelos genéticos de ratas de EP. Por ejemplo, mientras que los cambios motores evidentes visualmente evidentes (es decir, el arrastre de las extremidades posteriores) se observan en ratas DKO macho a los 4 meses como muy pronto, utilizando FTIR podemos descubrir anomalías en la puerta en ratas DKO macho a los 2 meses de edad.

Protocolo

Todos los estudios en animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Centro Médico de la Universidad de Nebraska (IACUC).

1. Aparatos de marcha

NOTA: Modelado a partir del MouseWalker¹⁴, el RatWalker fue diseñado con dimensiones proporcionales a la diferencia en la longitud del paso entre ratas y ratones. Consiste en una retroiluminación de iluminación lateral, recinto de pasarela, pasarela de guía de onda óptica, espejo y cámara (Figura S1). Se utilizaron tiras de LED, orientadas en una posición escalonada, a cada lado de la pasarela y guías de onda de retroiluminación para acomodar el material adicional. Los materiales necesarios para construir el aparato de marcha modificado se pueden encontrar en la Tabla S1.

1. Utilice una luz de fondo (Figura S2) para crear una silueta del animal que es utilizada por el software para asignar posición, dirección de movimiento y cualidades morfométricas. La construcción se compone de un panel en capas de un difusor de acrílico, guía de onda óptica, reflector y tiras de luz LED ensambladas dentro de un marco de aluminio estándar (Tabla S1).
2. Use un recinto de pasarela (Figura S3) para guiar al animal a lo largo de la plataforma y dirigir al animal a la jaula doméstica. La construcción consiste en láminas acrílicas transparentes soldadas con disolvente con diclorometano (Tabla S2).
3. Utilice la pasarela (Figura S4) para proporcionar el medio para generar huellas iluminadas. La pasarela está construida de acrílico transparente, que está iluminado lateralmente con tiras de LED y alojado en ángulo de aluminio (Tabla S3).
4. Coloque un espejo (Figura S5) directamente debajo de la pasarela en un ángulo de 45 grados para reflejar la parte inferior de la pasarela para la videografía. Está construido a partir de un espejo de vidrio de 1/4 "de espesor sostenido por acrílico y soportes en ángulo dispuestos en una fila (Tabla S4).
5. Realice videografía con una cámara de acción de alta velocidad montada en trípode, de calidad doméstica.

2. Configuración del equipo

1. Alinee la luz de fondo, la pasarela y el espejo de acuerdo con la Figura S1, encima de una encimera, un banco de trabajo o un carro estable. Asegúrese de que cada componente esté centrado con respecto a la pasarela.
2. Usando un nivel, asegúrese de que los componentes estén horizontalmente plomados.
3. Coloque el recinto de la pasarela en la parte superior de la pasarela.
4. Limpie todas las áreas de superficie de contacto con etanol al 70%. Asegúrese de usar una toalla no abrasiva para evitar arañazos en la pasarela.
5. Monte la cámara de alta velocidad en un trípode de 57 pulgadas y colóquela a mitad de la línea del espejo, lo suficientemente espaciada como para capturar toda la pasarela dentro del campo de visión. En el menú de configuración de vídeo, asegúrese de que la cámara de alta velocidad esté configurada en modo de adquisición lineal en modo 1080p a 120 fotogramas por segundo (fps) con cualquier tipo de ajuste automático u optimizaciones desactivadas.
6. Enchufe y encienda las tiras de luces LED para la luz de fondo y la pasarela. Puede ser necesario atenuar la luz de fondo para reducir la captura de fondo.

3. Aclimatación animal

NOTA: Una semana antes del primer experimento, pase a los animales a través del aparato de marcha modificado.

1. Coloque una jaula casera en el extremo de la pasarela.
2. Con el recinto instalado y las luces apagadas, coloque la rata al final de la pasarela frente a la jaula de la casa y permítale caminar por la pasarela de manera no forzada.
3. Pase a cada rata a través del aparato de marcha modificado varias veces, hasta que puedan cruzar suavemente toda la pasarela.
4. Repita el proceso dos días antes del experimento.

4. Procedimiento de la marcha

1. Coloque una jaula casera al final de la pasarela antes del inicio de cada carrera para que sirva como una señal positiva para que la rata atraviese la pasarela.
2. Apague las luces de la habitación, encienda la cámara y comience a grabar varios segundos antes de colocar la rata en la plataforma.
   NOTA: Asegúrese de utilizar una tarjeta de memoria recomendada oficialmente por el fabricante de la cámara. Una tarjeta de memoria no listada puede seguir funcionando, pero no se garantiza que capture a la supuesta velocidad de fotogramas.
3. Con el recinto instalado, coloque la rata al final de la pasarela opuesta a la jaula doméstica y permítale caminar por la pasarela de manera no forzada.
4. Deje de grabar una vez que el animal llegue al término de la pasarela.
5. Limpie la pasarela con etanol al 70% y una toalla no abrasiva entre carreras y después de que un animal orine o defeque, luego permita que el etanol se evapore antes de introducir otro animal.
6. Pase a las ratas por la pasarela un total de 7 veces durante cada período de observación, tomando las primeras tres carreras que puntúan como pasantes para el análisis.
7. Anota una carrera como pasajera si el animal da cuatro o más pasos consecutivos en dirección a la jaula doméstica sin interrupción debido al aseo, pausa o movimientos errantes.
   NOTA: Es una buena práctica registrar la masa de los animales antes de cada ronda de medidas. Para nuestro estudio, WT (n = 7) y DKO (n = 8) pesaron 200,3 ± 21,67 g y 296,6 ± 3,85 g, respectivamente (p = 0,004, prueba t no pareada con corrección de Welch). No vemos un problema con ratas de cualquier edad o tamaño.

5. Preprocesamiento de video

NOTA: Los videos capturados por la cámara de alta velocidad se renderizan en formato mp4 a 120 fps y una resolución de 1080p. Para aliviar la carga del software analítico aguas abajo, primero recorte el metraje innecesario y elimine el audio de cada video utilizando el software LosslessCut (versión 3.23.7, https://github.com/mifi/lossless-cut), luego convierta el flujo de video mp4 en una secuencia de imágenes png utilizando el software de código abierto FFmpeg (versión 4.2, http://ffmpeg.org/). Nota: se pueden utilizar otros formatos sin pérdida como tiff en lugar de png.

1. Cree un directorio para los vídeos en un equipo con Windows 7 o superior y, a continuación, transfiera los vídeos desde el dispositivo de almacenamiento de la cámara de alta velocidad al directorio recién creado. Además, copie ffmpeg.exe en la misma ubicación.
2. En LosslessCut, arrastre los videos a la interfaz para abrirlos. Descarte el audio, establezca los puntos de corte inicial y final para incluir solo la parte analíticamente relevante del video, establezca el formato de fotograma de captura en png y exporte. Una vez exportado el vídeo, cambie el nombre del archivo de vídeo utilizando cualquier convención de nomenclatura seguida de "_trimmed".
3. Para convertir por lotes los videos en secuencias de imágenes, abra un símbolo del sistema, establezca el directorio de trabajo en la ubicación de los videos con "cd [ruta al directorio]" y ejecute los siguientes comandos:
   for %i in (*) do mkdir "%~ni_cropped"
   for %i in (*) do mkdir "%~ni_trimmed"
   for /f "tokens=1 delims=." %a in ('dir /B *_trimmed. MP4') do ffmpeg -i "%a.MP4" "%a/%a_%04d.png"
4. Una vez completado el proceso por lotes, abra cada secuencia de imágenes en ImageJ Fiji²³ y recorte la secuencia a la región de interés (ROI) que abarca el área del piso dentro de la cual se observa la rata.
5. Para reducir el fondo de la iluminación de la pasarela, aumente el balance de color mínimo del canal cian a 76.
6. Guarde como secuencia de imágenes y cambie el sufijo "_trimmed" a "_cropped", guardando los archivos en su respectiva carpeta "_cropped".

6. Procesamiento de la marcha

NOTA: Los datos de la marcha se procesan y cuantifican utilizando el software de libre acceso, MouseWalker (http://biooptics.markalab.org/MouseWalker/)¹⁴.

1. Descomprima e instale el software MouseWalker en un PC que ejecute un entorno Windows de 64 bits con Microsoft Excel instalado.
2. Después de iniciar MouseWalker.exe, realice una calibración de escala inicial para cada conjunto de ejecuciones. Cargue una secuencia de imágenes y, utilizando puntos de referencia o una regla capturada en el video, mida dos puntos de distancia conocida. Calcule el número de píxeles por centímetro en el fotograma de vídeo e introduzca este valor en la sección de parámetros del formulario de configuración junto con la velocidad de fotogramas de adquisición de vídeo.
3. Del mismo modo, mida la cabeza, la cola y los pies de la rata para determinar la longitud de la cabeza, el ancho y el área máximos de la cola, el área mínima y máxima del pie y otras características necesarias para completar la sección de parámetros de seguimiento del formulario de configuración de MouseWalker. Consulte http://biooptics.markalab.org/MouseWalker/ para obtener el manual del usuario y otra documentación.
4. Para obtener los valores del área corporal, abra la misma secuencia de imagen en ImageJ, dibuje una selección que describa la rata y realice un recuento de píxeles de región de interés (ROI).
5. Parámetros y ajustes utilizados para esta publicación (Figura S6).
   NOTA: Los parámetros se proporcionan a título ilustrativo y dependen de la escala del vídeo, el hardware de adquisición y las condiciones. Se requiere calibración y ajuste del software cada vez que se reposiciona la cámara o el equipo. La captura de un dispositivo de medición dentro de la adquisición mejora la precisión y facilita la calibración.
6. Después de la calibración, cargue cada secuencia de imágenes. Al seleccionar auto se iniciará la asignación autónoma de huellas.
7. Desplácese por cada fotograma de la secuencia, corrigiendo manualmente las huellas asignadas erróneamente. Guarde una vez completado este paso.
8. Por último, seleccione evaluar para procesar la posición de la huella y los datos de presión. Una serie de gráficos, imágenes y una hoja de cálculo con métricas cuantitativas de la marcha se exportarán a una carpeta de resultados.

7. Análisis de datos

1. Utilice la hoja de cálculo exportada al final de cada evaluación que contiene datos cuantitativos de la marcha para cada carrera. Concatenar datos de cada corrida y promedio por rata. Trazar los datos medios y probar la significancia utilizando GraphPad Prism versión 7.0a.

Resultados

Mantenimiento de colonias de ratas
La generación y caracterización de ratas KO individuales Pink1 y Parkin ha sido descrita previamente²². Las ratas KO individuales Pink1 y Parkin se obtuvieron de SAGE Labs (y ahora están disponibles en Envigo). Las ratas DKO se generaron cruzando ratas Pink1-/- con ratas Parkin-/- para obtener ratas Pink1+/-/Parkin+/-, que se cruzaron para obtener ratas Pink1-/-/Parkin-^<...

Discusión

Las alteraciones de la marcha, incluyendo disminución del balanceo del brazo, velocidad de marcha más lenta y pasos más cortos, son una característica definitoria de la EP y ocurren temprano durante el curso de la enfermedad ^1,5. A lo largo de los años se han desarrollado varios métodos para observar y registrar pisadas para el análisis de la marcha en modelos de EP con roedores, con técnicas manuales para cuantificar la posición de pisada que conducen a...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminum
1.5” Aluminum Angle (1/8” - 6063)			Dimensions: 8' Qty: 8
1” Aluminum Square Tube (1/16” - 6063)			Dimensions: 8' Qty: 4
32 Gauge Aluminum Sheet			Dimensions: 10' Qty: 1
1” Aluminum Tube (1/8” - 6063)			Dimensions: 8' Qty: 1
Acrylic
7/32” Clear Acrylic Sheet			Dimensions: 4'x8' Qty: 2
1/8” White Acrylic Sheet 55% (2447)			Dimensions: 4'x8' Qty: 1
Mirror
7/32” Glass Mirror			Dimensions: 60"x12" Qty: 1
LED
5050 LED Tape Light (Green)			Dimensions: 16.4' Qty: 1
5050 LED Tape Light (Red)			Dimensions: 16.4' Qty: 1
Camera
GoPro Hero 6 Black			Qty: 1
Tripod			Dimensions: 57" Qty: 1