Применение системы RatWalker для анализа походки в генетической крысиной модели болезни Паркинсона

Резюме

Здесь мы описываем систему RatWalker, построенную путем перепроектирования аппарата MouseWalker для размещения увеличенных размеров и веса крыс. Эта система использует разочарованное полное внутреннее отражение (FTIR), высокоскоростной захват видео и программное обеспечение для анализа с открытым доступом для отслеживания и количественной оценки параметров походки.

Аннотация

Болезнь Паркинсона (БП) является прогрессирующим нейродегенеративным расстройством, вызванным потерей дофаминергических (DA) нейронов в черной субстанции pars compacta. Аномалии походки, в том числе уменьшение раскачивания рук, более медленная скорость ходьбы и более короткие шаги, распространены у пациентов с БП и появляются на ранней стадии заболевания. Таким образом, количественная оценка двигательных паттернов на животных моделях БП будет иметь важное значение для фенотипической характеристики во время течения заболевания и при терапевтическом лечении. Большинство случаев БП являются идиопатическими; однако идентификация наследственных форм БП выявила генные мутации и варианты, такие как мутации потери функции в Pink1 и Parkin, двух белках, участвующих в контроле качества митохондрий, которые могут быть использованы для создания животных моделей. В то время как мыши устойчивы к нейродегенерации при потере Pink1 и Parkin (одиночная и комбинированная делеция), у крыс дефицит Pink1, но не Parkin, приводит к потере нейронов NIGRAL DA и двигательным нарушениям. Здесь мы сообщаем о полезности FTIR-визуализации для выявления изменений походки у свободно идущих молодых (в возрасте 2 месяцев) самцов крыс с комбинированной потерей Pink1 и Parkin до развития грубой визуально видимой двигательной аномалии по мере старения этих крыс (наблюдаемой в 4-6 месяцев), характеризующейся перетаскиванием задних конечностей, как ранее сообщалось у нокаутирующих крыс Pink1 (KO).

Введение

БП, наиболее распространенное возрастное нейродегенеративное двигательное расстройство, вызвано потерей нейронов DA в черной субстанции pars compacta. Эта потеря нигральных нейронов DA и входов DA в полосатое тело приводит к наблюдаемым нарушениям двигательной функции, наблюдаемым у пациентов с PD ^1,2. Определяющие двигательные характеристики пациентов с БП, известные как паркинсонизм, включают ригидность, тремор покоя, брадикинезию, постуральную нестабильность и микрографию³. Кроме того, нарушения походки, которые часто встречаются у больных БП, появляются в начале течения заболевания ^1,4,5. В то время как определенные образы жизни предлагаются, чтобы помочь замедлить прогрессирование БП, такие как здоровое питание и регулярные физические упражнения, в настоящее время нет лекарства от БП, только лекарства для управления симптомами. Это оставляет место для необходимости дальнейшего исследования в надежде на улучшение терапии. Таким образом, характеристика характера походки на животных моделях БП является важным инструментом для характеристики актуальности модели, а также того, как терапевтические методы лечения, направленные на контроль БП, предотвращают или улучшают двигательные нарушения.

Существуют различные модели БП на животных, которые использовались для тестирования терапевтического лечения, однако каждая из них имеет свои ограничения. Например, животные модели, обработанные нейротоксином 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридином (MPTP), дали большое количество информации о процессах, важных для потери нейронов NIGRAL DA и последующих стриатальных адаптаций, и указали на роль митохондрий в патогенезе БП; однако патогенетический фон модели MPTP имеет токсическую природу, а не нейродегенеративный процесс, как у человека PD⁶. Дополнительные химически индуцируемые модели включают 6-гидроксидофамин (6-OHDA) и ротенон. 6-OHDA был первым агентом, используемым для индуцирования БП путем селективного накопления препарата в нейронах DA, что в конечном итоге убивает нейроны и приводит к симптомам, подобным БП. Эта модель была впервые использована для отслеживания истощения DA путем изучения поведения в ответ на амфетамин и апоморфин⁷. Этот метод индукции БП оказался полезным для скрининга фармакологических агентов, воздействующих на ДА и его рецепторы⁸. Хотя модель 6-OHDA является отличной моделью для отслеживания количественного моторного дефицита, эта модель не показывает, как постепенная потеря нейронов и образование тел Леви влияют на животное. Было показано, что другой метод индукции, ротенон, имеет прогрессирующую дегенерацию нигростриатальных нейронов с потерей тирозингидроксилазы и транспортера DA, что позволяет лучше отслеживать потерю нейронов с течением времени⁹. Крысы, обработанные ротеноном, показали брадикинезию, постуральную нестабильность и неустойчивую походку¹⁰. Тем не менее, было обнаружено, что этот метод широко варьируется между различными штаммами крыс, что вызвало сомнения в том, является ли ротенон надежной моделью PD 11,12,13. В то время как было показано, что на анализ походки влияет индукция БП у крыс, на сегодняшний день генетически индуцированные модели крыс бП не были легко использованы для анализа походки при свободном хождении по взлетно-посадочной полосе.

Одним из способов анализа двигательных нарушений у свободно ходячих грызунов является кинематический анализ походки, который может быть выполнен с использованием FTIR-визуализации. Этот установленный метод использует оптический сенсорный датчик на основе FTIR, который записывает и отслеживает следы грызунов, когда они движутся по взлетно-посадочной полосе 14,15,16. По сравнению с другими методами, FTIR не зависит от каких-либо маркеров на теле животного, которые могли бы помешать отпечаткам лап. Генерация видеоданных производит цифровые отпечатки лап всех четырех конечностей, которые могут быть объединены для создания динамического и воспроизводимого рисунка ходьбы для различных моделей грызунов. Принцип анализа походки на основе визуализации заключается в том, чтобы взять каждую отдельную лапу и измерить область контакта с течением времени, когда грызун идет по взлетно-посадочной полосе. Каждая стойка представлена увеличением площади лап (в фазе торможения) и уменьшением площади лапы (в фазе движения). Это происходит за счет фазы свинга, когда сигнал лапы не обнаружен. После оценки видео генерируется несколько параметров, которые можно использовать для сравнения модели дикого типа (WT) и PD. Некоторыми примерами параметров являются длина шага (расстояние, которое лапа преодолевает за один шаг), продолжительность качелей (продолжительность времени, в течение которого лапа не соприкасается с взлетно-посадочной полосой), скорость свинга (длина шага в зависимости от длительности качелей) и схема шага (диагональные шаги, боковые шаги или шаги пояса).

Чтобы продемонстрировать полезность FTIR для выявления ранних изменений характера походки у крыс, мы использовали генетическую крысиную модель БП. В то время как большинство случаев БП являются идиопатическими; идентификация наследственных форм БП выявила генные мутации и варианты, такие как мутации потери функции в Pink1 и Parkin, двух белках, участвующих в контроле качества митохондрий¹⁷, которые могут быть использованы для создания животных моделей¹⁸. К сожалению, мыши устойчивы к нейродегенерации при потере этих белков (одиночных и комбинированных)19,20,21. У крыс дефицит Pink1, но не Parkin, приводит к потере нейронов NIGRAL DA и^{двигательным нарушениям 22}, но без полной пенетрации. Поэтому мы создали комбинированную модель крыс с двойным нокаутом Pink1 / Parkin (DKO), которая отображает явный визуально видимый фенотип перетаскивания задних конечностей, зарегистрированный у самцов крыс Pink1 KO²², но теперь с более высокой скоростью: 100% против 30-50% самцов в возрасте от 4 до 6 месяцев.

Хотя этот метод хорошо работает для анализа двигательного дефицита у мышей¹⁴, спецификации системы FTIR-визуализации походки для учета размера и веса крыс ранее были недоступны некоммерчески. Здесь мы объясняем, как построить RatWalker, модифицированную систему визуализации походки FTIR, смоделированную по образцу MouseWalker¹⁴, за исключением адаптированной для размера и веса крыс. Эта система использует оптический эффект, FTIR, чтобы обеспечить метод визуализации и последующей записи следов животных для анализа. Контакт ноги животного с оптическим волноводом (платформой) вызывает нарушение светового пути, что приводит к видимому эффекту рассеяния, который фиксируется с помощью высокоскоростной видеосъемки и обработки с использованием программного обеспечения с открытым исходным кодом. Это исследование демонстрирует силу FTIR-визуализации в изучении изменений походки в генетических моделях БП у крыс. Например, в то время как явные визуально видимые двигательные изменения (т.е. волочение задними конечностями) наблюдаются у самцов крыс DKO не ранее 4 месяцев, с помощью FTIR мы можем обнаружить аномалии ворот у самцов крыс DKO в возрасте 2 месяцев.

протокол

Все исследования на животных были одобрены Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Медицинского центра Университета Небраски (IACUC).

1. Походка аппарата

ПРИМЕЧАНИЕ: Смоделированный на основе MouseWalker¹⁴, RatWalker был разработан с размерами, пропорциональными разнице в длине шага между крысами и мышами. Он состоит из подсветки боковой подсветки, корпуса дорожки, оптической волноводной дорожки, зеркала и камеры (рисунок S1). Светодиодные ленты, ориентированные в шахматном порядке, использовались с каждой стороны дорожки и волноводы подсветки для размещения дополнительного материала. Материалы, необходимые для создания модифицированного аппарата походки, можно найти в таблице S1.

1. Используйте подсветку (рисунок S2) для создания силуэта животного, который используется программным обеспечением для определения положения, направления движения и морфометрических качеств. Конструкция состоит из слоистой панели акрилового диффузора, оптического волновода, рефлектора и светодиодных лент, собранных в стандартной алюминиевой раме (таблица S1).
2. Используйте вольер (рисунок S3), чтобы направить животное вдоль платформы и направить животное в домашнюю клетку. Конструкция состоит из прозрачных акриловых листов растворителем, сваренных дихлорметаном (таблица S2).
3. Используйте дорожку (рисунок S4), чтобы предоставить среду для создания освещенных следов. Дорожка построена из прозрачного акрила, который боковой освещен ленточными светодиодами и размещен под алюминиевым углом (таблица S3).
4. Поместите зеркало (рисунок S5) непосредственно под дорожкой под углом 45 градусов, чтобы отразить нижнюю сторону дорожки для видеосъемки. Он построен из стеклянного зеркала толщиной 1/4 дюйма, поддерживаемого акрилом, и угловых кронштейнов, расположенных в ряд (таблица S4).
5. Выполняйте видеографию с помощью высокоскоростной экшн-камеры, установленной на штативе, отечественного качества.

2. Настройка оборудования

1. Выровняйте подсветку, дорожку и зеркало в соответствии с рисунком S1 поверх столешницы, верстака или конюшневой тележки. Убедитесь, что каждый компонент центрирован по отношению к дорожке.
2. Используя уровень, убедитесь, что компоненты расположены горизонтально отвесом.
3. Поместите ограждение дорожки поверх дорожки.
4. Очистите все контактные поверхности 70% этанолом. Обязательно используйте неабразивное полотенце, чтобы предотвратить царапины на дорожке.
5. Установите высокоскоростную камеру на 57-дюймовый штатив и поместите ее посередине к зеркалу, расположенному достаточно далеко, чтобы захватить всю дорожку внутри поля зрения. В меню настроек видео убедитесь, что высокоскоростная камера настроена на линейную съемку в режиме 1080p со скоростью 120 кадров в секунду (fps) с выключенным любым типом автоматической настройки или оптимизации.
6. Подключите и включите светодиодные ленты для подсветки и дорожки. Возможно, потребуется затемнить подсветку, чтобы уменьшить захват фона.

3. Акклиматизация животных

ПРИМЕЧАНИЕ: За неделю до первого эксперимента пропустите животных через модифицированный аппарат походки.

1. Расположите домашнюю клетку на конечной точке дорожки.
2. Установив вольер и выключив свет, поместите крысу в конце дорожки напротив домашней клетки и позвольте ей ходить по дорожке непринужденным образом.
3. Пропустите каждую крысу через модифицированный аппарат походки несколько раз, пока они не смогут плавно пересечь всю дорожку.
4. Повторите процесс за два дня до эксперимента.

4. Процедура походки

1. Поместите домашнюю клетку в конце дорожки перед началом каждого пробега, чтобы служить положительным сигналом для крысы, чтобы пересечь дорожку.
2. Выключите свет в комнате, включите камеру и начните запись за несколько секунд до того, как крыса будет помещена на платформу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно используйте карту памяти, которая официально рекомендована производителем камеры. Незарегистрированная карта памяти может по-прежнему работать, но не гарантируется захват с предполагаемой частотой кадров.
3. Установив вольер, поместите крысу в конце дорожки напротив домашней клетки и позвольте ей ходить по дорожке невынужденным образом.
4. Прекратите запись, как только животное достигнет конечной точки дорожки.
5. Очистите дорожку, используя 70% этанола и неабразивное полотенце между пробежками и после того, как животное помочится или испражняется, затем дайте этанолу испариться перед введением другого животного.
6. Пропустите крыс через дорожку в общей сложности 7 раз в течение каждого периода наблюдения, принимая первые три пробега, которые оцениваются, как проходящие для анализа.
7. Оцените пробежку как проходную, если животное делает четыре или более последовательных шага в направлении домашней клетки без перерыва из-за груминга, паузы или ошибочных движений.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хорошей практикой является регистрация массы животных перед каждым раундом мер. Для нашего исследования WT (n = 7) и DKO (n = 8) весили 200,3 ± 21,67 г и 296,6 ± 3,85 г соответственно (p = 0,004, непарный t-тест с поправкой Уэлча). Мы не видим проблемы с крысами любого возраста или размера.

5. Предварительная обработка видео

ПРИМЕЧАНИЕ: Видео, снятые высокоскоростной камерой, визуализируются в формате mp4 со скоростью 120 кадров в секунду и разрешением 1080p. Чтобы облегчить нагрузку на аналитическое программное обеспечение, сначала обрежьте ненужные кадры и удалите аудио из каждого видео с помощью программного обеспечения LosslessCut (версия 3.23.7, https://github.com/mifi/lossless-cut), а затем преобразуйте видеопоток mp4 в последовательность изображений png с помощью программного обеспечения с открытым исходным кодом FFmpeg (версия 4.2, http://ffmpeg.org/). Примечание: другие форматы Lossless, такие как tiff, могут быть использованы вместо png.

1. Создайте каталог для видео на компьютере под управлением Windows 7 или более поздней версии, а затем перенесите видео с запоминающего устройства высокоскоростной камеры во вновь созданный каталог. Кроме того, скопируйте ffmpeg.exe в то же место.
2. В LosslessCut перетащите видео в интерфейс, чтобы открыть. Отбросьте аудио, установите начальную и конечную точки вырезания, чтобы включить только аналитически значимую часть видео, установите формат кадра захвата png и экспортируйте. После экспорта видео переименуйте видеофайл, используя любое соглашение об именовании, за которым следует «_trimmed».
3. Чтобы пакетно преобразовать видео в последовательности изображений, откройте командную строку, задайте в рабочем каталоге расположение видео с помощью «cd [путь к каталогу]» и выполните следующие команды:
   для %i в (*) do mkdir "%~ni_cropped"
   для %i в (*) do mkdir "%~ni_trimmed"
   для /f "tokens=1 delims=." %a in ('dir /B *_trimmed. MP4') do ffmpeg -i "%a.MP4" "%a/%a_%04d.png"
4. После завершения пакетного процесса откройте каждую последовательность изображений в ImageJ Fiji²³ и обрежьте последовательность в интересующую область (ROI), охватывающую область пола, в которой наблюдается крыса.
5. Чтобы уменьшить фон от освещения дорожки, увеличьте минимальный цветовой баланс голубого канала до 76.
6. Сохраните как последовательность изображений и измените суффикс «_trimmed» на «_cropped», сохранив файлы в соответствующей папке «_cropped».

6. Обработка походки

ПРИМЕЧАНИЕ: Данные походки обрабатываются и количественно оцениваются с помощью свободно доступного программного обеспечения MouseWalker (http://biooptics.markalab.org/MouseWalker/)¹⁴.

1. Распакуйте и установите программное обеспечение MouseWalker на компьютер под управлением 64-разрядной среды Windows с установленным Microsoft Excel.
2. После запуска MouseWalker.exe выполните начальную калибровку шкалы для каждого набора запусков. Загрузите последовательность изображений и с помощью ориентиров или линейки, запечатленной в видео, измерьте две точки известного расстояния. Рассчитайте количество пикселей на сантиметр в видеокадре и введите это значение в раздел параметров формы настроек вместе с частотой кадров получения видео.
3. Аналогичным образом, измерьте голову, хвост и ноги крысы, чтобы определить длину головы, максимальную ширину и площадь хвоста, минимальную и максимальную площадь стопы и другие функции, необходимые для завершения раздела параметров отслеживания формы настроек MouseWalker. Смотрите http://biooptics.markalab.org/MouseWalker/ руководство пользователя и другую документацию.
4. Чтобы получить значения области тела, откройте ту же последовательность изображений в ImageJ, нарисуйте выделение, описывающее крысу, и выполните подсчет пикселей интересующей области (ROI).
5. Параметры и настройки, используемые для этой публикации (рисунок S6).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры приведены для иллюстрации и зависят от масштаба видео, оборудования для сбора и условий. Калибровка и настройка программного обеспечения требуется каждый раз при перемещении камеры или оборудования. Захват измерительного устройства в пределах сбора повышает точность и облегчает калибровку.
6. После калибровки загрузите каждую последовательность изображений. При выборе авто начнется автономное назначение следов.
7. Прокрутите каждый кадр последовательности, вручную исправляя пропущенные следы. Сохраните после завершения этого шага.
8. Наконец, выберите evaluate для обработки данных о положении занимаемой площади и давлении. Серия графиков, изображений и электронная таблица с количественными метриками походки будут экспортированы в папку результатов.

7. Анализ данных

1. Используйте электронную таблицу, экспортированную в конце каждой оценки, которая содержит количественные данные походки для каждого прогона. Объединяйте данные из каждого пробега и среднее значение на крысу. Построение средних данных и проверка значимости с помощью GraphPad Prism версии 7.0a.

Результаты

Содержание крысиной колонии
Поколение и характеристика одиночных крыс Пинк1 и Паркина были описаны ранее²². Одиночные крысы Pink1 и Parkin были получены из SAGE Labs (и теперь доступны от Envigo). Крысы DKO были получены путем скрещивания крыс Pink1^-/- с крыс?...

Обсуждение

Нарушения походки, включая уменьшение раскачивания рук, более медленную скорость ходьбы и более короткие шаги, являются определяющей чертой БП и возникают на ранней стадии заболевания ^1,5. За прошедшие годы было разработано несколько методов для наблюде?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminum
1.5” Aluminum Angle (1/8” - 6063)			Dimensions: 8' Qty: 8
1” Aluminum Square Tube (1/16” - 6063)			Dimensions: 8' Qty: 4
32 Gauge Aluminum Sheet			Dimensions: 10' Qty: 1
1” Aluminum Tube (1/8” - 6063)			Dimensions: 8' Qty: 1
Acrylic
7/32” Clear Acrylic Sheet			Dimensions: 4'x8' Qty: 2
1/8” White Acrylic Sheet 55% (2447)			Dimensions: 4'x8' Qty: 1
Mirror
7/32” Glass Mirror			Dimensions: 60"x12" Qty: 1
LED
5050 LED Tape Light (Green)			Dimensions: 16.4' Qty: 1
5050 LED Tape Light (Red)			Dimensions: 16.4' Qty: 1
Camera
GoPro Hero 6 Black			Qty: 1
Tripod			Dimensions: 57" Qty: 1