评估穆林伤口的生物膜分散

摘要

在这里，我们描述了 前活体 和 体内 方法，以评估细菌分散从伤口感染在小鼠。该协议可用于测试局部抗菌和抗生物膜疗法的疗效，或评估不同细菌菌株或物种的分散能力。

摘要

生物膜相关感染与各种慢性疾病有关，如非愈合性糖尿病足溃疡、慢性鼻窦炎、复发性中耳炎介质等。这些感染中的微生物细胞受细胞外聚合物（EPS）的保护，它可以防止抗生素和宿主免疫细胞清除感染。为了克服这一障碍，研究人员已经开始开发分散剂作为潜在的治疗方法。这些制剂针对生物膜EPS中的各种成分，削弱结构，并启动细菌的分散，从理论上讲，这可以提高抗生素的效力和免疫清除。为了确定分散剂对伤口感染的疗效，我们制定了测量前 活体 和 体内生物膜分散的方案。我们使用鼠标手术切除模型，该模型已被很好地描述，以创建生物膜相关的慢性伤口感染。为了监测 体内的分散，我们用表达红十字路西法酶的细菌菌株感染伤口。一旦成熟感染已经确定，我们灌溉伤口的溶液含有酶，降解生物膜EPS的成分。然后，我们监测伤口和过滤器官中发光信号的位置和强度，以提供有关达到的分散水平的信息。对于生物膜分散的 活体 分析，受感染的伤口组织被淹没在生物膜降解酶溶液中，之后对组织中剩余的细菌负荷与溶液中的细菌负荷进行评估。这两种协议都有优点和缺点，可以优化，以帮助准确确定分散治疗的功效。

引言

全世界抗生素耐药性上升，导致缺乏抗生素治疗各种^{细菌感染的选择}。除了抗生素耐药性外，细菌还可以通过采用与生物膜相关的生活方式²获得抗生素耐受性。生物膜是由多糖、细胞外DNA、脂质和蛋白质³的基质保护的微生物群落，统称为细胞外聚合物（EPS）。随着抗生素耐药性危机的继续，迫切需要延长抗生素使用或提高抗生素疗效的新战略。反生物膜制剂是一个有前途的解决方案^4。

在已提出的不同反生物膜策略中，针对生物膜EPS不同成分的分散剂的利用处于^{治疗开发的}前沿。糖苷水解（GH）是此类分散剂之一。GH 是一大类酶，它催化多糖内部不同键的，为 EPS 提供结构完整性。我们的小组，以及其他人，已经表明，GH可以有效地降解生物膜，诱导分散和提高抗生素疗效的一些不同的细菌物种，无论是体外和体内^{6，7，8，9，10，11。}

随着人们对生物膜分散性的兴趣日益浓厚，开发评估分散疗效的有效方法非常重要。在这里，我们提出了一个详细的协议，用于治疗生物膜相关伤口感染与分散剂在小鼠，并评估分散效力， 在体内 和 前活体。总体目标是提供有效的方法，可用于前科模型，以有效和高效地测量生物膜的分散。

在这些研究中使用了一种穆林手术切除感染模型来建立与生物膜相关的感染。我们使用这个模型已超过15年，并广泛发表我们的观察^{7，9，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21。}一般来说，这是一种非致命性感染模式，细菌保持局部化到病床上，并且与生物膜相关（在EPS包围的聚合物中看到的细菌），建立一种持续长达3周的慢性感染。然而，如果小鼠免疫功能低下（例如1型糖尿病），它们可能更容易在这种模式下出现致命的全身感染。

在这份报告中，我们提供了评估细菌从伤口中传播的协议，无论是体内还是前体内。这两种协议都可用于检查分散剂的功效，并有自己的长处和短处。例如，评估体内的分散性可以提供重要的实时信息，说明细菌在分散后扩散到身体其他部位，以及宿主的反应。另一方面，评估分散前活体可能更可取地筛选多种制剂、剂量或配方，因为组织可以分为多个部分，可以单独测试，从而减少所需的小鼠数量。在评估多个制剂时，我们通常测量分散首先体外，如前所述^{的6，9，22。}然后，我们测试最有效的前活体和储备在体内测试为有限的数量非常有前途的代理。

研究方案

该动物协议由得克萨斯理工大学健康科学中心机构动物护理和使用委员会（协议编号07044）审查和批准。这项研究是严格按照《国家卫生研究院实验室动物护理和使用指南》中的建议进行的。

1. 为小鼠感染准备细菌

注:在这里，我们描述感染小鼠只与 伪多莫纳斯阿鲁吉诺萨。然而，其他细菌物种可能被用来引起感染。细菌菌株和材料详见 材料表。

1. 使用伪多莫纳斯阿鲁吉诺萨野生型菌株PAO1携带发光质粒pQF50-lux²³为这些实验，如前所述^7。
2. 在困惑的埃伦迈尔烧瓶中生长 P. aeruginosa 菌株，在 200 rpm 时摇晃，在卢里亚-贝尔塔尼 （LB） 肉汤中以 37 °C 的速度生长 16 至 20 小时。将 100μg/mL 的安非他明最终浓度添加到 PAO1 （pQF50-lux） 的过夜培养中，以维护质粒。
3. 亚文化 P. aeruginosa 将 100 μL 的隔夜文化添加到 Erlenmeyer 烧瓶中，该烧瓶含有 10 毫升 LB 汤，最终浓度为 100 μg/mL 安皮西林。然后在37°C时以37°C的速度生长2-2.5小时，达到_{0.4的OD 600 nm，} 然后连续稀释（1:10），感染剂量约为10⁴ 个细胞。

2. 生物膜分散酶的制备

注意:对于这项研究，我们使用10%的相同部分淀粉酶和细胞酶溶液（各5%）的溶液，这将被称为"GH"，用于分散治疗。

1. 使用10%的GH溶液（w/v）淀粉酶（来自 杆菌亚蒂利斯）和真菌细胞酶（来自 阿斯珀吉卢斯尼格尔）稀释在1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）。使用 PBS 作为车辆控制处理。
2. 将所有治疗加热至 37 °C，30 分钟用于酶激活。

3. 实验动物和术前设置

1. 在环境控制条件下，每笼5只小鼠，有12小时的光/暗循环，并适当获得食物和水。
2. 最好使用8至10周大的瑞士雌性韦伯斯特小鼠。
3. 称量小鼠以确定适当的麻醉量来管理。
4. 通过100毫克/千克氯胺酮10毫克/千克西拉津的腹内注射进行麻醉。
5. 使用棉签小心地将眼霜（例如，刷新 P.M）涂抹在眼睛上，以减少干燥。
6. 在整个手术过程中监测生理参数，包括呼吸速率、肤色和体温。

4. 多萨尔全厚切除手术

1. 通过脚趾捏和呼吸速率和努力监测麻醉手术平面。剃下后表面，涂抹10分钟（或按照产品的说明），然后轻轻取出，确保皮肤干燥。
2. 对于疼痛管理，将0.05毫升的利多卡因皮下注射到要切除的区域，并将0.02毫升丁丙诺啡皮下注射到颈部的擦伤中。等待10分钟，以确保疼痛管理达到。
3. 切除前，使用酒精拭子对背部表面进行消毒，并将直径为 1.5 厘米的圆圈绘制到背部的后部。在整个手术过程中保持无菌手术场，并使用自片仪器和无菌手套。为了限制污染，请用点燃的 Bunsen 燃烧器进行手术，并为每只动物使用清洁工具。
4. 用手术剪刀将全厚、切除的皮肤伤口施用到泛尼库鲁肌肉的水平。
5. 切除后，立即用半可渗透聚氨酯敷料盖住伤口。
6. 在敷料下的100μL PBS中注射约10⁴ 个CFU细菌，在伤口床上，以建立感染。
   注:伤口也可以同时感染多种细菌和/或真菌，或将预先形成的生物膜^12，甚至从患者^身上提取的脱行组织放在伤口床上。
7. 感染后，将老鼠放入笼子里，用加热垫和监测器，直到它们恢复右反射。
   注意:确保老鼠不会感冒，因为这样会导致死亡。
8. 建立48小时的伤口感染。
9. 每天检查粘合敷料是否有眼泪和不粘附的区域，如果需要，请更换。

5. 体内 分散治疗

注:在这里，我们通过应用一系列3个局部伤口灌溉解决方案（图1）来描述分散剂的管理。但是，该协议可以适应其他类型的交付，如应用凝胶，面霜或敷料。

1. 在进行治疗时，将小鼠置于异氟烷麻醉下（每分钟氧气3%和1升）。
2. 准备三个1mL注射器，配25G针，每只小鼠含有200μL的治疗。
3. 通过小心地抬起和用钳子捏紧皮肤，将200μL的酶溶液或PBS控制注射到伤口上，稍微高于伤口，朝向动物头部。小心地将注射器刺穿抬起的皮肤，并慢慢在敷料和伤口床之间注射溶液。本研究中使用的敷料通常粘附在病床和周围组织上。
   1. 为了确保整个病床被溶液覆盖，用钳子轻轻抬起敷料，将其从病床上拉开，同时慢慢注射溶液。
4. 治疗后，将老鼠放回笼子里30分钟。
5. 在接触治疗30分钟后，用异氟兰重新麻醉小鼠，用注射器吸气溶液，确保穿刺在同一区域。
   注意:这种吸气溶液包含分散的细菌细胞，可用于各种下游分析。
6. 以第一种灌溉方法管理第二次和第三次灌溉处理，每次都使用新的注射器。

6. 体内 分散成像和分析

注意:如果利用发光菌株引发感染，则可以使用 Vivo 成像系统 （IVIS） 可视化伤口的分散。

1. 图像小鼠在治疗前后，在10和20小时治疗后（图2和补充图1）。
2. 在小鼠麻醉时进行成像，将它们单独放入 IVIS 中，并在波长为 560 nm 的 5s 中分别成像 5s。保存图像以供进一步分析。
   注:最佳波长和曝光时间将取决于使用的记者以及 IVIS 仪器和成像软件。
3. 要进行分析，请打开 IVIS 软件中的图像，并选择工具调色板中要分析的区域。
4. 为了说明背景，在照片的背景上放置一个圆圈，然后为每只鼠标在伤口床顶部放置相同大小的圆圈。
5. 要上传测量值，请选择 视图 ->感兴趣区域 （ROI） 测量 ，并将测量表上传到电子表格。从每个伤口床测量中减去背景圆读数，以计算每个样本的发光度。计算百分比发光变化:
   治疗前投资回报率-治疗后/治疗前投资回报率）x 100。
   注意:应同时分析控制和处理小鼠，以正常化可能影响图像采集或辐射的变量。

7. 通过确定CFU来评估分散性

1. 通过麻醉下注射0.2mL的五巴比妥钠（如致命加）与100毫克/千克氯胺酮10毫克/千克西拉津，人道地安乐死小鼠。
2. 首先用无菌钳子轻轻取出敷料，然后用无菌手术剪刀在伤口床周围切开伤口床组织。用钳子轻轻抬起伤口床的一端，同时用剪刀将样本从肌肉层中切开/ 挑逗。
3. 将伤口床上的组织置于预标记和预称的 2 mL 均质化管中，其中含有 1 mL 的 PBS。插入样品后再次称重管子，然后轻轻倒置 3-5 次，冲洗掉任何分散或松散粘附的细菌，并去除 PBS。添加1毫升的新鲜PBS。
4. 为了收获脾脏，将小鼠置于超精解剖位置，并将四肢固定在解剖表面，从而固定在安全状态。浸泡用70%乙醇解剖的区域，以消毒该地区，防止毛皮对样品进行污染物。
5. 小心地用手术剪刀在下腹部的真皮上切开一个小切口垂直于中线，确保将皮肤拉起并远离内脏。继续切口内部，沿中线，直到胸骨达到。一旦腹腔暴露，内部器官可见，轻轻地将脾脏从结缔组织中分离出来，并放置在一个单独的同质化管中。
6. 称脾脏和冲洗与PBS，如描述的伤口床组织。
   注:其他感兴趣的器官也可以同样收获。
   1. 在做最初的切口时，注意避免刺穿肠道或其他器官。
7. 使用台面同质化剂在 2 mL 预填充珠磨管中均质样品，在 60 年代以 5 米/s 的速度均质化两次。
8. 要列举 CFU，在选择性 agar 上连续稀释样品和点板。对于串行稀释，将样品的 100 μL 移液器放入 900 μL 的 PBS 中，放入 1.5 mL 管中，涡流并重复 5 次。派佩特 10 μL 的每个稀释到一个阿加板，如 图 3所示。
   注意:如果需要更精确的 CFU 量度，则将样品每次稀释的 100 μL 分布到单独的 agar 板上。

8. 分散的外活体 评估 （图4）

1. 伤口小鼠和感染约10⁴ PAO1如上所述，然后安乐死48小时后感染。
2. 使用无菌技术，小心地用钳子取出敷料，不要打扰病床。
3. 使用无菌手术剪刀将伤口床的周长从未受感染的皮肤上切开，用钳子将伤口床的一端和剪刀抬起来，从下面的肌肉层和周围未受感染的组织中清除受感染的伤口组织。将伤口床样本分成相等的部分或使用整体。
4. 将伤口组织放入空的、预称的 2 mL 珠磨同质管中。然后在添加样品后再次称重管子。计算样本的重量::
   添加样本后的重量-重量后再添加样本。
5. 加入 1 mL 的 PBS，轻轻倒置管 3-5 次，冲洗样品并去除任何浮石细胞。删除并丢弃 PBS。
6. 在样品中加入 1 mL 的 GH 处理（或 PBS 作为负控制），在 37 °C 处孵育 2 小时，在 80 rpm 时摇晃。
7. 取出生物膜分散溶液，放入单独的 1.5 mL 管中。这包含分散的细胞。
8. 将 1 mL 的 PBS 添加到剩余的组织样本中，然后轻轻倒置 3-5 次，以冲洗掉任何剩余的分散细胞。删除并丢弃 PBS。
9. 在剩余组织中加入 1 mL 的 PBS，然后使用台式同质化剂在 5 米/s 下均质化 60s。
10. 通过将 100 μL 的样品放入 1.5 mL 管中的 900 μL PBS 中，并重复 5 次，共稀释 6 次，从而连续稀释分散的细胞和均质组织样本的溶液。
11. 斑板 10 μL 的每个稀释到媒体选择性 agar （例如， 伪多莫纳斯隔离阿加为 P. aeruginosa），并在 37 °C 过夜孵育板。
12. 计算 CFU 并计算"百分比分散"为 （超自然物质中的 CFU/ （超自然物质中的 CFU+ 生物膜组织中的 CFU）） x 100。

结果

在这个实验中，8-10周大的瑞士雌性韦伯斯特小鼠感染了携带发光质粒pQF50-lux的PAO1的10⁴ 个CFU。如上所述，感染允许建立48小时之前，管理3×30分钟的治疗PBS（车辆控制）或10%GH（治疗），以消化生物膜EPS。小鼠在治疗后（0 h）和治疗后10小时和20小时进行成像预处理。 图2A 和 补充图1 显示伤口内已建立的感染，产生明亮的生物发光信号。GH 治疗 （0 h） 后?...

讨论

在这里，我们描述了可用于研究生物膜分散剂功效的协议。这些协议可以很容易地适应使用不同类型的分散剂，细菌物种或前活体样本，包括临床脱尿样本。该协议还提供了一个临床相关的模型，以收集和研究分散的细菌细胞。分散细菌细胞的表型已证明与浮石或生物膜细胞^{5、24、25、26}的表型...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tube	Fisher	14823434	Use to complete serial dilutions of samples
25G 58 in needle	Fisher	14823434	Attaches to 1 mL syringe
Ampicillin Sodium Salt	Fisher	BP1760-5	Make a 50 mg/ mL stock solution and add 100 µL to 10 mL of LB broth for both overnight and subculture
Amylase	MP Biomedicals	2100447	Make a 5% w/v solution, vortex- other dispersal agents can be used
Buprenorphine SR-LAB 5 mL (1 mg/mL)	ZooPharm	RX216118	Use as pain mainagement- may use other options
Cellulase	MP Biomedicals	2150583	Add 5% w/v to the 5% w/v amylase solution, vortex, activate at 37 °C for 30 min- other dispersal agents can be used
Depilatory cream	Walmart	287746	Use a small amount to massage into the hair follicles on the back of the animal and allot 10 min to remove hair
Dressing Forceps, Serrated Tips	Fisher	12-460-536	Can use other forms of forceps
Erlenmeyer flasks baffled 125 mL	Fisher	101406	Use to grow overnights and sub-cultures of bacteria
FastPrep-24 Benchtop Homogenizer	MP Biomedicals	6VFV9	Use 5 m/s for 60 s two times to homogenize tissue
Fatal Plus	Vortech Pharmaceuticals	0298-9373-68	Inject 0.2 mL intraperitaneal for each mouse
Homogenizing tubes (Bead Tube 2 mL 2.4 mm Metal)	Fisher	15340151	Used to homogenize samples for plating
Isoflurane	Diamond Back Drugs
Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution C-IIIN	Sigma Aldrich	K4138	Use as anasethia- other options can also be utilized to gain a surgical field of anasethia
LB broth, Miller	Fisher	BP1426-2	Add 25 g/L and autoclave
Lidocaine 2% Injectable	Diamond Back Drugs	2468	Inject 0.05 mL through the side of the marked wound bed area so it is deposited in the center of the mark. Allot 10 min prior to cutting
Meropenem	Sigma Aldrich	PHR1772-500MG	Make 5 mg/mL to add to the GH solution to apply topically and a 15 mg/mL solution to inject intraperitaneal 4 h prior and 6 h post-treatment
Non-sterile cotton gauze sponges	Fisher	13-761-52	Use to remove the depilatory cream
PAO1 pQF50-lux bacterial strain	Ref [13]	N/A	PAO1 pgF50-lux was used as the P. aeruginosa strain of interest in this paper's representative results
Petri dishes	Fisher	PHR1772-500MG
Phosphate Buffer Saline 10x	Fisher	BP3991	Dilute 10x to 1x prior to use
Polyurethane dressing	Mckesson	66024007	Cut the rounded edge off and cut the remaining square into 4 equal sections
Pseudomonas isolation agar	VWR	90004-394	Add 20 mL/L of glycerol and 45 g/mL to water, autoclave, and pour 20 mL into petri dishes
Refresh P.M.	Walmart		Use on eyes to reduce dryness during procedure.
Sterile Alcohol Prep Pads	Fisher	22-363-750	Use to clean the skin immediately prior to wounding to disinfect the area
Straight Delicate Scissors	Fisher	89515	Can also use curved scissors
Swiss Webster mice	Charles River	551NCISWWEB	Other mice strains can be used
Syring Slip Tip 1 mL	Fisher	14823434	Used to administer drugs and enzyme treatment