Valutazione della dispersione del biofilm nelle ferite murine

Riepilogo

Qui descriviamo metodi ex vivo e in vivo per valutare la dispersione batterica da un'infezione da ferita nei topi. Questo protocollo può essere utilizzato per testare l'efficacia delle terapie topiche antimicrobiche e anti-biofilm, o per valutare la capacità di dispersione di diversi ceppi batterici o specie.

Abstract

Le infezioni correlate al biofilm sono implicate in una vasta gamma di condizioni croniche come ulcere del piede diabetiche non curative, sinusite cronica, media di otite che si verificano e molti altri. Le cellule microbiche all'interno di queste infezioni sono protette da una sostanza polimerica extracellulare (EPS), che può impedire agli antibiotici e alle cellule immunitarie ospiti di eliminare l'infezione. Per superare questo ostacolo, gli investigatori hanno iniziato a sviluppare agenti di dispersione come potenziali terapie. Questi agenti prendono di mira vari componenti all'interno del biofilm EPS, indebolendo la struttura e avviando la dispersione dei batteri, che può teoricamente migliorare la potenza antibiotica e la clearance immunitaria. Per determinare l'efficacia degli agenti di dispersione per le infezioni delle ferite, abbiamo sviluppato protocolli che misurano la dispersione del biofilm sia ex vivo che in vivo. Usiamo un modello di escissione chirurgica del topo che è stato ben descritto per creare infezioni croniche delle ferite associate al biofilm. Per monitorare la dispersione in vivo,infettiamo le ferite con ceppi batterici che esprimono luciferasi. Una volta accertate le infezioni mature, irrigamo le ferite con una soluzione contenente enzimi che degradano i componenti del biofilm EPS. Monitoriamo quindi la posizione e l'intensità del segnale luminescente nella ferita e negli organi filtranti per fornire informazioni sul livello di dispersione raggiunto. Per l'analisi ex vivo della dispersione del biofilm, il tessuto della ferita infetta viene immerso in una soluzione enzimatica degradante per biofilm, dopo di che viene valutata la carica batterica rimanente nel tessuto, rispetto alla carica batterica in soluzione. Entrambi i protocolli hanno punti di forza e di debolezza e possono essere ottimizzati per aiutare a determinare con precisione l'efficacia dei trattamenti di dispersione.

Introduzione

L'aumento della resistenza agli antibiotici in tutto il mondo sta portando alla mancanza di opzioni antibiotiche per trattare una varietà di infezioni batteriche¹. Oltre alla resistenza agli antibiotici, i batteri possono ottenere tolleranza agli antibiotici adottando uno stile di vita associato al biofilm². Un biofilm è una comunità di microrganismi che sono protetti da una matrice di polisaccaridi, DNA extracellulare, lipidi e proteine 3 ,^{collettivamente chiamata}sostanza polimerica extracellulare (EPS). Mentre la crisi di resistenza agli antibiotici continua, sono estremamente necessarie nuove strategie che prolungano l'uso o potenziano l'efficacia degli antibiotici. Gli agenti anti-biofilm sono una soluzione promettente⁴.

Tra le diverse strategie anti-biofilm che sono state proposte, l'utilizzo di agenti di dispersione, che si rivolgono a diversi componenti del biofilm EPS, sono in prima linea nello sviluppo terapeutico⁵. Le idrolasi glicosidi (GH) sono una di queste classi di agente dispersivo. I GH sono una grande classe di enzimi che catalizzano la scissione di diversi legami all'interno dei polisaccaridi che forniscono integrità strutturale all'EPS. Il nostro gruppo, così come altri, hanno dimostrato che gh può degradare efficacemente i biofilm, indurre dispersione e migliorare l'efficacia antibiotica per una serie di diverse specie batteriche, sia in vitro che in vivo^{6,7,8,9,10,11}.

Con un crescente interesse per la dispersione del biofilm, è importante sviluppare metodi efficaci che valutazioneno l'efficacia della dispersione. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per il trattamento delle infezioni della ferita associate al biofilm con un agente di dispersione nei topi e la valutazione dell'efficacia della dispersione, in vivo ed ex vivo. L'obiettivo generale è quello di fornire metodi efficaci che possano essere utilizzati con modelli preclinici per misurare la dispersione del biofilm in modo efficace ed efficiente.

Un modello di infezione da escissione chirurgica murina è stato utilizzato in questi studi per stabilire un'infezione associata al biofilm. Abbiamo utilizzato questo modello per oltre 15 anni e pubblicato ampiamente le nostre osservazioni^{7,9,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21}. In generale, questo è un modello di infezione non letale in cui i batteri rimangono localizzati nel letto della ferita e sono associati al biofilm (batteri visti in aggregati circondati da EPS), creando un'infezione cronica che dura fino a 3 settimane. Tuttavia, se i topi sono immunocompro compromessi (ad esempio con diabete di tipo 1), possono diventare più suscettibili allo sviluppo di un'infezione sistemica fatale in questo modello.

In questa relazione, forniamo protocolli per valutare la dispersione dei batteri da una ferita, sia in vivo che ex vivo. Entrambi i protocolli possono essere utilizzati per esaminare l'efficacia di un agente di dispersione e avere i propri punti di forza e di debolezza. Ad esempio, valutare la dispersione in vivo può fornire informazioni importanti e in tempo reale sulla diffusione dei batteri in altre parti del corpo dopo la dispersione e su come l'ospite risponde. D'altra parte, valutare la dispersione ex vivo può essere più desiderabile per lo screening di più agenti, dosi o formulazioni, in quanto il tessuto può essere diviso in più sezioni che possono essere testate separatamente, riducendo così il numero di topi richiesti. Quando valutiamo più agenti, in genere misuriamo la dispersione prima in vitro come descritto ^{in precedenza 6,9,22}. Testiamo quindi l'ex vivo più efficace e riserviamo test in vivo per un numero limitato di agenti molto promettenti.

Protocollo

Questo protocollo sugli animali è stato esaminato e approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee del Texas Tech University Health Sciences Center (protocollo numero 07044). Questo studio è stato condotto in stretta conformità con le raccomandazioni contenute nella Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio degli Istituti Nazionali di Salute.

1. Preparare i batteri per le infezioni del topo

NOTA: Qui descriviamo infettare i topi solo con Pseudomonas aeruginosa. Tuttavia, altre specie batteriche possono essere utilizzate per causare infezioni. Ceppi e materiali batterici sono dettagliati nella tabella dei materiali.

1. Utilizzare pseudomonas aeruginosa ceppo di tipo selvatico PAO1 che trasporta la luminescenza plasmide pQF50-lux²³ per questi esperimenti come descritto in precedenza⁷.
2. Coltivare ceppi di P. aeruginosa in fiasche Sconcertate di Erlenmeyer, con scuotimento a 200 giri/min, in brodo Luria-Bertani (LB) a 37 °C per 16-20 ore. Aggiungere una concentrazione finale di 100 μg/mL di ampicillina alla coltura notturna di PAO1(pQF50-lux) per il mantenimento del plasmide.
3. Sottocultura P. aeruginosa aggiungendo 100 μL della coltura notturna ad un pallone Erlenmeyer contenente 10 ml di brodo LB con una concentrazione finale di 100 μg/mL di ampicillina. Quindi crescere per 2-2,5 h a 37 °C con scuotimento, a un OD_{600 nm} di 0,4, quindi diluire serialmente (1:10) tre volte per una dose infettante di circa 10⁴ cellule.

2. Preparazione dell'enzima di dispersione del biofilm

NOTA: Per questo studio utilizziamo una soluzione al 10% di amilasi e cellulasi delle parti uguali (5% di ciascuna), che sarà definita "GH", per il trattamento di dispersione.

1. Utilizzare una soluzione di GH al 10% (w/v) di amilasi (da Bacillus subtilis)e cellulasi fungina (da Aspergillus niger)diluita in 1x soluzione salina tampone fosfato (PBS). Utilizzare PBS come trattamento di controllo del veicolo.
2. Riscaldare tutti i trattamenti a 37 °C per 30 minuti per l'attivazione enzimatica.

3. Animali da esperimento e allestimento preoperatorio

1. Topi domestici, 5 cucciolate per gabbia, in condizioni controllate dall'ambiente, con cicli di luce / buio di 12 ore e un corretto accesso a cibo e acqua.
2. Preferibilmente, utilizzare topi Webster svizzeri femminili, di età compresa tra 8 e 10 settimane.
3. Pesare i topi per determinare la giusta quantità di anestesia da somministrare.
4. Somministrare anestesia mediante iniezione intraperitoneale di 100 mg/kg di chetamina 10 mg/kg di xiazina.
5. Applicare con cura la crema per gli occhi (ad esempio, Refresh P.M.) sull'occhio utilizzando un batuffolo di cotone per ridurre la secchezza.
6. Monitorare i parametri fisiologici tra cui la frequenza respiratoria, la colorazione della pelle e la temperatura corporea durante l'intervento chirurgico.

4. Chirurgia dell'escissione dorsale a pieno spessore

1. Valutare il piano chirurgico dell'anestesia con il pizzico e il monitoraggio della frequenza respiratoria e dello sforzo. Radere la superficie dorsale e applicare una crema depilatoria per 10 min (o secondo le istruzioni del prodotto), dopo di che rimuovere delicatamente, assicurandosi che la pelle fosse asciutta.
2. Per la gestione del dolore, somministrare 0,05 mL di lidocaina per via sottocutanea nell'area da asportare e iniettare 0,02 mL di buprenorfina per via sottocutanea nella tracolla del collo. Attendere 10 minuti per assicurarsi che la gestione del dolore sia stata raggiunta.
3. Prima dell'escissione, disinfettare la superficie dorsale usando un tampone alcolico e disegnare un cerchio di 1,5 cm di diametro verso la porzione posteriore della schiena. Mantenere un campo chirurgico sterile durante tutta la procedura e ha utilizzato strumenti autoclavati e guanti sterili. Per limitare la contaminazione, condurre l'intervento chirurgico da un bruciatore Bunsen acceso e utilizzare strumenti puliti per ogni animale.
4. Somministrare una ferita cutanea a pieno spessore e incisionale al livello del muscolo panniculo con forbici chirurgiche.
5. Dopo l'escissione, coprire immediatamente le ferite con una medicazione semipermeabile in poliuretano.
6. Iniettare circa^{10 4} CFU di batteri in 100 μL PBS sotto la medicazione, sul letto della ferita, per stabilire un'infezione.
   NOTA: Le ferite possono anche essere infettate contemporaneamente da più specie di batteri e/o funghi, o posizionando biofilm pre-formati¹², o anche tessuto di debridemento estratto^{dai pazienti 19}, sul letto della ferita.
7. Dopo l'infezione, mettere i topi in gabbia con pastiglie riscaldanti e monitorare fino a quando non hanno riacquistato il loro riflesso di destra.
   NOTA: Assicurarsi che i topi non si raffreddori in quanto ciò può portare alla morte.
8. Stabilire infezioni da ferite per 48 ore.
9. Ispezionare quotidianamente le medicazioni adesive per verificare lacerazioni e aree di non aderenza e sostituirle se necessario.

5. Trattamento di dispersione in vivo

NOTA: Qui descriviamo la somministrazione degli agenti di dispersione applicando una serie di 3 soluzioni di irrigazione a carica topica(Figura 1). Tuttavia, il protocollo può essere adattato per altri tipi di consegna come l'applicazione di gel, creme o condimenti.

1. Posizionare i topi sotto anestesia isoflurana (al 3% e 1 L al minuto di ossigeno) durante la somministrazione dei trattamenti.
2. Preparare tre siringhe da 1 ml, con aghi da 25 G, contenenti 200 μL di trattamento per ogni topo.
3. Iniettare 200 μL di soluzione enzimatica o controllo PBS sulla ferita sollevando e pizzicando con cura la pelle con le forcep, leggermente sopra la ferita verso la testa dell'animale. Perforare con cura la siringa attraverso la pelle sollevata e iniettare lentamente la soluzione tra la medicazione e il letto della ferita. La medicazione utilizzata in questo studio spesso aderisce sia al letto della ferita che al tessuto circostante.
   1. Per assicurarsi che l'intero letto avvolto sia coperto da soluzione, sollevare delicatamente la medicazione con le forcep, allontanandolo dal letto della ferita, mentre si inietta lentamente la soluzione.
4. Dopo il trattamento, riposizionare i topi nelle loro gabbie per 30 minuti.
5. Dopo 30 minuti di esposizione al trattamento, riaestestizzare i topi con isoflurane e aspirare la soluzione con una siringa, assicurandosi di forare nella stessa area di prima.
   NOTA: Questa soluzione aspirata contiene cellule batteriche disperse, che possono essere salvate per varie analisi a valle.
6. Somministrare il secondo e il terzo trattamento di irrigazione come primo, utilizzando ogni volta una nuova siringa.

6. Imaging e analisi di dispersione in vivo

NOTA: Se un ceppo luminescente di batteri viene utilizzato per avviare l'infezione, è possibile utilizzare un sistema di imaging In Vivo (IVIS) per visualizzare la dispersione dal letto della ferita.

1. Immagini topi immediatamente prima e dopo il trattamento e a 10 e 20 ore dopo il trattamento(figura 2 e figura supplementare 1).
2. Eseguire immagini mentre i topi sono in anestesia posizionandoli singolarmente nell'IVIS e imaging ciascuno per 5 s a una lunghezza d'onda di 560 nm. Salvare le immagini per ulteriori analisi.
   NOTA: La lunghezza d'onda ottimale e il tempo di esposizione dipenderanno dal reporter utilizzato e dallo strumento IVIS e dal software di imaging.
3. Per l'analisi, aprire le immagini nel software IVIS e selezionare l'area da analizzare nella tavolozza degli strumenti.
4. Per tenere conto dello sfondo, posizionare un cerchio sullo sfondo di una foto e quindi posizionare lo stesso cerchio di dimensioni sopra il letto della ferita per ogni mouse.
5. Per caricare i valori di misurazione, selezionare Visualizza misurazioni > regione di interesse (ROI) e caricare la tabella delle misurazioni in un foglio di calcolo. Sottrarre la lettura del cerchio di sfondo da ciascuna delle misurazioni del letto della ferita per calcolare la luminescenza per ogni campione. Calcolare la luminescenza percentuale modificata da:
   ROI pre-trattamento-ROI post-trattamento/ roi pretrattamento) x 100.
   NOTA: I topi di controllo e trattati devono essere analizzati contemporaneamente per normalizzarsi per le variabili che possono influire sull'acquisizione o sulla luminosità dell'immagine.

7. Valutazione della dispersione determinando la CFU

1. Eutanasia umana dei topi mediante iniezione intraperitoneale di 0,2 mL di sodio pentobarbitale (ad esempio Fatal Plus) in anestesia con 100 mg/kg di ketamina 10 mg/kg di xiazina.
2. Raccogliere il tessuto del letto avvolto rimuovendo prima delicatamente la medicazione con forcelle sterili, quindi tagliare intorno al perimetro del letto della ferita con forbici chirurgiche sterili. Sollevare delicatamente un'estremità del letto della ferita con le forcep mentre si usano le forbici per tagliare / stuzzicare il campione lontano dallo strato muscolare.
3. Posizionare il tessuto dal letto della ferita in un tubo di omogeneizzazione da 2 ml preetitolato e pre-pesato contenente 1 ml di PBS. Pesare nuovamente i tubi dopo aver inserito i campioni, quindi invertire delicatamente 3-5 volte per risciacquare eventuali batteri dispersi o vagamente aderenti e rimuovere il PBS. Aggiungere 1 mL di PBS fresco.
4. Per raccogliere le milza, posizionare i topi in una posizione anatomica supina e fissare fissando le estremità a una superficie di dissezione. Immergere l'area da sezionare con il 70% di etanolo per disinfettare l'area e evitare che la pelliccia contamini il campione.
5. Fare con cura una piccola incisione perpendicolare alla linea mediana con forbici chirurgiche nel derma dell'addome inferiore, assicurandosi di tirare la pelle su e lontano dagli organi interni. Proseguire l'incisione interiormente, lungo la linea mediana, fino a raggiungere lo sterno. Una volta esposta la cavità peritoneale e visibili gli organi interni, separare delicatamente la milza dal tessuto connettivo e posizionarla in un tubo di omogeneizzazione separato.
6. Pesare milza e risciacquare con PBS, come descritto per il tessuto del letto della ferita.
   NOTA: Altri organi di interesse possono essere raccolti in modo simile.
   1. Quando si effettua l'incisione iniziale, fare attenzione a evitare di forare l'intestino o altri organi.
7. Omogeneizzare i campioni in tubi di mulino di perline preriempito da 2 ml utilizzando un omogeneizzatore da banco a 5 m/s per 60 s, due volte.
8. Per enumerare la CFU, diluire in serie campioni e spot-plate su agar selettivo. Per la diluizione seriale, pipettare 100 μL del campione in 900 μL di PBS in un tubo, vortice e ripetere 5 volte 1,5 ml. Pipetta 10 μL di ogni diluizione su una piastra di agar, come illustrato nella figura 3.
   NOTA: Se è richiesta una quantificazione CFU più precisa, distribuire 100 μL di ogni diluizione del campione su piastre di agar separate.

8. Valutazione ex vivo della dispersione(figura 4)

1. Ferire i topi e infettare con circa 10⁴ PAO1 come descritto sopra, quindi eutanasiare 48 ore dopo l'infezione.
2. Rimuovere con cura la medicazione con le alessa, utilizzando una tecnica sterile e senza disturbare il letto della ferita.
3. Utilizzare forbici chirurgiche sterili per tagliare il perimetro del letto della ferita lontano dalla pelle non infetta utilizzando le forcelle per sollevare un'estremità del letto della ferita e delle forbici per asportare il tessuto della ferita infetto dallo strato muscolare sottostante e dal tessuto non infetto circostante. Dividere i campioni del letto avvolto in parti uguali o utilizzare interi.
4. Posizionare il tessuto avvolto in tubi omogeneizzanti di mulino perline da 2 ml pre pesati e pre-pesati. Quindi pesare di nuovo i tubi dopo aver aggiunto il campione. Calcolare il peso del campione:
   peso dopo l'aggiunta del campione - peso prima di aggiungere il campione.
5. Aggiungere 1 ml di PBS e invertire delicatamente il tubo 3-5 volte per risciacquare il campione e rimuovere eventuali cellule planctoniche. Rimuovere ed eliminare il PBS.
6. Aggiungere 1 mL di trattamento gh (o PBS come controllo negativo) al campione e incubare per 2 ore a 37 °C con scuotimento a 80 giri/min.
7. Rimuovere la soluzione di dispersione del biofilm e posizionarsi in un tubo separato da 1,5 ml. Contiene le celle disperse.
8. Aggiungere 1 mL di PBS al campione di tessuto rimanente e invertire delicatamente 3-5 volte per risciacquare eventuali cellule disperse rimanenti. Rimuovere ed eliminare il PBS.
9. Aggiungere 1 mL di PBS al tessuto rimanente e omogeneizzare a 5 m/s per 60 s utilizzando un omogeneizzatore da banco.
10. Diluire serialmente la soluzione di cellule disperse e il campione di tessuto omogeneizzato posizionando 100 μL di campione in 900 μL di PBS in un tubo da 1,5 ml e ripetendo cinque volte per un totale di 6 diluizioni.
11. La piastra spot 10 μL di ogni diluizione su agar selettivo multimediale (ad esempio, Pseudomonas Isolation Agar per P. aeruginosa)e incubare le piastre a 37 °C durante la notte.
12. Contare il CFU e calcolare la 'percentuale dispersa' come (CFU in supernatante/ (CFU in supernatante+ CFU nel tessuto biofilm)) x 100.

Risultati

In questo esperimento, topi Webster svizzeri di 8-10 settimane sono stati infettati da 10⁴ CFU di PAO1 che trasportavano il pQF50-lux plasmide a luminescenza. Come descritto sopra, è stato permesso di stabilire un'infezione per 48 ore prima di somministrare trattamenti 3 x 30 minuti di PBS (controllo del veicolo) o 10% GH (trattamento) per digerire il biofilm EPS. I topi sono stati fotofazione pre-trattamento, direttamente dopo il trattamento (0 h) e a 10 h e 20 h dopo il trattamento. La ...

Discussione

Qui descriviamo protocolli che possono essere utilizzati per studiare l'efficacia degli agenti di dispersione del biofilm. Questi protocolli possono essere facilmente adattati all'uso con diversi tipi di agenti dispersivi, specie batteriche o campioni ex vivo, inclusi campioni clinici di debridement. Questo protocollo fornisce anche un modello clinicamente rilevante per raccogliere e studiare cellule batteriche disperse. I fenotipi delle cellule batteriche disperse si sono dimostrati distinti da quelli delle cel...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tube	Fisher	14823434	Use to complete serial dilutions of samples
25G 58 in needle	Fisher	14823434	Attaches to 1 mL syringe
Ampicillin Sodium Salt	Fisher	BP1760-5	Make a 50 mg/ mL stock solution and add 100 µL to 10 mL of LB broth for both overnight and subculture
Amylase	MP Biomedicals	2100447	Make a 5% w/v solution, vortex- other dispersal agents can be used
Buprenorphine SR-LAB 5 mL (1 mg/mL)	ZooPharm	RX216118	Use as pain mainagement- may use other options
Cellulase	MP Biomedicals	2150583	Add 5% w/v to the 5% w/v amylase solution, vortex, activate at 37 °C for 30 min- other dispersal agents can be used
Depilatory cream	Walmart	287746	Use a small amount to massage into the hair follicles on the back of the animal and allot 10 min to remove hair
Dressing Forceps, Serrated Tips	Fisher	12-460-536	Can use other forms of forceps
Erlenmeyer flasks baffled 125 mL	Fisher	101406	Use to grow overnights and sub-cultures of bacteria
FastPrep-24 Benchtop Homogenizer	MP Biomedicals	6VFV9	Use 5 m/s for 60 s two times to homogenize tissue
Fatal Plus	Vortech Pharmaceuticals	0298-9373-68	Inject 0.2 mL intraperitaneal for each mouse
Homogenizing tubes (Bead Tube 2 mL 2.4 mm Metal)	Fisher	15340151	Used to homogenize samples for plating
Isoflurane	Diamond Back Drugs
Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution C-IIIN	Sigma Aldrich	K4138	Use as anasethia- other options can also be utilized to gain a surgical field of anasethia
LB broth, Miller	Fisher	BP1426-2	Add 25 g/L and autoclave
Lidocaine 2% Injectable	Diamond Back Drugs	2468	Inject 0.05 mL through the side of the marked wound bed area so it is deposited in the center of the mark. Allot 10 min prior to cutting
Meropenem	Sigma Aldrich	PHR1772-500MG	Make 5 mg/mL to add to the GH solution to apply topically and a 15 mg/mL solution to inject intraperitaneal 4 h prior and 6 h post-treatment
Non-sterile cotton gauze sponges	Fisher	13-761-52	Use to remove the depilatory cream
PAO1 pQF50-lux bacterial strain	Ref [13]	N/A	PAO1 pgF50-lux was used as the P. aeruginosa strain of interest in this paper's representative results
Petri dishes	Fisher	PHR1772-500MG
Phosphate Buffer Saline 10x	Fisher	BP3991	Dilute 10x to 1x prior to use
Polyurethane dressing	Mckesson	66024007	Cut the rounded edge off and cut the remaining square into 4 equal sections
Pseudomonas isolation agar	VWR	90004-394	Add 20 mL/L of glycerol and 45 g/mL to water, autoclave, and pour 20 mL into petri dishes
Refresh P.M.	Walmart		Use on eyes to reduce dryness during procedure.
Sterile Alcohol Prep Pads	Fisher	22-363-750	Use to clean the skin immediately prior to wounding to disinfect the area
Straight Delicate Scissors	Fisher	89515	Can also use curved scissors
Swiss Webster mice	Charles River	551NCISWWEB	Other mice strains can be used
Syring Slip Tip 1 mL	Fisher	14823434	Used to administer drugs and enzyme treatment