Évaluation de la dispersion du biofilm dans les plaies murines

Résumé

Ici, nous décrivons des méthodes ex vivo et in vivo pour évaluer la dispersion bactérienne d’une infection de blessure chez la souris. Ce protocole peut être utilisé pour tester l’efficacité des thérapies topiques antimicrobiennes et anti-biofilm, ou pour évaluer la capacité de dispersion de différentes souches ou espèces bactériennes.

Résumé

Les infections liées au biofilm sont impliquées dans un large éventail de maladies chroniques telles que les ulcères du pied diabétique non cicatrisants, la sinusite chronique, l’otite moyenne récurrente et bien d’autres. Les cellules microbiennes de ces infections sont protégées par une substance polymère extracellulaire (EPS), qui peut empêcher les antibiotiques et les cellules immunitaires hôtes d’éliminer l’infection. Pour surmonter cet obstacle, les chercheurs ont commencé à développer des agents de dispersion en tant que thérapies potentielles. Ces agents ciblent divers composants dans l’EPS du biofilm, affaiblissant la structure et initiant la dispersion des bactéries, ce qui peut théoriquement améliorer la puissance antibiotique et la clairance immunitaire. Pour déterminer l’efficacité des agents de dispersion pour les infections des plaies, nous avons développé des protocoles qui mesurent la dispersion du biofilm ex vivo et in vivo. Nous employons un modèle chirurgical d’excision de souris qui a été bien-décrit pour créer des infections chroniques biofilm-associées de blessure. Pour surveiller la dispersion in vivo,nous infectons les plaies avec des souches bactériennes qui expriment la luciférase. Une fois que les infections matures se sont établies, nous irrigueons les plaies avec une solution contenant des enzymes qui dégradent les composants de l’EPS du biofilm. Nous surveillons ensuite l’emplacement et l’intensité du signal luminescent dans les organes filtrants et filtrants pour fournir des informations sur le niveau de dispersion atteint. Pour l’analyse ex vivo de la dispersion du biofilm, le tissu de la plaie infectée est immergé dans une solution enzymatique dégradant le biofilm, après quoi la charge bactérienne restant dans le tissu, par rapport à la charge bactérienne en solution, est évaluée. Les deux protocoles ont des forces et des faiblesses et peuvent être optimisés pour aider à déterminer avec précision l’efficacité des traitements de dispersion.

Introduction

L’augmentation de la résistance aux antibiotiques dans le monde entier conduit à un manque d’options antibiotiques pour traiter une variété d’infections bactériennes¹. En plus de la résistance aux antibiotiques, les bactéries peuvent gagner en tolérance aux antibiotiques en adoptant un mode de vie associé au biofilm². Un biofilm est une communauté de micro-organismes qui sont protégés par une matrice de polysaccharides, d’ADN extracellulaire, de lipides et de protéines^3,collectivement appelée substance polymère extracellulaire (EPS). Alors que la crise de la résistance aux antibiotiques se poursui....

Protocole

Ce protocole animal a été examiné et approuvé par le Institutional Animal Care and Use Committee du Texas Tech University Health Sciences Center (numéro de protocole 07044). Cette étude a été réalisée en stricte conformité avec les recommandations du Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health.

1. Préparation des bactéries pour les infections de souris

REMARQUE: Ici, nous décrivons infecter les souris uniquement avec Pseudomonas aeruginosa. Cependant, d’autres espèces bactériennes peuvent être utilisées pour causer une infection. Les souches et matériaux....

Résultats

Dans cette expérience, des souris femelles de Webster suisses âgées de 8 à 10 semaines ont été infectées par 10^{à 4} UFC de PAO1 portant le plasmide de luminescence pQF50-lux. Comme décrit ci-dessus, on a permis à une infection d’établir pendant 48 h avant d’administrer 3 x 30 traitements de minute de PBS (contrôle du véhicule) ou de GH à 10 % (traitement) pour digérer l’EPS du biofilm. Des souris ont été idés prétraitement, directement après traitement (0 h) et à 10 h et 20 h après l.......

Discussion

Nous décrivons ici les protocoles qui peuvent être utilisés pour étudier l’efficacité des agents de dispersion du biofilm. Ces protocoles peuvent être facilement adaptés pour être utilisés avec différents types d’agents de dispersion, d’espèces bactériennes ou d’échantillons ex vivo, y compris des échantillons de débridement clinique. Ce protocole fournit également un modèle cliniquement pertinent pour collecter et étudier les cellules bactériennes dispersées. Il a été démontré qu.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tube	Fisher	14823434	Use to complete serial dilutions of samples
25G 58 in needle	Fisher	14823434	Attaches to 1 mL syringe
Ampicillin Sodium Salt	Fisher	BP1760-5	Make a 50 mg/ mL stock solution and add 100 µL to 10 mL of LB broth for both overnight and subculture
Amylase	MP Biomedicals	2100447	Make a 5% w/v solution, vortex- other dispersal agents can be used
Buprenorphine SR-LAB 5 mL (1 mg/mL)	ZooPharm	RX216118	Use as pain mainagement- may use other options
Cellulase	MP Biomedicals	2150583	Add 5% w/v to the 5% w/v amylase solution, vortex, activate at 37 °C for 30 min- other dispersal agents can be used
Depilatory cream	Walmart	287746	Use a small amount to massage into the hair follicles on the back of the animal and allot 10 min to remove hair
Dressing Forceps, Serrated Tips	Fisher	12-460-536	Can use other forms of forceps
Erlenmeyer flasks baffled 125 mL	Fisher	101406	Use to grow overnights and sub-cultures of bacteria
FastPrep-24 Benchtop Homogenizer	MP Biomedicals	6VFV9	Use 5 m/s for 60 s two times to homogenize tissue
Fatal Plus	Vortech Pharmaceuticals	0298-9373-68	Inject 0.2 mL intraperitaneal for each mouse
Homogenizing tubes (Bead Tube 2 mL 2.4 mm Metal)	Fisher	15340151	Used to homogenize samples for plating
Isoflurane	Diamond Back Drugs
Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution C-IIIN	Sigma Aldrich	K4138	Use as anasethia- other options can also be utilized to gain a surgical field of anasethia
LB broth, Miller	Fisher	BP1426-2	Add 25 g/L and autoclave
Lidocaine 2% Injectable	Diamond Back Drugs	2468	Inject 0.05 mL through the side of the marked wound bed area so it is deposited in the center of the mark. Allot 10 min prior to cutting
Meropenem	Sigma Aldrich	PHR1772-500MG	Make 5 mg/mL to add to the GH solution to apply topically and a 15 mg/mL solution to inject intraperitaneal 4 h prior and 6 h post-treatment
Non-sterile cotton gauze sponges	Fisher	13-761-52	Use to remove the depilatory cream
PAO1 pQF50-lux bacterial strain	Ref [13]	N/A	PAO1 pgF50-lux was used as the P. aeruginosa strain of interest in this paper's representative results
Petri dishes	Fisher	PHR1772-500MG
Phosphate Buffer Saline 10x	Fisher	BP3991	Dilute 10x to 1x prior to use
Polyurethane dressing	Mckesson	66024007	Cut the rounded edge off and cut the remaining square into 4 equal sections
Pseudomonas isolation agar	VWR	90004-394	Add 20 mL/L of glycerol and 45 g/mL to water, autoclave, and pour 20 mL into petri dishes
Refresh P.M.	Walmart		Use on eyes to reduce dryness during procedure.
Sterile Alcohol Prep Pads	Fisher	22-363-750	Use to clean the skin immediately prior to wounding to disinfect the area
Straight Delicate Scissors	Fisher	89515	Can also use curved scissors
Swiss Webster mice	Charles River	551NCISWWEB	Other mice strains can be used
Syring Slip Tip 1 mL	Fisher	14823434	Used to administer drugs and enzyme treatment