ネズミの創傷におけるバイオフィルム分散の評価

要約

ここでは、マウスにおける創傷感染からの細菌分散を評価するための ex vivo および in vivo 方法について述べた。このプロトコルは、局所抗菌および抗菌性の治療の有効性をテストするために、または異なる細菌株または種の分散能力を評価するために利用することができる。

要約

バイオフィルム関連感染症は、非治癒糖尿病性足潰瘍、慢性副腎炎、再発性中耳炎などの慢性疾患の広い配列に関与しています。これらの感染症内の微生物細胞は、抗生物質および宿主免疫細胞が感染をクリアするのを防ぐことができる細胞外ポリマー物質(EPS)によって保護される。この障害を克服するために、研究者は潜在的な治療薬として分散剤の開発を開始しました。これらの薬剤は、バイオフィルムEPS内の様々な成分を標的とし、構造を弱め、細菌の分散を起こし、理論的には抗生物質の効力と免疫クリアランスを改善することができる。創傷感染に対する分散剤の有効性を判断するために、 我々は、ex vivo と in vivoの両方のバイオフィルム分散を測定するプロトコルを開発した。我々は、バイオフィルム関連の慢性創傷感染症を作成するためによく説明されているマウス外科切除モデルを使用する。 生体内の分散を監視するために、ルシファーゼを発現する細菌株で創傷に感染します。成熟した感染症が確立したら、バイオフィルムEPSの成分を分解する酵素を含む溶液で創傷を灌漑します。次に、創傷と臓器の発光信号の位置と強度を監視し、達成した分散レベルに関する情報を提供します。バイオフィルム分散の ex vivo 解析では、感染した創傷組織がバイオフィルム分解酵素溶液中に沈下され、その後、組織に残っている細菌負荷は、溶液中の細菌負荷に対して、評価される。どちらのプロトコルにも長所と短所があり、分散処理の有効性を正確に判断できるように最適化できます。

概要

世界的な抗生物質耐性の上昇は、細菌感染症の様々な治療するための抗生物質の選択肢の欠如につながっている¹.抗生物質耐性に加えて、細菌はバイオフィルム関連のライフスタイル²を採用することによって抗生物質耐性を得ることができる。バイオフィルムは、多糖、細胞外DNA、脂質、タンパク質³のマトリックスによって保護される微生物の集まりであり、細胞外高分子物質(EPS)と総称されます。抗生物質耐性の危機が続く中、抗生物質の使用を延長したり、有効性を増強したりする新しい戦略が必要です。抗バイオフィルム剤は、有望なソリューション^{の1つです 4}.

提案されている異なる抗バイオフィルム戦略の中で、バイオフィルムEPSの異なる成分を標的とする分散剤の利用は、治療開発⁵の最前線にある。グリコシド水化酵素(GH)は、分散剤のそのようなクラスの一つである。GHは、EPSに構造的完全性を提供する多糖内の異なる結合の切断を触媒する酵素の大規模なクラスである。我々のグループは、他のグループと同様に、GHが効果的にバイオフィルムを分解し、分散を誘導し、インビボ^{6、7、8、9、10、11}の両方の異なる細菌種に対する抗生物質の有効性を改善できることを示している。

バイオフィルム分散への関心が高まる中、分散効果を評価する効果的な方法を開発することが重要です。ここでは、マウスにおける分散剤によるバイオフィルム関連創傷感染症の治療に関する詳細なプロトコルを提示し、生体内およびex vivoにおける 分散効力の評価を行 う。全体的な目標は、バイオフィルム分散を効果的かつ効率的に測定するために前臨床モデルで使用できる効果的な方法を提供することです。

これらの研究では、バイオフィルム関連感染を確立するために、マウスの外科的切除感染モデルが使用された。私たちは15年以上にわたってこのモデルを使用し、私たちの観測を広範囲に発表^{しました 7,9,12,13,14,15,}16^,17,18,19,20^,21.一般に、これは細菌が創傷床に局在し続け、バイオフィルム関連(EPSに囲まれた凝集体に見られる細菌)である非致死感染モデルであり、最大3週間続く慢性感染を設定する。しかし、マウスが免疫不全(例えば1型糖尿病)であれば、このモデルでは致命的な全身感染を発症しやすくなる可能性があります。

本報告書では、インビボとex vivoの両方で創傷からの細菌の分散を評価するためのプロトコルを提供します。両方のプロトコルは、分散剤の有効性を調べるために使用することができ、独自の長所と短所を持っています。例えば、生体内で分散を評価すると、分散後の身体の他の部分への細菌の拡散に関する重要なリアルタイム情報と、宿主がどのように反応するかが分かるようになる。一方、分散ex vivoの評価は、複数の薬剤、用量、または製剤をスクリーニングするためにより望ましい場合があり、組織が別々に試験することができる複数のセクションに分けることができるので、必要なマウスの数を減らすことができる。複数の薬剤を評価する場合、我々は通常、前に説明した^6、9、22のように、最初のインビトロで分散を測定する。 その後、最も効果的なex vivoをテストし、限られた数の非常に有望な薬剤のインビボテストを予約します。

プロトコル

この動物プロトコルは、テキサス工科大学健康科学センターの施設動物管理および使用委員会によって見直され、承認されました(プロトコル番号07044)。この研究は、国立衛生研究所の実験動物のケアと使用ガイドの勧告に厳密に従って行われました。

1. マウス感染のための細菌の準備

注:ここでは、 緑膿菌に感染するマウスについて説明します。しかし、他の細菌種は、感染を引き起こすために使用され得る。細菌株と材料は、 材料の表に詳述されています。

1. シュードモナス・エルギノーサ野生型株PAO1を使用して、前述のとおりこれらの実験のために発光プラスミドpQF50-lux23を運ぶ^7。
2. バッフルエルレンマイヤーフラスコで P.エルギノーサ 株を成長させ、200rpmで振盪し、ルリア・ベルタニ(LB)スープで37°Cで16〜20時間成長させる。プラスミドの維持のためにPAO1(pQF50-lux)の一晩培養に100 μg/mLのアンピシリンの最終濃度を加えます。
3. サブカルチャー P.エルギノーサは、100μg/mLアンピシリンの最終濃度を有するLBスープ10mLを含むエルレンマイヤーフラスコに一晩培養の100μLを加えることによって。次いで、37°Cで2-2.5h、0.4の_{OD600 nm}に成長し、次いで、約104細胞の感染用量のために3回(1:10)を連続して希釈する。

2. バイオフィルム分散酵素の調製

注:この研究では、分散処理のために「GH」と呼ばれる等しい部分アミラーゼとセルラーゼ(それぞれ5%)の10%溶液を使用します。

1. 10%GH溶液(w/v)のアミラーゼ( バチルス・サブタイリスから)および真菌セルラーゼ( アスペルギルス・ニジェールから)を1xリン酸緩衝塩(PBS)で希釈して使用してください。車両制御処理としてPBSを使用します。
2. 酵素活性化のために30分間、すべての処理を37°Cに温めます。

3. 実験動物と術前セットアップ

1. ハウスマウス、ケージあたり5つのごみの仲間、環境制御された条件で、12時間の明暗サイクルと食料と水への適切なアクセスを備えています。
2. 好ましくは、生後8~10週の間に、スイスのウェブスターマウスをメスで使用する。
3. 投与する適切な量の麻酔を決定するためにマウスの重量を量る。
4. 100 mg/kg ケタミン 10 mg/kg キシラジンの腹腔内注射により麻酔を投与する。
5. 綿棒を使って目にアイクリーム(例えば、リフレッシュP.M.)を塗布し、乾燥を減らします。
6. 呼吸数、肌の着色、体温など、手術全体を通して生理学的パラメータを監視します。

4. 全厚の外皮切除手術

1. つま先ピンチと呼吸数と労力のモニタリングによって麻酔の外科面を評価する。後ろ面を剃り、脱毛剤を10分間(または製品の指示に従って)塗布し、その後穏やかに取り除き、皮膚が乾燥していることを確認します。
2. 疼痛管理のために、切除される領域に皮下に0.05 mLのリドカインを投与し、0.02mLのブプレノルフィンを首の擦り傷に皮下に注入する。痛みの管理に達したことを確認するために10分待ちます。
3. 切除前に、アルコール綿棒を使用して背部表面を消毒し、後部に向かって直径1.5cmの円を描きます。手順を通して無菌の外科分野を維持し、オートクレーブされた器械および生殖不能の手袋を使用した。汚染を制限するには、点灯したブンゼンバーナーで手術を行い、動物ごとにクリーンツールを使用してください。
4. 外科用はさみで、完全な厚さ、切除皮膚の傷をパンニクル筋のレベルに投与する。
5. 切除後、すぐに半浸透性のポリウレタンドレッシングで創傷を覆う。
6. 約¹⁰⁴ CFUの細菌をドレッシングの下の100 μL PBSに注入し、創傷床に、感染を確立する。
   注:創傷はまた、同時に細菌および/または真菌の複数の種に感染することができ、または、患者¹⁹から抽出されたプレ形成バイオフィルム^12、あるいは脱花組織を創傷床に置くことによっても。
7. 感染後、マウスを加熱パッド付きケージに入れ、右反射が取り戻されるまで監視します。
   注:マウスが冷たくなり、死に至る可能性がありますので、必ず冷たくしてください。
8. 創傷感染を48時間確立する。
9. 接着剤のドレッシングを毎日、涙や非付着の領域を検査し、必要に応じて交換してください。

5. 生体内 分散処理

注: ここでは、一連の 3 つの局所創傷灌漑ソリューションを適用して分散剤の管理について説明します (図 1)。しかし、このプロトコルは、ゲル、クリーム、ドレッシングの用途など、他の種類の送達に適応することができます。

1. マウスをイオブルラン麻酔下(酸素1分間あたり3%と1 L)で治療を行い、治療を行う。
2. 1 mL 注射器を 3 本用意し、25 G 針で、各マウスに 200 μL の治療を施します。
3. 200 μLの酵素溶液またはPBSコントロールを、動物の頭部に向かって傷のわずかに上に、鉗子で皮膚を慎重に持ち上げてつまんで傷口に注入する。慎重に持ち上げられた皮膚を通して注射器を突き刺し、ドレッシングと創傷床の間にゆっくりと溶液を注入する。この研究で利用されるドレッシングは、しばしば創傷床および周囲の組織の両方に付着する。
   1. 創傷床全体が溶液で覆われていることを確実にするために、ドレッシングを鉗子でそっと上げ、創傷床から引き離し、ゆっくりと溶液を注入する。
4. 治療後、マウスをケージに30分間戻します。
5. 治療に30分の暴露の後、イオブルランでマウスを再麻酔し、注射器で溶液を吸引し、以前と同じ領域で穿刺することを確認します。
   注:この吸引溶液は、様々な下流分析のために保存することができる分散細菌細胞が含まれています。
6. 第2および第3の灌漑治療を最初として、毎回新しい注射器を使用して投与する。

6. 生体内 の分散イメージングと解析

注:細菌の発光株が感染を開始するために利用されている場合、 インビボイメージングシステム (IVIS)を使用して創傷床からの分散を視覚化することができます。

1. 画像マウスは、処置の直前と直後、および10時間および20時間後処理時(図2および補足図1)で行う。
2. マウスを麻酔下で個別にIVISに配置し、560nmの波長で5sのそれぞれをイメージングすることによって、イメージングを行います。さらなる分析のために画像を保存します。
   注意:最適な波長と露光時間は、使用するレポーターとIVIS機器およびイメージングソフトウェアによって異なります。
3. 解析のために、IVIS ソフトウェアで画像を開き、ツール パレットで解析する領域を選択します。
4. 背景を説明するには、写真の背景に円を置き、各マウスの傷のベッドの上に同じサイズの円を置きます。
5. 測定値をアップロードするには、[ 関心のある地域 (ROI) の表示 - > を選択し、測定値のテーブルをスプレッドシートにアップロードします。各創傷床測定値から背景円の読み取りを引き、各サンプルの発光を計算します。次の値で変更された発光率を計算します。
   ROI前処理後処理/ROI前処理)x 100。
   注: コントロールマウスと処理されたマウスは、画像の取得や輝度に影響を与える可能性のある変数を正規化するために同時に分析する必要があります。

7. CFUの決定による分散の評価

1. 100 mg/kg ケタミン 10 mg/kg キシラジンを用いた麻酔下で 0.2 mL のペントバルビタールナトリウム (フェイタルプラスなど) の腹腔内注射によりマウスをヒトに安楽死させる。
2. 創傷床組織を採取するには、まず滅菌鉗子でドレッシングをそっと取り除き、滅菌手術用はさみで創傷床の周囲を切り取る。はさみを使用してサンプルを筋肉層から切り取り/からかう間、傷ついたベッドの一方の端を鉗子でそっと持ち上げます。
3. PBSの1 mLを含む2mLの均質化チューブを事前に標識し、あらかじめ秤にかけた傷床から組織を入れる。サンプルを挿入した後にチューブをもう一度計量し、3〜5回そっと反転して分散または緩く付着した細菌をすすいで、PBSを取り除きます。新鮮なPBSを1mL加えます。
4. 脾臓を収穫するために、マウスをスピン解剖学的位置に置き、四肢を解剖表面に固定して固定する。70%エタノールで解剖する領域を浸し、その領域を消毒し、毛皮がサンプルを汚染しないようにします。
5. 下腹部の真皮に外科的なはさみで中線に垂直な小さな切開を慎重に行い、皮膚を内臓から引き上げ、離します。胸骨に達するまで、中線に沿って、内部で切開を続けます。腹腔が露出し、内臓が見えるようにしたら、脾臓を結合組織から穏やかに分離し、別の均質化管に入れる。
6. 創傷床組織について説明したように、脾臓およびすすいでPBSを用いて秤量する。
   注:関心のある他の器官も同様に収穫することができます。
   1. 最初の切開を行う場合は、腸や他の臓器を穿刺しないように注意してください。
7. ベンチトップホモジナイザーを使用して2 mLプレフィルドビーズミルチューブでサンプルをホモジェナイズし、60 sで50s、2回加工します。
8. CFUを列挙するために、選択的寒天上のサンプルおよびスポットプレートを連続して希釈する。シリアル希釈の場合、サンプルのピペット100 μLを900 μLのPBSに1.5 mLチューブ、渦、5回繰り返します。 図3に示すように、各希釈液のピペット10μLを寒天プレートに取り付ける。
   注:より正確なCFU定量が必要な場合は、サンプルの希釈液100μLを別々の寒天プレートに分散させます。

8.分散のエクスビボ評価 (図4)

1. マウスを創傷し、上述した約^{104 PAO1} に感染し、感染後48時間安楽死させた。
2. 慎重に無菌技術を使用し、創傷床を妨げることなく、鉗子でドレッシングを除去します。
3. 無菌の外科用はさみを使用して、鉗子を使用して創傷床の一端を持ち上げ、ハサミを使用して、感染していない組織の下および周囲の筋肉層から感染した創傷組織を切除することによって、未感染の皮膚から傷床の周囲を切断する。巻き上げ床のサンプルを等しい部分に分割するか、全体を使用します。
4. 創傷組織を空の、あらかじめ秤量された2 mLビーズミル均質化チューブに入れる。その後、サンプルを追加した後、チューブをもう一度計量します。サンプルの重量を計算するには、次の手順を実行します。
   サンプルを追加した後の重量 - サンプルを追加する前に重量。
5. PBSを1 mL加え、チューブを3~5回軽く反転させ、サンプルをすすいで、プランクトン細胞を取り除きます。PBS を削除して破棄します。
6. 試料に1mLのGH処理(または陰性対照としてPBS)を加え、80rpmで振盪して37°Cで2時間インキュベートする。
7. バイオフィルム分散液を取り出し、別の1.5 mLチューブに入れる。これは、分散した細胞が含まれています。
8. 残りの組織サンプルにPBSの1 mLを加え、3〜5回穏やかに反転して残りの分散細胞をすすいでください。PBS を削除して破棄します。
9. 残りの組織にPBSの1 mLを加え、ベンチトップホモジナイザーを使用して60 sの5 m/sで均質化します。
10. 100 μLのサンプルをPBSの900 μLに1.5 mLチューブに入れ、5回繰り返して合計6希釈して、分散した細胞と均質化した組織サンプルの溶液を連続して希釈します。
11. 各希釈液の10μLを培地選択寒天(例えば 、P.緑膿菌用シュードモナス分離寒天)に10μLのスポットプレートを用い、一晩で37°Cでプレートをインキュベートする。
12. CFUを数え、x100として「分散パーセント」(上清中のCFU/(上清+バイオフィルム組織のCFU))として計算する。

結果

この実験では、8-10週齢のスイスウェブスターマウスは、pQF50-ルクスの発光プラスミドを運ぶPAO1の10⁴ CFUに感染した。上述したように、感染症は、バイオフィルムEPSを消化するためにPBS(車両制御)または10%GH(処置)の3 x 30分治療を投与する前に48時間の間確立することを許した。マウスは、治療前に、治療後(0時間)および10時間および20時間後に直接、処置前に画像化した。

ディスカッション

ここでは、バイオフィルム分散剤の有効性を研究するために利用できるプロトコルについて説明する。これらのプロトコルは、さまざまな種類の分散剤、細菌種またはex vivoサンプル(臨床デブリドメントサンプルを含む)で使用するように容易に適応することができる。このプロトコルはまた、分散細菌細胞を収集し、研究するための臨床的に関連するモデルを提供します。分散細菌細?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tube	Fisher	14823434	Use to complete serial dilutions of samples
25G 58 in needle	Fisher	14823434	Attaches to 1 mL syringe
Ampicillin Sodium Salt	Fisher	BP1760-5	Make a 50 mg/ mL stock solution and add 100 µL to 10 mL of LB broth for both overnight and subculture
Amylase	MP Biomedicals	2100447	Make a 5% w/v solution, vortex- other dispersal agents can be used
Buprenorphine SR-LAB 5 mL (1 mg/mL)	ZooPharm	RX216118	Use as pain mainagement- may use other options
Cellulase	MP Biomedicals	2150583	Add 5% w/v to the 5% w/v amylase solution, vortex, activate at 37 °C for 30 min- other dispersal agents can be used
Depilatory cream	Walmart	287746	Use a small amount to massage into the hair follicles on the back of the animal and allot 10 min to remove hair
Dressing Forceps, Serrated Tips	Fisher	12-460-536	Can use other forms of forceps
Erlenmeyer flasks baffled 125 mL	Fisher	101406	Use to grow overnights and sub-cultures of bacteria
FastPrep-24 Benchtop Homogenizer	MP Biomedicals	6VFV9	Use 5 m/s for 60 s two times to homogenize tissue
Fatal Plus	Vortech Pharmaceuticals	0298-9373-68	Inject 0.2 mL intraperitaneal for each mouse
Homogenizing tubes (Bead Tube 2 mL 2.4 mm Metal)	Fisher	15340151	Used to homogenize samples for plating
Isoflurane	Diamond Back Drugs
Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution C-IIIN	Sigma Aldrich	K4138	Use as anasethia- other options can also be utilized to gain a surgical field of anasethia
LB broth, Miller	Fisher	BP1426-2	Add 25 g/L and autoclave
Lidocaine 2% Injectable	Diamond Back Drugs	2468	Inject 0.05 mL through the side of the marked wound bed area so it is deposited in the center of the mark. Allot 10 min prior to cutting
Meropenem	Sigma Aldrich	PHR1772-500MG	Make 5 mg/mL to add to the GH solution to apply topically and a 15 mg/mL solution to inject intraperitaneal 4 h prior and 6 h post-treatment
Non-sterile cotton gauze sponges	Fisher	13-761-52	Use to remove the depilatory cream
PAO1 pQF50-lux bacterial strain	Ref [13]	N/A	PAO1 pgF50-lux was used as the P. aeruginosa strain of interest in this paper's representative results
Petri dishes	Fisher	PHR1772-500MG
Phosphate Buffer Saline 10x	Fisher	BP3991	Dilute 10x to 1x prior to use
Polyurethane dressing	Mckesson	66024007	Cut the rounded edge off and cut the remaining square into 4 equal sections
Pseudomonas isolation agar	VWR	90004-394	Add 20 mL/L of glycerol and 45 g/mL to water, autoclave, and pour 20 mL into petri dishes
Refresh P.M.	Walmart		Use on eyes to reduce dryness during procedure.
Sterile Alcohol Prep Pads	Fisher	22-363-750	Use to clean the skin immediately prior to wounding to disinfect the area
Straight Delicate Scissors	Fisher	89515	Can also use curved scissors
Swiss Webster mice	Charles River	551NCISWWEB	Other mice strains can be used
Syring Slip Tip 1 mL	Fisher	14823434	Used to administer drugs and enzyme treatment