曼迪布勒穆林模型中矫形牙齿运动期间 PDL 胶原蛋白纤维的 3D 成像

摘要

我们提出了在小鼠中产生正畸牙齿运动的方案，以及无需分割即可对牙周韧带胶原纤维和血管进行3D可视化的方法。

摘要

正畸牙齿运动是一种复杂的生物过程，由于外力而改变软硬组织改造。为了了解这些复杂的改造过程，研究牙齿和牙周组织在其3D上下文中至关重要，因此尽量减少任何分割和组织人工制品。由于小老鼠体积小、代谢率高、遗传学和易处理性，它们经常用于发育和结构生物学以及生物力学。原则上，这也使他们成为牙科相关研究的优秀模型。然而，一个主要的障碍是它们的牙齿尺寸小，尤其是摩尔。本文旨在为产生正畸牙齿运动的逐步协议和小鼠手底摩尔牙周韧带纤维成分的三维成像提供两种方法。提出的第一种方法是基于微CT设置，使新鲜胶原蛋白组织具有相增强成像功能。第二种方法是使用乙基肉桂的骨清除方法，使成像通过骨骼无需分割，并保留内源性荧光。结合这种结算方法与记者鼠标像Flk1-Cre:TdTomato 提供了第一次这样的机会来映像 PDL 和肺骨中的 3D 血管。

引言

正畸牙齿运动 （OTM） 中的基本生物学过程是骨骼重塑。这种改造过程的触发因素归因于牙周韧带（PDL）结构的变化，如细胞外基质（ECM）应力、坏死以及血管破坏和形成^1、2、3。其他可能的紫外骨重塑触发因素与骨细胞在骨骼中的力感应以及骨质疏松体本身的机械变形有关:然而，他们在OTM中的角色仍然没有完全阐明^4，5。

尽管许多研究旨在揭示在OTM期间PDL的结构-功能关系，一个明确的功能机制尚未定义^6，7。其主要原因是在检索位于两个硬组织（水泥和肺骨）之间的软组织 （PDL） 的数据方面面临挑战。收集结构信息的公认方法通常需要固定和分割，从而破坏和修改 PDL 结构。此外，这些方法大多产生二元数据，即使没有失真，也只提供部分和本地化的信息。由于 PDL 的结构和功能不均匀，因此有必要采用一种处理整个齿-PDL-骨骼复合体完整 3D 结构的方法。

本文将描述在小鼠中生成 OTM 的方法和两种在不分割样品的情况下实现 PDL 中胶原纤维的 3D 可视化的方法。

Murine 模型广泛应用于医学、发育生物学、药物输送和结构研究中的活体实验。它们可以进行基因改造，以消除或增强特定的蛋白质和功能:它们提供快速、可重复和可预测的发展控制;它们也很容易图像，因为他们的小尺寸^8。尽管它们有许多优点，但牙科研究中的鼠标模型并不经常使用，尤其是在需要临床操作时，这主要是因为牙齿尺寸小。动物模型，如老鼠^{9，10，11，}狗12，13，猪14，15，16和猴子¹⁷比老鼠使用更多。随着高分辨率成像技术的不断发展，利用鼠标模型破译OTM中错综复杂的过程的优点是多种多方面的。本文提出了一种方法，以产生摩尔牙在可塑性与恒定力水平，触发骨重塑的中微运动。大多数在啮齿动物中的OTM实验是在最大值进行的，因为可操纵性和舌头的存在增加了另一个复杂程度。但是，当需要 3D 结构完整性时，可强制具有许多优势。它可以很容易地解剖为整个骨头:在某些物种中，它可以通过纤维共生被分成两个下摆:它是紧凑的，平坦的，只包含没有任何鼻窦空间的牙齿。相比之下，最大骨是头骨的一部分，与其他器官和结构密切相关，因此需要进行广泛的分割，以便用相关的牙齿解剖杏骨。

我们利用室内湿度室与高分辨率微CT内部的加载系统相结合，实现相位增强，开发出一种3D中可视化新鲜纤维组织的方法，如先前描述的^{9、18、19、20、21、22、23。}动物牺牲后立即扫描新鲜组织，无需任何污渍或固定，从而减少组织人工制品以及生物力学特性的改变。这些3D数据可用于分布和方向分析的纤维，如其他地方^描述19。

这里介绍的第二个 3D 全组织成像方法基于可拆解的光学清除，使 PDL 纤维在无需任何分割的情况下通过骨骼成像。有趣的是，它也使骨骼本身的胶原纤维可视化，但这里不会讨论这个问题。一般来说，组织清除有两种方法。第一种是水基清除，样品浸入水溶液中，通过简单的浸入、高水化或水凝胶嵌入，折射指数大于 1.4。然而，这种方法在透明度和组织结构保存方面是有限的，因此需要固定组织。第二种方法，产生高度透明的样品，不需要固定是溶剂为基础的清除方法^24，25。我们为曼迪布拉样品生成了基于乙基-3-苯丙-2-苯酸酯（乙基肉碱，ECi）的改性溶剂清除方法。该方法具有使用无毒食品级清除剂、最小组织收缩和荧光蛋白保存等优点。

研究方案

所有动物实验均符合国家卫生研究院《实验室动物护理和使用指南》和哈佛大学机构动物护理与使用委员会的准则（第01840号议定书）。

1. 矫形牙齿运动

1. 要生成鼠标床，请使用带楔形、45° 角头的扁平塑料平台。头靠面可以通过切割塑料盒生成。
   1. 提升平台的头部端，在头架和桌面平面之间产生大约 30° 角。将弯曲的厚回形针（直径为 0.036"）连接到头部侧端，以保持上切口。
   2. 在尾端，生成一个高架表面，其中可连接一个声像电源链，以保持较低的切口。请参阅 图 1 示例平台。
2. 麻醉小鼠通过在10毫克/千克的静脉注射和氯胺酮100mg/kg使用1mL注射器和27量表针。
3. 将麻醉鼠标放在定制平台上，通过钩住回形针环上的上切口来固定上颚。打开鼠标的下颚，将矫形电源链钩在下切口上。保持脸颊缩回与迷你大肠杆菌口缩回器。
4. 将平台置于手术显微镜或任何其他可达到 5-6 倍放大倍数的立体镜下。
5. 在小鼠眼睛上涂抹50微升盐水（约1滴），以防止角膜脱水。每20分钟补充一次盐水。
6. 切一根铝线（直径0.08毫米）1厘米长。使用显微手术针架，在可复制区域内以语言方式从胸侧滑动电线，使第一和第二摩尔之间的接触点响起。在第一个摩尔前面留有 2 毫米的自由边缘，以便线程进入弹簧端。
7. 切一块镍钛（NiTi）线圈，长度约7至9根线。
   注:线圈的弹性特性将为体畸运动提供恒定的力量。线圈的总无拘无束长度应短于切口和摩尔之间的间隙。请记住，每端需要额外的 2 个线程来将线圈固定在牙齿上。选择铝线是为了减少微CT扫描过程中的光束硬化等扫描人工制品。
8. 在下部第一摩尔和下切口之间插入 NiTi 线圈弹簧（0.15 毫米线直径，0.9 毫米内线圈直径;提供 10 克的力）。使用在第 1.6 步中插入第一个摩尔周围的线连字，将线紧紧地围绕线圈弹簧的 2 根线线扭动，以修复摩尔侧的线圈。
9. 为了确保统一的力水平，在第一个摩尔和切口之间精确使用 3 个活动线。暂时从切口上取下电源链，并在切口上将 2 到 3 个未受约束的螺纹固定在切口上以锚定线圈。将线程滑动到切口自由银杏边缘。
10. 将一层可流动的复合树脂放在线圈的切口边框上，用牙科治疗灯将其固化。固化树脂后更换电源链。
11. 使用相同的固化光，加热尼蒂线圈20s。这将收紧尼蒂线圈。完成的位置显示图1C。
12. 要么保持反面完好无损，要么插入假象，如第一个摩尔和第二个摩尔之间的电线。
13. 将麻醉的鼠标置于加热光线下，使鼠标保持温暖，直到恢复。
14. 将鼠标放回单独的笼子里，每天进行监控。在正畸运动期间，不需要改变饮食。
    注意:一侧的 OTM 设备会引起一些不适，但不会损害进食。但是，由于增加的不适量，不建议在两侧插入设备。除非看到疼痛的外在迹象，否则没有必要服用止痛药。

2. 新鲜下皮纤维的PDL纤维的微CT扫描

1. 安装下皮 （图 2）
   1. 在矫形运动的预期持续时间后，通过颈椎脱位牺牲小鼠。取出可下达的，并分离成下皮。
      注意:由于样品无法固定，因此必须尽快进行下颚解剖和安装，最好是在 30 分钟内。
   2. 用干净的无绒擦拭轻轻取出周围的软组织。
   3. 使用显微外切刀和钳子在立体显微镜下取出矫形器，其放大倍数至少为 4 倍。
   4. 将样品保湿在 1.5 mL 的体积中，微型离心管以及一块用水滋润的无绒擦拭。
   5. 将可打包的牙科复合树脂放入舞台上的样品槽中，然后将新鲜的下摆可制剂放入复合物中。安装前，确保与牙齿复合物接触的骨表面不含任何软组织和干燥，否则牙齿复合物无法正常治愈。
   6. 调整半人马的位置，直到第一个摩尔位于舞台的中线槽处。确保遮挡表面是水平的。当对定位感到满意时，可以固化复合材料。
      注:可在切口和/或切口两侧放置少量牙科复合材料，以帮助稳定样本。
   7. 在样品阶段将无湿润绒擦拭放在湿度池内。将牙齿复合物放在第一个摩尔的遮挡表面。在关闭腔室之前，确保没有任何东西阻挡标本级别的 X 射线路径。
   8. 将房间贴在微型 CT 中。将腔室拧入微CT样品阶段，以便最大限度地减少成像过程中的运动。
   9. 打开 X 射线，在垂直降低铁锤时拍摄 2D 图像，直到铁锤尖端被复合物包围，但未检测到力增加。
   10. 一旦铁锤嵌入复合材料中，关闭 X 射线源。然后，打开微型 CT 腔室，通过透明的Plexiglas窗口固化复合材料。
2. 微CT设置
   1. 将源电压设置为 40 kV，电流设置为 200 μA。使用 10 倍放大探测器，将样品定位在视图框架内。对于捕获的图像使用 2 的装箱。
      注意:由于 PDL 的密度明显低于骨骼和牙齿，因此可视化 PDL 需要更高的功率和暴露时间。此协议将提供可视化 PDL 的设置。
   2. 将单个图像曝光时间设置为 25 s。将样本阶段的旋转设置为 183 度或更高范围。设置 2500 个投影的扫描。不要使用任何 X 射线源过滤器，由此产生的扫描每侧的 voxel 大小为 0.76 μm。
   3. 根据微CT指南收集适当的重建参考扫描。使用 1/3 的参考图像作为总投影。使用后投影过滤算法，在不附加装箱的情况下重建体积。

3. 结算方法 （图3）

1. 准备五根1.5mL的微型离心管。
2. 在 1.5 mL 微离心管中准备以下解决方案的 1.4 mL:磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中的 4% 副甲醛 （PFA），除离子 （DI） 水中的 50% 乙醇 （EtOH），DI 水中 70% EtOH，以及两管 100% EtOH。
   注:PFA 用于固定样品。ECi 清除还将对未修复的样品进行工作。要清除未修复的样品，只需跳过 PFA 步骤即可。
3. 将解剖的六溴化物放在4%PFA中。用铝箔盖住，在室温下轻轻设置 6 小时，放在摇动器上。
4. 将下皮可移动到 50% Etoh 。将其放在从光覆盖的摇动器上16小时。
5. 将下皮可移动到 70% Etoh 。将其放在从光覆盖的摇动器上16小时。
6. 将下皮移动到100%EtOH。将其放在从光覆盖的摇动器上16小时。
7. 重复 3.6。在第二个100%埃托赫管。
8. 在玻璃或聚丙烯管中准备 5 毫升 ECi。
   注:ECi溶解聚苯乙烯，但不溶于聚丙烯。此外，如果不使用含有荧光蛋白的组织，样品可以在清除过程中暴露在光线下。
9. 将下皮可移动到 ECi 管。用铝箔盖住管子，放在摇动器上，以至少12小时的速度轻轻设置。
   注:协议可在此处暂停。脱水样品可在室温下储存在 ECi 中。ECi 的冻结或熔点为 6.5 至 8.0 °C。 不要存储在4°C。
10. 下皮可用荧光显微镜成像。
    注意:在成像过程中，样品必须浸入 ECi 中才能保持光学透明度。

结果

本文提出了一种生产OTM的方法，以及两种在PDL内对胶原纤维进行三维成像的方法，无需任何分割。出于动物研究目的，当牙齿不对齐时，如果牙齿运动在所有根部产生对腹膜骨的重塑，则被视为正畸运动。为了生成可靠的 OTM，需要在牙齿上施加恒定的力水平。在这里，激活的形状记忆 NiTi 线圈用于在 7 天及以后的实验时间内产生 10 克的一致力（如果有必要）。此处描述的线圈激活 （

讨论

由于大小、遗传学和处理优势，在小鼠体内产生OTM是非常理想的。使用可手性在组织解剖以及样品制备和成像方面都提供了一个易于处理的操作。在这里，我们介绍了一种在OTM后7天内产生OTM的方法，即牙齿在骨骼内的转化运动。使用此协议，可以延长牙齿运动的整个持续时间，因为激活的线圈为运动提供了高达 1 mm 的恒定力水平。然而，线圈的中微侧固定在切口上，切口不断喷发。因此，力向量...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-mL BD Luer-Lok syringe	BD	309628
1X phosphate buffered saline	VWR Life Sciences	0780-10L
200 proof ethanol	VWR Life Sciences	V1016
Aluminum alloy 5019 wire	Sigma-aldrich	GF15828813	0.08 mm diameter wire, length 100th, temper hard. Used as wire ligature around molar.
Avizo 9.7	Thermo Fisher Scientific	N/A	Used to analyze microCT scans
Castroviejo Micro Needle Holders	Fine Science Tools	12060-01
Clr Plan-Apochromat 20x/1.0,CorrVIS-IR M27 85mm	Zeiss	N/A	Used for second harmonic generation imaging
Cone socket handle, single ended, hand-form	G.Hartzell and son	126-CSH3	Handle of the inspection mirror
EC Plan-Neofluar 5x/0.16	Zeiss	440321-9902	Used for light-sheet imaging
Elipar DeepCure-S LED curing light	3M ESPE	76985
Eppendorf safe-lock tubes, 1.5mL	Eppendorf	22363204
Ethyl cinnamate, >= 98%	Sigma-aldrich	W243000-1KG-K
Hypodermic Needle, 27G x 1/2''	BD	305109
Ketathesia 100mg/ml	Henry Schein Animal Health	NDC:11695-0702-1
KIMWIPES delicate task wipers	Kimberly-Clark	21905-026 (VWR Catalog number)	Purchased from VWR
LightSheet Z.1 dual illumination microscope system	Zeiss	LightSheet Z.1/LightSheet 7	Used for lightsheet imaging
LSM 880 NLO multi-photon microscope	Zeiss	LSM 880 NLO	Used for two-photon imaging
MEGAmicro, plane, 5mm dia, SS-Thread	Hahnenkratt	6220	Front surface inspectrio mirror
MicroCT machine, MicroXCT-200	Xradia	MICRO XCT-200
Mini-Colibri	Fine Science Tools	17000-01
PermaFlo Flowable Composite	Ultradent	948
Procedure platform	N/A	N/A	Custom-made from lab materials
Routine stereo micscope M80	Leica Micosystems	M80
Sentalloy NiTi open coil spring	TOMY Inc.		A 0.15mm diameter closed NiTi coil with an inner coil diameter of 0.9mm delivers a force of 10g. Similar products can be purchased from Dentsply Sirona.
T-304 stainless steel ligature wire, 0.009'' diameter	Orthodontics	SBLW109	0.009''(.23mm) diameter, Soft temper
X-Ject E (Xylazine) 100mg/ml	Henry Schein Animal Health	NDC:11695-7085-1
Z100 Restorative, A2 shade	3M ESPE	5904A2