下顎マウスモデルにおける歯歯運動中のPDLコラーゲン線維の3Dイメージング

要約

マウスにおける歯の動きを発生させるプロトコルと、歯周靭帯のコラーゲン線維や血管の3D可視化法を、切り離さずに提示する。

要約

歯歯の運動は、外部力の結果として変化した軟部および硬い組織の複雑な生物学的プロセスである。これらの複雑なリモデリングプロセスを理解するためには、歯と歯周組織を3Dコンテキスト内で研究し、断面や組織のアーティファクトを最小限に抑えることが重要です。マウスモデルは、小さなサイズ、高い代謝率、遺伝学、取り扱いの容易さから、発生生物学や構造生物学、バイオメカニクスにも利用されることが多い。原則として、歯科関連研究のための優れたモデルにもなります。しかし、大きな障害は、その小さな歯の大きさ、特に臼歯です。本論文は、マウス下顎臼歯の歯周靭帯線維成分の歯周歯周運動を生成するためのステップ・プロトコルと、3Dイメージングのための2つの方法を提供することを目的としている。最初に提示される方法は、新鮮なコラーゲン組織の位相増強イメージングを可能にするマイクロCTセットアップに基づいています。第2の方法は、切片をかけずに骨を通してイメージングを可能にし、内因性蛍光を保存するエチルシンナメートを用いた骨のクリアリング法である。 Flk1-Creのようなレポーターマウスとこのクリアリング方法を組み合わせる 。TdTomatoは、PDLと歯槽骨の3D血管構造を画像化するその種の機会の最初の機会を提供しました。

概要

歯歯運動(OTM)の基本的な基礎となる生物学的プロセスは骨のリモデリングである。このリモデリングプロセスのトリガは、細胞外マトリックス(ECM)ストレス、壊死、血管破壊および形成^1、2、3などの歯周靭帯(PDL)の構造の変化に起因する。歯槽骨リモデリングの他の可能なトリガーは、骨の骨細胞による力の感知に関連しています, だけでなく、歯槽骨自体の機械的変形;しかし、OTMにおける彼らの役割はまだ完全に解明されていません^4,5.

OTM中のPDLの構造機能関係を明らかにすることを目的とした多くの研究にもかかわらず、明確な機能機構はまだ^6,7に定義されていない。この主な理由は、2つの硬い組織(セメントと歯槽骨)の間にある軟部組織(PDL)のデータを取得する際の課題です。通常、構造情報を収集するメソッドは、PDL 構造を中断および変更する固定と断面化を必要とします。さらに、これらのメソッドのほとんどは、歪んでいなくても部分的な情報とローカライズされた情報のみを提供する2Dデータを生成します。PDLは構造と機能において均一ではないため、歯-PDL-骨複合体全体の無傷の3D構造に対処するアプローチが保証されています。

本論文では、マウスでOTMを生成する方法と、サンプルを切り離さずにPDL内のコラーゲン線維を3D可視化する2つの方法について説明する。

マウスモデルは、医学、発生生物学、薬物送達および構造研究におけるインビボ実験に広く使用されています。彼らは、特定のタンパク質と機能を排除または強化するために遺伝子組み換えすることができます。高速で再現可能で予測可能な開発制御を提供します。彼らはまた、その小さなサイズ8に画像を容易に^.多くの利点にもかかわらず、歯科研究におけるマウスモデルは、特に臨床操作が保証されている場合、主に小さな歯のために頻繁に使用されません。ラット^{9、10、11、}イヌ^12、13、豚^14、15、16およびサル¹⁷などの動物モデルは、マウスよりも頻繁に使用される。近年の高解像度イメージング技術の開発により、マウスモデルを利用してOTMの複雑なプロセスを解読する利点は数多くあります。本論文では、骨のリモデリングを引き起こす一定の力レベルを有する下顎骨の臼歯のメシャル運動を生成する方法を提示する。げっ歯類のOTM実験のほとんどは、下顎骨の移動性と舌の存在が別の複雑性レベルを追加するので、上顎で行われます。しかし、3D構造の完全性が望まれる場合には、下顎が多くの利点を有する。骨全体として簡単に解剖することができます。いくつかの種では、線維性の交付を介して2つの半下顎骨に分離することができます。それは密集し、平らであり、すべての内大なスペースのない歯だけを含んでいる。対照的に、上顎は頭蓋骨の一部であり、他の器官および構造と密接に関連しており、したがって、関連する歯茎骨を関連する歯槽骨を解剖するために広範な断面化が必要である。

位相増強を可能にする高分解能マイクロCT内のローディングシステムに結合した室内湿度室を用いて、先に述べた^とおりに新鮮な繊維組織を3Dで可視化する方法を開発^{しました。}新鮮な組織は、動物が染色や固定なしで犠牲にされた直後にスキャンされ、組織のアーティファクトや生体機械特性の変化を減らします。これらの3Dデータは、他の場所で説明されているように繊維の分布と方向分析に利用することができる^。

ここで紹介する第2の3D組織全体のイメージング方法は、切断することなく骨を通してPDL繊維のイメージングを可能にする下顎骨の光学的なクリアリングに基づいています。興味深いことに、骨自体のコラーゲン線維の視覚化も可能にしますが、ここでは議論されません。一般に、組織をクリアする方法は2つあります。1つ目は、単純な浸漬、過水性またはヒドロゲル埋め込みのいずれかを介して、1.4を超える屈折率を有する水溶液にサンプルが浸漬される水性の洗浄である水性ベースのクリアリングです。しかし、この方法は、組織の構造保存と同様に透明性のレベルに制限され、したがって、組織の固定を必要とします。高透明サンプルを生成し、固定を必要としない第2の方法は、溶媒ベースの清算方法^24,25である。下顎試料に対するエチル-3フェニルプロップ-2-エノエート(エチルシンナメート、ECi)に基づく修飾溶媒ベースのクリアリング法を生成した。この方法は、非毒性食品グレードのクリアリング剤、最小限の組織収縮、および蛍光タンパク質の保存を使用する利点を有する。

プロトコル

すべての動物実験は、NIHの実験動物のケアと使用に関するガイドラインとハーバード大学の施設動物のケアと使用委員会(議定書no.01840)のガイドラインに従って行われました。

1. 歯列歯運動

1. マウスベッドを生成するには、くさび状の45°斜めヘッドレストを備えた平らなプラスチックプラットフォームを使用してください。ヘッドレストはプラスチック製の箱を切断することによって生成することができる。
   1. ヘッドレストとテーブル平面の間に約 30° の角度を生成するには、プラットフォームのヘッドエンドを高くします。曲がった厚いペーパークリップ(直径0.036インチ)をヘッド側端に取り付け、上部の切り傷を保持します。
   2. 尾端に、下部切歯を保持するために矯正パワーチェーンを取り付けることができる高い表面を生成します。プラットフォームの例については 、図 1 を参照してください。
2. 1mLシリンジと27ゲージ針を用いて、キシラジンを10mg/kgで腹腔内注射し、ケタミン100mg/kgでマウスを麻酔します。
3. カスタムメイドのプラットフォーム上に麻酔マウスを配置し、クリップループ上の上部切歯部をフックして上顎を固定します。下側切歯に矯正力チェーンを掛けてマウス下顎を開きます。ミニコリブリの口のレトラクターで頬を引っ込まておいてください。
4. 5-6倍の倍率に達することができる外科顕微鏡または他の任意のステレオスコープの下にプラットホームを置く。
5. 角膜脱水を防ぐために、マウスの目に50μLの生理焼け(約1滴)を塗布します。生理液を20分ごとに補充する。
6. アルミ線(直径0.08mm)の長さ1cmを切ります。近位領域の頬側から、マイクロ外科用針ホルダーを使用して、第1モルと第2モル間の接触点をベローズにスライドさせます。スプリングエンドに通すために、最初の大臼歯の前に2mmの自由なエッジを残します。
7. ニッケルチタン(NiTi)コイルを7~9個の糸で切ります。
   注: コイルの弾性特性は、矯正運動に一定の力を与えます。コイルの訓練されていない全長は、切歯と大臼歯の間のギャップよりも短くする必要があります。歯にコイルを固定するために、両端に余分な2つの糸が必要であることを覚えておいてください。マイクロCTスキャン中にビーム硬化などのスキャンアーティファクトを低減するために、アルミニウム線が選択されます。
8. NiTiコイルスプリング(0.15mm線径、0.9mm内コイル径、10gの力)を下の第1モルと下切歯の間に挿入します。ステップ1.6の最初の大臼歯の周りに挿入されたワイヤ合字を使用して、コイルスプリングの2つのスレッドの周りにワイヤーをしっかりとねじって、大臼歯側にコイルを固定します。
9. 均一な力レベルを確保するために、最初の大臼歯と切歯の間に3つのアクティブな糸を正確に使用します。切り傷から電源チェーンを一時的に取り外し、切り傷部の上に2~3個の緊張していない糸をループしてコイルを固定します。スレッドを切歯のない歯肉マージンまでスライドさせます。
10. 流動性複合樹脂の層をコイルの切口境界に置き、歯科硬化光で硬化させます。樹脂を硬化した後、電源チェーンを交換してください。
11. 同じ硬化光を使用して、NiTiコイルを20sで加熱します。これにより、NiTiコイルが引き締まる。完成した配置は 図1Cを示しています。
12. 反対側をそのままにするか、1番目と2番目の大臼歯の間にワイヤーなどのシャムを挿入します。
13. 麻酔したマウスを加熱した光の下に置き、回復するまでマウスを暖かく保ちます。
14. マウスを個々のケージに戻し、毎日監視します。歯列矯正運動では食事の変化は必要ありません。
    注:一方の側のOTMデバイスは、いくつかの不快感を引き起こすが、供給を損なわない。ただし、両面にデバイスを挿入することは、不快感の追加量のためにお勧めしません。痛みの外向きの兆候が見られない限り、鎮痛薬は必要ありません。

2. 新鮮なヘミ下顎下のPDL繊維のマイクロCTスキャン

1. 半額下顎下を取り付ける (図 2)
   1. 矯正運動の所望の持続時間の後、頸部脱臼を介してマウスを犠牲にする。下顎を取り除き、半顎に分離します。
      注:サンプルは固定されないので、顎の解剖と取り付けをできるだけ早く行うことが重要です(理想的には30分以内)。
   2. 清潔な糸くずのない拭き取りで、周囲の軟部組織を優しく取り除きます。
   3. 少なくとも4倍の倍率で、マイクロサージカルハサミとピンセットを使用して矯正装置を立体顕微鏡で取り外します。
   4. 1.5 mLの体積、マイクロ遠心分離チューブに、水で湿らせた糸くずのないワイプの一部にサンプル湿潤を保ちます。
   5. パック可能な歯科用複合樹脂をステージ上のサンプルスロットに入れ、フレッシュなヘミ下顎を複合材料に入れます。取り付ける前に、歯科用複合材料と接触する骨表面が軟組織から解放され、乾燥していることを確認してください。
   6. 最初の大臼歯がステージの正中溝に中央に配置されるまで、半顎の位置を調整します。咬合面が水平であることを確認します。位置決めに満足したら、複合材料を硬化させます。
      注:少量の歯科複合材料を、試料の安定化に役立てるには、半口下顎の側面や切り傷を横切って置くことができます。
   7. 湿らせた糸くずのないワイプをサンプルステージの湿度プール内に入れてください。歯科用複合材料を第1大臼歯の咬合面に置く。チャンバーを閉じる前に、標本レベルでX線経路を妨げないようにしてください。
   8. マイクロCTにチャンバーを貼り付ける。イメージング中の動きを最小限に抑えるように、チャンバーをマイクロCTサンプルステージにねじ込みます。
   9. X線をオンにし、アンビルの先端が複合材料で囲まれるが、力の増加が検出されないまで、アンビルを垂直に下げながら2D画像を撮影します。
   10. 複合材料にアンビルが埋め込まれたら、X線源を閉じます。次に、マイクロCTチャンバーを開き、透明なプレキシガラス窓から複合体を硬化させます。
2. マイクロCT設定
   1. ソース電圧を40kVに、電流を200μAに設定し、10倍の倍率検出器を使用して、サンプルを視野の枠内に配置します。キャプチャした画像には 2 のビン分割を使用します。
      注: PDL は骨や歯に比べて密度が著しく低いため、PDL の視覚化には電力と露出時間が長く必要です。このプロトコルは、PDL を視覚化するための設定を提供します。
   2. 単一画像の露出時間を 25 s に設定します。サンプルステージの回転角度を183度以上に設定します。2500 の投影のスキャンを設定します。X線源フィルターを使用しない場合、結果として得られるスキャンの両側に0.76 μmのボクセルサイズがあります。
   3. マイクロCTガイドラインに従って、適切な再構築のための参照スキャンを収集します。総投影として参照画像の 1/3 数を使用します。バックプロジェクションフィルターアルゴリズムを使用して、追加のビニングなしでボリュームを再構築します。

3. 消し方 (図 3)

1. 5つの1.5 mLマイクロ遠心分離管を準備します。
2. 1.5 mLマイクロ遠心分離管で、1.4 mLの溶液を調製します:4%パラホルムアルデヒド(PFA)をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に、50%エタノール(EtOH)を脱イオン(DI)水に、DI水中で70%EtOH、および2つのチューブ100%EtOHで調製します。
   注: PFA はサンプルの固定に使用されます。ECi クリアリングは、固定されていないサンプルでも機能します。固定されていないサンプルをクリアするには、PFA ステップをスキップします。
3. 4%PFAに解剖されたヘミ下顎を置く。アルミホイルで覆い、6時間室温で穏やかな設定でロッカーの上に置きます。
4. 半減虫を50%EtOHに移動します。光から覆われたロッカーの上に16時間置きます。
5. 半減虫を70%EtOHに移動します。光から覆われたロッカーの上に16時間置きます。
6. 半減虫を100%EtOHに移動します。光から覆われたロッカーの上に16時間置きます。
7. 3.6 を繰り返します。第2の100%EtOHの管で。
8. ガラスまたはポリプロピレンチューブに5 mLのECiを用意します。
   注:ECiはポリスチレンを溶解しますが、ポリプロピレンは溶解しません。また、蛍光タンパク質を有する組織を用いなければ、試料は、クリア処理時に光にさらされ得る。
9. 半位取り可能なチューブをECiチューブに移動します。チューブをアルミホイルで覆い、ロッカーの上に12時間以上穏やかな設定で置きます。
   注: プロトコルはここで一時停止することができます。脱水サンプルは、室温でECiに保存することができます。ECiの凍結または融点は6.5〜8.0°Cである。 4°Cで保管しないでください。
10. 半顎下は蛍光顕微鏡での画像作成の準備ができている。
    注: イメージング中は、光学的に透明な状態を保つために、サンプルを ECi に浸す必要があります。

結果

本論文では、OTMを作製する方法と、断面を全くつけずにPDL内部のコラーゲン繊維を3Dイメージングする方法を2つ紹介する。動物研究のために、歯の整列が必要でない場合、歯の動きは、すべての根のレベルで歯槽骨の改造を生成する場合、矯正と見なされます。信頼性の高いOTMを生成するためには、歯に適用される一定の力レベルが必要です。ここで、活性化された形状記憶NiTiコイルは、7?...

ディスカッション

マウスでOTMを生成することは、サイズ、遺伝学および取り扱いの利点のために非常に望ましい。下顎薬を使用すると、組織解剖の点で簡単に処理できるだけでなく、サンプル調製物およびイメージングを提供します。ここでは、OTMの7日以内に骨の中の歯の移動運動を伴うOTMを生成する方法を提示した。このプロトコルを使用すると、活性化コイルが約1mmまでの動きのための一定の力レベルを...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-mL BD Luer-Lok syringe	BD	309628
1X phosphate buffered saline	VWR Life Sciences	0780-10L
200 proof ethanol	VWR Life Sciences	V1016
Aluminum alloy 5019 wire	Sigma-aldrich	GF15828813	0.08 mm diameter wire, length 100th, temper hard. Used as wire ligature around molar.
Avizo 9.7	Thermo Fisher Scientific	N/A	Used to analyze microCT scans
Castroviejo Micro Needle Holders	Fine Science Tools	12060-01
Clr Plan-Apochromat 20x/1.0,CorrVIS-IR M27 85mm	Zeiss	N/A	Used for second harmonic generation imaging
Cone socket handle, single ended, hand-form	G.Hartzell and son	126-CSH3	Handle of the inspection mirror
EC Plan-Neofluar 5x/0.16	Zeiss	440321-9902	Used for light-sheet imaging
Elipar DeepCure-S LED curing light	3M ESPE	76985
Eppendorf safe-lock tubes, 1.5mL	Eppendorf	22363204
Ethyl cinnamate, >= 98%	Sigma-aldrich	W243000-1KG-K
Hypodermic Needle, 27G x 1/2''	BD	305109
Ketathesia 100mg/ml	Henry Schein Animal Health	NDC:11695-0702-1
KIMWIPES delicate task wipers	Kimberly-Clark	21905-026 (VWR Catalog number)	Purchased from VWR
LightSheet Z.1 dual illumination microscope system	Zeiss	LightSheet Z.1/LightSheet 7	Used for lightsheet imaging
LSM 880 NLO multi-photon microscope	Zeiss	LSM 880 NLO	Used for two-photon imaging
MEGAmicro, plane, 5mm dia, SS-Thread	Hahnenkratt	6220	Front surface inspectrio mirror
MicroCT machine, MicroXCT-200	Xradia	MICRO XCT-200
Mini-Colibri	Fine Science Tools	17000-01
PermaFlo Flowable Composite	Ultradent	948
Procedure platform	N/A	N/A	Custom-made from lab materials
Routine stereo micscope M80	Leica Micosystems	M80
Sentalloy NiTi open coil spring	TOMY Inc.		A 0.15mm diameter closed NiTi coil with an inner coil diameter of 0.9mm delivers a force of 10g. Similar products can be purchased from Dentsply Sirona.
T-304 stainless steel ligature wire, 0.009'' diameter	Orthodontics	SBLW109	0.009''(.23mm) diameter, Soft temper
X-Ject E (Xylazine) 100mg/ml	Henry Schein Animal Health	NDC:11695-7085-1
Z100 Restorative, A2 shade	3M ESPE	5904A2