3D-визуализация коллагеновых волокон PDL во время ортодонтического движения зубов в модели нижнечелюстной мыши

Резюме

Представлен протокол генерации ортодонтического движения зубов у мышей и методы 3D визуализации коллагеновых волокон и кровеносных сосудов пародонтальной связки без сечения.

Аннотация

Ортодонтическое движение зубов представляет собой сложный биологический процесс изменения ремоделирования мягких и твердых тканей в результате внешних сил. Чтобы понять эти сложные процессы ремоделирования, крайне важно изучить ткани зуба и пародонта в их 3D-контексте и, следовательно, свести к минимуму любые сечения и тканевые артефакты. Мышиные модели часто используются в биологии развития и структурной биологии, а также в биомеханике из-за их небольшого размера, высокой скорости метаболизма, генетики и простоты обращения. В принципе, это также делает их отличными моделями для стоматологических исследований. Однако основным препятствием является их небольшой размер зубов, в частности моляров. Данная работа направлена на предоставление пошагового протокола генерации ортодонтического движения зуба и двух методов 3D-визуализации фиброзного компонента пародонтальной связки мышиного моляра нижней части. Первый представленный метод основан на микро-КТ-установке, позволяющей фазовую визуализацию свежих коллагеновых тканей. Второй метод представляет собой метод очистки кости с использованием этилциннамата, который позволяет визуализировать кость без сечения и сохраняет эндогенную флуоресценцию. Сочетание этого метода очистки с репортерными мышами, такими как Flk1-Cre; TdTomato предоставил первую в своем роде возможность изобизировать 3D-сосудистую в PDL и альвеолярной кости.

Введение

Основным биологическим процессом в ортодонтическом движении зубов (OTM) является ремоделирование кости. Триггер для этого процесса ремоделирования приписывается изменениям в структуре пародонтальной связки (PDL), таким как напряжение внеклеточного матрикса (ECM), некроз, а также разрушение кровеносных сосудов и образование^1,2,3. Другие возможные триггеры для ремоделирования альвеолярной кости связаны с зондированием силы остеоцитами в кости, а также механической деформацией самой альвеолярной кости; однако их роль в ОТМ до сих пор до конца не выяснена⁴....

протокол

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с Руководящими принципами NIH по уходу за лабораторными животными и их использованию и руководящими принципами Комитета по институциональному уходу за животными и их использованию Гарвардского университета (Протокол No 01840).

1. Ортодонтическое движение зубов

1. Чтобы создать кровать для мыши, используйте плоскую пластиковую платформу с клиновидным подголовником под углом 45 °. Подголовник может быть получен путем разрезания пластиковой коробки.
   1. Поднимите головной конец платформы, чтобы создать угол примерно 30° между подголовником и плоскостью стола. Прикрепите изогнут....

Результаты

В этой статье представлен метод получения OTM, а также два метода для 3D-визуализации коллагеновых волокон внутри PDL без какого-либо сечения. Для целей исследования на животных, когда выравнивание зубов не требуется, движение зуба считается ортодонтическим, если оно генерирует ремоделиро.......

Обсуждение

Генерация OTM у мышей очень желательна из-за размера, генетики и преимуществ обработки. Использование мандиблы обеспечивает простоту обращения как с точки зрения рассечения тканей, так и с точки зрения подготовки образцов и визуализации. Здесь мы представили метод генерации OTM с трансля.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-mL BD Luer-Lok syringe	BD	309628
1X phosphate buffered saline	VWR Life Sciences	0780-10L
200 proof ethanol	VWR Life Sciences	V1016
Aluminum alloy 5019 wire	Sigma-aldrich	GF15828813	0.08 mm diameter wire, length 100th, temper hard. Used as wire ligature around molar.
Avizo 9.7	Thermo Fisher Scientific	N/A	Used to analyze microCT scans
Castroviejo Micro Needle Holders	Fine Science Tools	12060-01
Clr Plan-Apochromat 20x/1.0,CorrVIS-IR M27 85mm	Zeiss	N/A	Used for second harmonic generation imaging
Cone socket handle, single ended, hand-form	G.Hartzell and son	126-CSH3	Handle of the inspection mirror
EC Plan-Neofluar 5x/0.16	Zeiss	440321-9902	Used for light-sheet imaging
Elipar DeepCure-S LED curing light	3M ESPE	76985
Eppendorf safe-lock tubes, 1.5mL	Eppendorf	22363204
Ethyl cinnamate, >= 98%	Sigma-aldrich	W243000-1KG-K
Hypodermic Needle, 27G x 1/2''	BD	305109
Ketathesia 100mg/ml	Henry Schein Animal Health	NDC:11695-0702-1
KIMWIPES delicate task wipers	Kimberly-Clark	21905-026 (VWR Catalog number)	Purchased from VWR
LightSheet Z.1 dual illumination microscope system	Zeiss	LightSheet Z.1/LightSheet 7	Used for lightsheet imaging
LSM 880 NLO multi-photon microscope	Zeiss	LSM 880 NLO	Used for two-photon imaging
MEGAmicro, plane, 5mm dia, SS-Thread	Hahnenkratt	6220	Front surface inspectrio mirror
MicroCT machine, MicroXCT-200	Xradia	MICRO XCT-200
Mini-Colibri	Fine Science Tools	17000-01
PermaFlo Flowable Composite	Ultradent	948
Procedure platform	N/A	N/A	Custom-made from lab materials
Routine stereo micscope M80	Leica Micosystems	M80
Sentalloy NiTi open coil spring	TOMY Inc.		A 0.15mm diameter closed NiTi coil with an inner coil diameter of 0.9mm delivers a force of 10g. Similar products can be purchased from Dentsply Sirona.
T-304 stainless steel ligature wire, 0.009'' diameter	Orthodontics	SBLW109	0.009''(.23mm) diameter, Soft temper
X-Ject E (Xylazine) 100mg/ml	Henry Schein Animal Health	NDC:11695-7085-1
Z100 Restorative, A2 shade	3M ESPE	5904A2