3D-Bildgebung von PDL-Kollagenfasern während kieferorthopädischer Zahnbewegungen im Unterkiefermine modell

Zusammenfassung

Wir präsentieren ein Protokoll zur Erzeugung kieferorthopädischer Zahnbewegungen bei Mäusen und Methoden zur 3D-Visualisierung der Kollagenfasern und Blutgefäße von Parodontalbändern ohne Schnitt.

Zusammenfassung

Kieferorthopädische Zahnbewegung ist ein komplexer biologischer Prozess des veränderten Weich- und Hartgewebeumbaus als Folge äußerer Kräfte. Um diese komplexen Umbauprozesse zu verstehen, ist es wichtig, das Zahn- und Parodontalgewebe in ihrem 3D-Kontext zu untersuchen und somit Schnitte und Gewebeartefakte zu minimieren. Mausmodelle werden aufgrund ihrer geringen Größe, hohen Stoffwechselrate, Genetik und einfachen Handhabung häufig in der Entwicklungs- und Strukturbiologie sowie in der Biomechanik eingesetzt. Prinzipiell sind sie damit auch hervorragende Modelle für zahnärztliche Studien. Ein großes Hindernis ist jedoch ihre geringe Zahngröße, insbesondere die Backenzähne. Dieses Papier zielt darauf ab, ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Erzeugung kieferorthopädischer Zahnbewegungen und zwei Methoden zur 3D-Bildgebung der parodontalen Bandfaserkomponente eines Maus-Unterkiefermolaren bereitzustellen. Die erste vorgestellte Methode basiert auf einem Mikro-CT-Setup, das die Phasenverstärkungsbildgebung von frischem Kollagengewebe ermöglicht. Die zweite Methode ist eine Knochenreinigungsmethode mit Ethylzimt, die eine Bildgebung durch den Knochen ohne Schnitt ermöglicht und die endogene Fluoreszenz bewahrt. Kombination dieser Clearing-Methode mit Reportermäusen wie Flk1-Cre; TdTomato bot eine erste Gelegenheit seiner Art, das 3D-Gefäßsystem in der PDL und im Alveolarknochen abbilden zu können.

Einleitung

Der grundlegende biologische Prozess in der kieferorthopädischen Zahnbewegung (OTM) ist der Knochenumbau. Der Auslöser für diesen Umbauprozess wird auf Veränderungen in der Struktur des Parodontalbandes (PDL) wie extrazellulären Matrix (ECM) Stress, Nekrose sowie Blutgefäßzerstörung und -bildung zurückgeführt^1,2,3. Andere mögliche Auslöser für den Alveolarknochenumbau sind die Krafterfassung durch Osteozyten im Knochen sowie die mechanische Verformung des Alveolarknochens selbst; ihre Rolle im OTM ist jedoch noch nicht vollständig aufgeklärt^4,5.

Trotz vieler Studien, die darauf abzielten, Struktur-Funktions-Beziehungen der PDL während der OTM aufzudecken, muss noch ein klarer funktioneller Mechanismus definiert werden^6,7. Der Hauptgrund dafür ist die Herausforderung, Daten eines Weichgewebes (PDL) zwischen zwei Hartgeweben (Zement und Alveolarknochen) abzurufen. Die akzeptierten Methoden zum Sammeln von Strukturinformationen erfordern in der Regel Fixierungen und Abschnitte, die die PDL-Struktur stören und modifizieren. Darüber hinaus liefern die meisten dieser Methoden 2D-Daten, die, selbst wenn sie nicht verzerrt sind, nur teilweise und lokalisierte Informationen liefern. Da die PDL in ihrer Struktur und Funktion nicht einheitlich ist, ist ein Ansatz gerechtfertigt, der die intakte 3D-Struktur des gesamten Zahn-PDL-Knochenkomplexes adressiert.

In diesem Artikel werden eine Methode zur Erzeugung eines OTM in Mäusen und zwei Methoden beschrieben, die eine 3D-Visualisierung der Kollagenfasern in der PDL ohne Schnitt der Probe ermöglichen.

Murine Modelle werden häufig für In-vivo-Experimente in der Medizin, Entwicklungsbiologie, Medikamentenabgabe und Strukturstudien verwendet. Sie können genetisch verändert werden, um bestimmte Proteine und Funktionen zu eliminieren oder zu verbessern. sie bieten eine schnelle, wiederholbare und vorhersehbare Entwicklungskontrolle; Sie sind auch aufgrund ihrer geringen Größe 8 leicht^abbildbar. Trotz ihrer vielen Vorteile werden Mausmodelle in der Zahnforschung nicht häufig eingesetzt, insbesondere wenn klinische Manipulationen gerechtfertigt sind, meist aufgrund der kleinen Zähne. Tiermodelle wie Ratten^9,10,11, Hunde^12,13, Schweine^14,15,16 und Affen¹⁷ werden häufiger als Mäuse verwendet. Mit der jüngsten Entwicklung hochauflösender bildgebungsähnlicher Verfahren sind die Vorteile der Verwendung eines Mausmodells zur Entschlüsselung der verworrenen Prozesse im OTM zahlreich. Dieser Artikel stellt eine Methode vor, um eine mesiale Bewegung des Backenzahns im Unterkiefer mit konstanten Kraftniveaus zu erzeugen, die einen Knochenumbau auslösen. Die meisten OTM-Experimente an Nagetieren werden im Oberkiefer durchgeführt, da die Beweglichkeit des Unterkiefers und das Vorhandensein der Zunge eine weitere Komplexitätsebene hinzufügen. Der Unterkiefer hat jedoch viele Vorteile, wenn strukturelle 3D-Integrität gewünscht wird. Es kann leicht als ganzer Knochen seziert werden; bei einigen Arten kann es durch die faserige Symphyse in zwei Hemi-Unterkiefer getrennt werden; es ist kompakt, flach und enthält nur die Zähne ohne Sinusräume. Im Gegensatz dazu ist der Oberkiefer ein Teil des Schädels und eng mit anderen Organen und Strukturen verwandt, so dass umfangreiche Schnitte erforderlich sind, um den Alveolarknochen mit den zugehörigen Zähnen zu sezieren.

Unter Verwendung einer hauseigenen Feuchtigkeitskammer, die mit einem Beladungssystem in einem hochauflösenden Mikro-CT gekoppelt ist, das eine Phasenverstärkung ermöglicht, haben wir eine Methode entwickelt, um frisches faseriges Gewebe in 3D zu^{visualisieren,}wie zuvor beschrieben^{9,18 , 19},^20,21,22,23. Frisches Gewebe wird unmittelbar nach dem Opfer des Tieres ohne Färbung oder Fixierung gescannt, was Gewebeartefakte sowie Veränderungen der biomechanischen Eigenschaften reduziert. Diese 3D-Daten können für Verteilungs- und Richtungsanalysen der Fasern wie an anderer Stelle beschrieben verwendet werden¹⁹.

Die zweite hier vorgestellte 3D-Ganzgewebsbildgebungsmethode basiert auf der optischen Reinigung des Unterkiefers, die eine Bildgebung der PDL-Fasern durch den Knochen ohne Schnittbildung ermöglicht. Interessanterweise ermöglicht es auch die Visualisierung der Kollagenfasern des Knochens selbst, dies wird hier jedoch nicht diskutiert. Im Allgemeinen gibt es zwei Methoden zur Gewebereinigung. Die erste ist die wässrige Reinigung, bei der die Probe in eine wässrige Lösung mit einem Brechungsindex von mehr als 1,4 getaucht wird, entweder durch einfaches Eintauchen, Hyperhydratation oder Hydrogeleinbettung. Diese Methode ist jedoch sowohl in der Transparenz als auch in der strukturellen Erhaltung des Gewebes begrenzt und erfordert daher eine Fixierung des Gewebes. Das zweite Verfahren, das hochtransparente Proben liefert und keine Fixierung erfordert, ist das lösungsmittelbasierte Clearingverfahren^24,25. Für die Unterkieferproben haben wir ein modifiziertes lösemittelbasiertes Clearingverfahren auf Basis von Ethyl-3-phenylprop-2-enoat (Ethylzimt, ECi) erstellt. Diese Methode hat die Vorteile der Verwendung von ungiftigem Clearingmittel in Lebensmittelqualität, minimaler Gewebeschrumpfung und Konservierung von fluoreszierenden Proteinen.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den NIH-Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren und den Richtlinien des Harvard University Institutional Animal Care and Use Committee (Protokoll Nr. 01840) durchgeführt.

1. Kieferorthopädische Zahnbewegung

1. Um ein Mausbett zu erzeugen, verwenden Sie eine flache Kunststoffplattform mit einer keilförmigen, um 45 ° abgewinkelten Kopfstütze. Die Kopfstütze kann durch Schneiden einer Kunststoffbox erzeugt werden.
   1. Heben Sie das Kopfende der Plattform an, um einen Winkel von etwa 30 ° zwischen der Kopfstütze und der Tischebene zu erzeugen. Befestigen Sie eine gebogene dicke Büroklammer (0,036" Durchmesser) am Kopfseitenende, um die oberen Schneidezähne zu halten.
   2. Erzeugen Sie am Heck eine erhöhte Oberfläche, an der eine kieferorthopädische Stromkette befestigt werden kann, um die unteren Schneidezähne zu halten. Eine Beispielplattform finden Sie in Abbildung 1.
2. Anästhesie der Maus durch intraperitoneale Injektion von Xylazin bei 10 mg/kg und Ketamin 100 mg/kg mit 1 ml Spritze und einer 27 Gauge Nadel.
3. Legen Sie die betäubte Maus auf eine maßgeschneiderte Plattform und immobilisieren Sie den Oberkiefer, indem Sie die oberen Schneidezähne an der Büroklammerschlaufe einhaken. Öffnen Sie den Unterkiefer der Maus mit der kieferorthopädischen Stromkette, die an den unteren Schneidezähnen eingehakt ist. Halten Sie die Wangen mit dem Mini-Colibri-Mundretraktor eingezogen.
4. Legen Sie die Plattform unter ein Operationsmikroskop oder ein anderes Stereoskop, das eine 5-6-fache Vergrößerung erreichen kann.
5. Tragen Sie 50 μL Kochsalzlösung (ca. 1 Tropfen) auf die Mausaugen auf, um eine Hornhautaustrocknung zu verhindern. Salzhaltige Linie alle 20 Minuten auffüllen.
6. Schneiden Sie ein Stück eines Aluminiumdrahtes (0,08 mm Durchmesser) von 1 cm Länge. Schieben Sie den Draht von der Wangenseite lingual im interproximalen Bereich unterhalb des Kontaktpunkts zwischen dem ersten und zweiten Backenzähnen mit einem mikrochirurgischen Nadelhalter. Lassen Sie 2 mm freie Kante vor dem ersten Backenzahn, um in das Federende eingefädelt zu werden.
7. Schneiden Sie ein Stück Nickel-Titan (NiTi) -Spule, etwa 7 bis 9 Fäden lang.
   HINWEIS: Die elastischen Eigenschaften der Spule sorgen für eine konstante Kraft für kieferorthopädische Bewegungen. Die gesamte ungespannte Länge der Spule sollte kürzer sein als der Spalt zwischen dem Schneidezahn und dem Backenzahn. Denken Sie daran, dass an jedem Ende zusätzliche 2 Fäden benötigt werden, um die Spule am Zahn zu verankern. Aluminiumdraht wird ausgewählt, um Scanartefakte wie Strahlhärtung während des Mikro-CT-Scans zu reduzieren.
8. Einsetzen NiTi Schraubenfeder (0,15 mm Drahtdurchmesser, 0,9 mm Innendurchmesser der Spule; liefert eine Kraft von 10 g) zwischen unterem ersten Backenzahn und unterem Schneidezahn. Verwenden Sie die Drahtligatur, die in Schritt 1.6 um den ersten Backenzahn eingeführt wurde, und drehen Sie den Draht fest um 2 Gewinde der Schraubenfeder, um die Spule auf der molaren Seite zu fixieren.
9. Um ein gleichmäßiges Kraftniveau zu gewährleisten, verwenden Sie genau 3 aktive Gewinde zwischen dem ersten Backenzahn und dem Schneidezahn. Entfernen Sie vorübergehend die Stromkette vom Schneidestift und schleifen Sie 2 bis 3 ungeübte Gewinde über den Schneideplan, um die Spule zu verankern. Schieben Sie die Fäden bis zum schneidebogenfreien Zahnfleischrand nach unten.
10. Legen Sie eine Schicht aus fließfähigem Kompositharz auf den Schneiderand der Spule und härten Sie sie mit Zahnhärtelicht aus. Ersetzen Sie die Stromkette nach dem Aushärten des Harzes.
11. Erhitzen Sie die NiTi-Spule mit dem gleichen Aushärtungslicht für 20 s. Dadurch wird die NiTi-Spule festgezogen. Die fertige Platzierung ist in Abbildung 1C dargestellt.
12. Lassen Sie entweder die kontralaterale Seite intakt oder führen Sie einen Schein wie den Draht zwischen dem ersten und zweiten Backenzähnen ein.
13. Legen Sie die betäubte Maus unter ein erhitztes Licht, um die Maus bis zur Genesung warm zu halten.
14. Setzen Sie die Maus wieder in einen einzelnen Käfig und überwachen Sie sie täglich. Während der kieferorthopädischen Bewegung ist keine Ernährungsumstellung notwendig.
    HINWEIS: OtM-Gerät auf einer Seite verursacht einige Beschwerden, beeinträchtigt aber nicht die Fütterung. Das Einsetzen von Geräten auf beiden Seiten wird jedoch aufgrund der zusätzlichen Beschwerden nicht empfohlen. Schmerzmittel sind nicht notwendig, es sei denn, äußere Anzeichen von Schmerzen werden gesehen.

2. Mikro-CT-Scan von PDL-Fasern in frischen Hemi-Unterkiefern

1. Montage des Halbmischiblen (Abbildung 2)
   1. Nach der gewünschten Dauer der kieferorthopädischen Bewegung opfern Sie die Maus durch zervikale Luxation. Entfernen Sie den Unterkiefer und trennen Sie ihn in Hemi-Unterkiefer.
      HINWEIS: Da die Probe nicht fixiert wird, ist es wichtig, die Dissektion der Backe und die Montage so schnell wie möglich durchzuführen, idealerweise innerhalb von 30 Minuten.
   2. Entfernen Sie das umgebende Weichgewebe vorsichtig mit einem sauberen fusselfreien Tuch.
   3. Entfernen Sie das kieferorthopädische Gerät mit einer mikrochirurgischen Schere und Pinzette unter einem Stereomikroskop mit mindestens 4-facher Vergrößerung.
   4. Halten Sie die Probe feucht in einem Mikrozentrifugenröhrchen mit 1,5 ml Volumen und einem stück fusselfreiem Tuch, das mit Wasser angefeuchtet ist.
   5. Legen Sie packbares Dentalverbundharz in den Probenschlitz auf der Bühne und legen Sie dann den frischen Hemi-Unterkiefer in den Verbundwerkstoff. Stellen Sie vor der Montage sicher, dass die Knochenoberfläche in Kontakt mit dem Dentalkomposit frei von Weichteilen und trocken ist, da sonst der Dentalkomposit nicht richtig aushärtet.
   6. Stellen Sie die Position des Hemi-Unterkiefers ein, bis der erste Backenzahn an der Mittellinienrille der Bühne zentriert ist. Stellen Sie sicher, dass die Okklusionsoberfläche horizontal ist. Härten Sie den Verbundwerkstoff aus, wenn Er mit der Positionierung zufrieden ist.
      HINWEIS: Zusätzliche kleine Mengen an Dentalkompositen können an den Seiten des Hemi-Unterkiefers und / oder über den Schneidezahn gelegt werden, um die Stabilisierung der Probe zu unterstützen.
   7. Legen Sie das feuchte fusselfreie Tuch in die Feuchtigkeitspools in der Probenphase. Legen Sie den Dentalkomposit auf die Okklusionsoberfläche des ersten Backenzahns. Bevor Sie die Kammer schließen, stellen Sie sicher, dass nichts den Röntgenweg auf Probenebene blockiert.
   8. Befestigen Sie die Kammer im Mikro-CT. Schrauben Sie die Kammer in den Mikro-CT-Probenstand, so dass die Bewegung während der Bildgebung minimiert wird.
   9. Schalten Sie die Röntgenbilder ein und machen Sie 2D-Bilder, während Sie den Amboss vertikal absenken, bis die Spitze des Ambosses vom Komposit umgeben ist, aber keine Zunahme der Kraft festgestellt wird.
   10. Sobald der Amboss in das Komposit eingebettet ist, schließen Sie die Röntgenquelle. Öffnen Sie dann die Mikro-CT-Kammer und härten Sie den Verbundwerkstoff durch das klare Plexiglasfenster aus.
2. Mikro-CT-Einstellungen
   1. Stellen Sie die Quellspannung auf 40 kV und den Strom auf 200 μA ein. Positionieren Sie die Probe mit einem 10-fachen Vergrößerungsdetektor innerhalb des Sichtrahmens. Verwenden Sie binning von 2 für die aufgenommenen Bilder.
      HINWEIS: Da die PDL deutlich weniger dicht ist als Knochen und Zahn, erfordert die Visualisierung der PDL eine höhere Leistung und Belichtungszeit. Dieses Protokoll stellt Einstellungen für die Visualisierung der PDL zur Verfügung.
   2. Stellen Sie die Belichtungszeit für ein einzelnes Bild auf 25 s ein. Stellen Sie die Drehung des Probentsatzes auf einen Bereich von 183 Grad oder mehr ein. Legen Sie den Scan für 2500 Projektionen fest. Verwenden Sie keinen Röntgenquellenfilter, die resultierenden Scans haben auf jeder Seite eine Voxelgröße von 0,76 μm.
   3. Sammeln Sie einen Referenzscan für die korrekte Rekonstruktion gemäß den Mikro-CT-Richtlinien. Verwenden Sie 1/3 Anzahl der Referenzbilder als Gesamtprojektionen. Rekonstruieren Sie das Volumen ohne zusätzliches Binning mithilfe eines gefilterten Algorithmus für die Rückprojektion.

3. Clearing-Methode (Abbildung 3)

1. Bereiten Sie fünf 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen vor.
2. 1,4 ml der folgenden Lösungen werden in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen hergestellt: 4% Paraformaldehyd (PFA) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), 50% Ethanol (EtOH) in entionisiertem (DI) Wasser, 70% EtOH in DI-Wasser und zwei Röhrchen mit 100% EtOH.
   HINWEIS: PFA wird zur Fixierung der Probe verwendet. Das ECi-Clearing funktioniert auch bei nicht fixierten Proben. Um nicht fixierte Proben zu löschen, überspringen Sie einfach den PFA-Schritt.
3. Sezierten Hemi-Unterkiefer in 4% PFA platzieren. Mit Alufolie abdecken und bei sanfter Einstellung bei Raumtemperatur für 6 h auf die Wippe legen.
4. Bewegen Sie den Hemi-Unterkiefer auf 50% EtOH. Legen Sie es für 16 h auf die mit Licht bedeckte Wippe.
5. Bewegen Sie den Hemi-Unterkiefer auf 70% EtOH. Legen Sie es für 16 h auf die mit Licht bedeckte Wippe.
6. Bewegen Sie den Hemi-Unterkiefer auf 100% EtOH. Legen Sie es für 16 h auf die mit Licht bedeckte Wippe.
7. Wiederholen Sie 3.6. in der zweiten 100% EtOH-Röhre.
8. Bereiten Sie 5 ml ECi in einem Glas- oder Polypropylenrohr vor.
   HINWEIS: ECi löst Polystyrol, aber kein Polypropylen. Wenn kein Gewebe mit fluoreszierenden Proteinen verwendet wird, kann die Probe während des Clearing-Verfahrens Licht ausgesetzt werden.
9. Bewegen Sie den Hemi-Unterkiefer in das ECi-Rohr. Decken Sie das Rohr mit Aluminiumfolie ab und legen Sie es bei sanfter Einstellung für mindestens 12 h auf die Wippe.
   HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden. Dehydrierte Proben können in ECi bei Raumtemperatur gelagert werden. Der Gefrier- bzw. Schmelzpunkt von ECi liegt bei 6,5 bis 8,0 °C. Nicht bei 4 °C lagern.
10. Der Hemi-Unterkiefer ist bereit für die Bildgebung mit dem Fluoreszenzmikroskop.
    HINWEIS: Während der Bildgebung muss die Probe in den ECi eingetaucht werden, um optisch transparent zu bleiben.

Ergebnisse

Dieser Artikel stellt eine Methode zur Herstellung von OTM sowie zwei Methoden zur 3D-Bildgebung von Kollagenfasern innerhalb der PDL ohne Schnitte vor. Für Tierversuchszwecke gilt eine Zahnbewegung, wenn eine Ausrichtung der Zähne nicht notwendig ist, als kieferorthopädisch, wenn sie einen Umbau des Alveolarknochens auf allen Wurzelebenen erzeugt. Um ein zuverlässiges OTM zu erzeugen, ist ein konstantes Kraftniveau auf die Zähne erforderlich. Hier wird eine aktivierte Formgedächtnis-NiTi-Spule verwendet, um eine k...

Diskussion

Die Erzeugung von OTM bei Mäusen ist aufgrund der Größe, Genetik und Handhabungsvorteile sehr erwünscht. Die Verwendung des Unterkiefers bietet eine einfache Handhabung sowohl in Bezug auf die Gewebedissektion als auch auf die Probenvorbereitung und Bildgebung. Hier haben wir eine Methode vorgestellt, um OTM mit translationaler Bewegung des Zahnes im Knochen innerhalb von 7 Tagen nach OTM zu erzeugen. Mit diesem Protokoll kann die Gesamtdauer der Zahnbewegung verlängert werden, da die aktivierte Spule ein konstantes...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-mL BD Luer-Lok syringe	BD	309628
1X phosphate buffered saline	VWR Life Sciences	0780-10L
200 proof ethanol	VWR Life Sciences	V1016
Aluminum alloy 5019 wire	Sigma-aldrich	GF15828813	0.08 mm diameter wire, length 100th, temper hard. Used as wire ligature around molar.
Avizo 9.7	Thermo Fisher Scientific	N/A	Used to analyze microCT scans
Castroviejo Micro Needle Holders	Fine Science Tools	12060-01
Clr Plan-Apochromat 20x/1.0,CorrVIS-IR M27 85mm	Zeiss	N/A	Used for second harmonic generation imaging
Cone socket handle, single ended, hand-form	G.Hartzell and son	126-CSH3	Handle of the inspection mirror
EC Plan-Neofluar 5x/0.16	Zeiss	440321-9902	Used for light-sheet imaging
Elipar DeepCure-S LED curing light	3M ESPE	76985
Eppendorf safe-lock tubes, 1.5mL	Eppendorf	22363204
Ethyl cinnamate, >= 98%	Sigma-aldrich	W243000-1KG-K
Hypodermic Needle, 27G x 1/2''	BD	305109
Ketathesia 100mg/ml	Henry Schein Animal Health	NDC:11695-0702-1
KIMWIPES delicate task wipers	Kimberly-Clark	21905-026 (VWR Catalog number)	Purchased from VWR
LightSheet Z.1 dual illumination microscope system	Zeiss	LightSheet Z.1/LightSheet 7	Used for lightsheet imaging
LSM 880 NLO multi-photon microscope	Zeiss	LSM 880 NLO	Used for two-photon imaging
MEGAmicro, plane, 5mm dia, SS-Thread	Hahnenkratt	6220	Front surface inspectrio mirror
MicroCT machine, MicroXCT-200	Xradia	MICRO XCT-200
Mini-Colibri	Fine Science Tools	17000-01
PermaFlo Flowable Composite	Ultradent	948
Procedure platform	N/A	N/A	Custom-made from lab materials
Routine stereo micscope M80	Leica Micosystems	M80
Sentalloy NiTi open coil spring	TOMY Inc.		A 0.15mm diameter closed NiTi coil with an inner coil diameter of 0.9mm delivers a force of 10g. Similar products can be purchased from Dentsply Sirona.
T-304 stainless steel ligature wire, 0.009'' diameter	Orthodontics	SBLW109	0.009''(.23mm) diameter, Soft temper
X-Ject E (Xylazine) 100mg/ml	Henry Schein Animal Health	NDC:11695-7085-1
Z100 Restorative, A2 shade	3M ESPE	5904A2