通过在小鼠心脏中应用光遗传学多位点光刺激进行高级心律管理

摘要

这项工作报告了一种使用micro-LED阵列的局部光刺激和同时光学映射心外膜电位来控制转基因通道视紫红质-2（ChR2）小鼠完整鼠心脏心律的方法。

摘要

室性快速性心律失常是全世界死亡和发病的主要原因。使用高能电击的电除颤是目前危及生命的心室颤动的唯一治疗方法。然而，除颤可能有副作用，包括无法忍受的疼痛、组织损伤和预后恶化，这表明开发更温和的心律管理策略的医学需求很大。除了降低能量的电方法外，心脏光遗传学还被引入，作为使用光敏膜离子通道和光脉冲影响心脏活动的有力工具。在本研究中，将描述一种基于应用3 x 3微发光二极管（micro-LED）阵列的多位点起搏成功光刺激Langendorff灌注的完整鼠心脏的稳健有效的方法。心外膜电压波的同时光学映射允许研究区域特异性刺激的影响，并直接在现场评估新诱导的心脏活动。获得的结果表明，除颤的功效在很大程度上取决于心律失常期间为光刺激选择的参数。将证明心脏的照明区域对于终止成功以及如何在照明期间实现心脏活动的靶向控制以改变心律失常模式起着至关重要的作用。总之，该技术提供了一种优化现场机制操作的可能性，以实现心律的实时反馈控制，并且与使用非特异性电击应用相比，在区域特异性方面，减少了对心脏系统的潜在危害的新方法。

引言

对心律失常期间时空动力学的早期研究表明，心脏颤动期间的复杂电模式是由涡状旋转激励波驱动的¹。这一发现为心律失常的潜在机制提供了新的见解，从而开发了基于心肌^多位点激发的新型电终止疗法2，^3，4。然而，使用电场刺激的治疗是非局部的，可能会支配周围所有可兴奋的细胞，包括肌肉组织，导致细胞和组织损伤，以及无法忍受的疼痛。与电疗法相比，光遗传学方法提供了一种特异性和组织保护技术，以高空间和时间精度唤起心肌细胞动作电位。因此，光遗传学刺激具有对心脏颤动期间混沌激活模式进行微创控制的潜力。

通过遗传操作将光敏离子通道通道视紫红质-2（ChR2）引入可兴奋细胞5，⁶，7^，使得使用光刺激可兴奋细胞的膜电位去极化成为可能。已经开发了几种医学应用，包括激活神经元网络，控制心脏活动，恢复视力和听力，治疗脊髓损伤等8，9，¹⁰，¹¹，^12，13，14。由于其毫秒响应时间¹⁵，ChR2在心脏病学中的应用具有巨大的潜力，使其非常适合心律失常的心脏动力学的靶向控制。

在这项研究中，显示了转基因小鼠模型完整心脏的多位点光刺激。总之，在欧洲共同体第七框架计划FP7/2007-2013（HEALTH-F2-2009-241526）的范围内建立了转基因α-MHC-ChR2小鼠系，并由S. E. Lehnart教授慷慨提供。一般情况下，在α-MHC控制下表达Cre-重组酶的转基因成年雄性C57/B6/J与雌性 B6.Cg-Gt（ROSA）26Sortm27.1（CAG-COP4*H134R/tdTomato）Hye/J配对交配。由于心脏STOP盒在第二代中被删除，后代表现出稳定的MHC-ChR2表达，并用于维持心脏光敏集落。所有实验均在36-48周龄的两性成年小鼠中进行。照明是使用3 x 3微型LED阵列实现的，该阵列如^16，17 中所述制造，只是未实现硅基外壳和短光学玻璃光纤。它在心脏应用中的首次使用是在¹⁸年。基于类似制造技术的线性微型LED阵列已被用作心脏起搏的穿透探针¹⁹。微型 LED 排列在 3 x 3 阵列中，间距为 550 μm，可在非常小的区域内提供高空间分辨率和高辐射功率。作者在这项工作中展示了一种多功能的局部多位点光刺激，这可能为开发新的抗心律失常治疗方法开辟道路。

以下实验方案涉及离体逆行朗根道夫灌注，其空心主动脉用作灌注入口。由于施加的灌注压和心脏收缩，灌注液流经冠状动脉，冠状动脉从主动脉分支出来。在所展示的工作中，使用恒压设置灌注心脏，通过将灌注储液罐提升到 1 m 高度（相当于 73.2 mmHg）来实现，从而产生 2.633 ± 0.583 mL/min 的流速。在实验过程中使用两种Tyrode溶液作为灌注剂。常规Tyrode溶液支持稳定的窦性心律，而Low-K ⁺ Tyrode溶液与Pinacidil混合，以诱导小鼠心脏的心律失常。使用六角形水浴允许通过六个不同的平面窗口观察心脏，允许耦合多个光学元件，通过折射引起的失真较小。

研究方案

所有实验都严格遵守动物福利法规，符合德国立法、当地规定，并符合欧洲实验动物科学协会联合会 （FELASA） 的建议。动物实验的批准申请已获得负责动物福利当局的批准，所有实验均已报告给我们的动物福利代表。

1. 实验准备和材料

1. 光学映射设置
   注:光学设置以及电气设置如图 1所示。材料表中详细列出了光学和电气设置中使用的所有组件。
   1. 使用 LED 1 和 LED 2 诱导心律失常和备用除颤。选择波长λ_蓝色 接近475 nm的高功率LED，这是ChR2⁶激发波长的峰值。要进一步缩小光谱，请使用 470 ± 20 nm 带通滤光片。
      注意:根据数据表²⁰，在本工作中，LED 1 和 LED 2 的典型辐射通量为 3.9 至 5.3 W。
   2. 用高功率红色 LED（ 图 1 中的 LED 3）照亮心外膜以进行光学映射，该 LED 发出的光的中心波长为 λ_红色 = 625 nm，辐射通量为 700 mW²¹。红光用628 ± 20 nm带通滤光片过滤，并由截止波长为λ DM = 685 nm的长通二向色镜（_DM ）反射。
   3. 在相机物镜前使用λ滤光_片凸轮= 775±70nm的发射滤光片，以仅记录心脏活动的荧光发射。使用非常适合低光应用的快速物镜。
      注意:小鼠心脏的颤动频率范围为20至35 Hz;因此，请使用足够快的相机以 1 到 2 kHz 甚至更高的频率进行录制。
2. 微型发光二极管阵列
   注意:此处应用的micro-LED阵列是使用微系统处理实现的，详见^{其他地方16，17}。
   1. 将 5 μm 厚的聚酰亚胺 （PI） 层旋转涂覆到 4 英寸硅基板上（单面抛光，525 μm 厚）。
   2. 在氮气气氛下，最高温度为450°C，固化该PI层。保持最高温度恒定10分钟。
   3. 使用紫外 （UV） 光刻技术沉积和图案化图像反转光刻胶 （PR），并溅射沉积 250 nm 薄铂层 （Pt）。
   4. 通过电镀 1 μm 厚的金 （Au） 层，将图案化的 PR 用作掩蔽层来增厚这种基于 Pt 的金属化。
   5. 在旋涂第二个PI层之前，将具有第一个PI层和金电镀金属化的晶圆暴露于氧等离子体中，该等离子体化学激活PI层的表面。
   6. 在450°C下再次固化第二层PI，应用UV光刻技术对PR层进行图案化，并使用图案化的PR作为掩蔽层，通过反应离子蚀刻（RIE）打开micro-LED芯片和接口印刷电路板（PCB）阵列的接触焊盘。
      注意:在此RIE工艺步骤中，建议分别施加200 W和100 W10和30分钟，以定义接触垫开口以及二维（2D）micro-LED阵列的外部形状。
   7. 使用溶剂和等离子蚀刻剥离PR。通过电镀额外的 6 μm 厚的金层来进一步加厚接触垫。
   8. 使用倒装芯片键合机将微型LED芯片连接到接触垫上。
   9. 激活氧气等离子体中的PI表面，并用无溶剂粘合剂填充micro-LED芯片。然后将粘合剂在120°C下固化12小时。
   10. 要封装微型LED芯片，请用氩气进行另一次等离子处理，并手动应用薄的含氟聚合物层。在80°C下预固化该层1小时。
   11. 将micro-LED阵列暴露于氧等离子体后，手动应用有机硅作为最终封装层，用于提高硅与底层含氟聚合物层的附着力。将硅胶层在80°C和180°C下固化1小时。这些最后的固化步骤也完全固化了含氟聚合物层。
   12. 将PI基板的接触焊盘焊接到印刷电路板上，该印刷电路板带有条形连接器，用于将阵列互连到外部仪器。使用粘合剂覆盖PCB上的焊盘。
3. 电气设置
   1. 使用适合记录心电图 （ECG） 的电极，例如银/氯化银电极或单相动作电位 （MAP） 电极和 ECG 放大器来连续监测心脏的电活动。此外，使用适当的采集设备（AD）记录获得的所有电信号。
   2. 为大功率 LED（LED 1、LED 2 和 LED 3）选择合适的驱动器，它可以管理施加到每个器件的最大电流。使用任意函数发生器 （AFG） 精确控制 LED 驱动器的输出。
   3. 使用多通道 LED 驱动器控制流过微型 LED 阵列的电流。具有多个输出的 AFG 也适合此任务。
      注意:建议选择将电流限制为微型LED最大电流的LED驱动器，否则二极管可能会损坏。多通道微型LED驱动器的一个示例在另一部作品¹⁸中描述。如有必要，AFG 或任何其他 LED 驱动器可能会连接到计算机以远程控制微型 LED 设置。如果是这种情况，请使用您选择的通信协议将 LED 驱动器连接到计算机，例如通用接口总线 （GPIB） 或串行连接。

   

2. 实验程序

1. 溶液制备
   1. 准备Tyrode溶液:130 mM NaCl，4 mM KCl，1 mM MgCl 2，24 mM NaHCO₃，1.8 mM CaCl 2，1.2 mM KH₂ PO₄，5.6 mM葡萄糖，0.1%BSA /白蛋白。
   2. 准备低K+泰罗德溶液:低K⁺泰罗德溶液的制备方法与常规泰罗德溶液相同，只是只添加了一半的KCl（2 mM而不是4 mM KCl）。
      注意:对于持续3小时的实验，通常2-3升低K ⁺ Tyrode（如果进行光学映射，则与Blebbistatin（步骤2.1.5）混合）和1-2L常规Tyrode就足够了。
   3. 将匹纳地尔添加到低K ⁺ Tyrode溶液中以缓解心律失常诱导过程，如²²中所述，以获得100mM浓度。处理松西地尔时戴上实验室防护手套。
   4. 用常规泰罗德溶液制备 1 mL 50 μM DI-4-ANBDQPQ。保护染料避光，防止光漂白。
   5. 制作10mM的布比他汀储备溶液。对于光学映射，将布比他汀与100mM松酸地尔-泰罗德溶液（步骤2.1.3）混合以获得5μM溶液。处理布比他汀时戴上实验室防护手套。
      注意:将染料和布比他汀溶液放在一边，直到光学映射开始。
2. 朗根道夫灌注
   注意:该装置由两个储液罐组成，用于两个 Tyrode 解决方案。它们通过带有三向旋塞的管子连接到气泡捕集器。心脏随后通过鲁尔锁连接器连接到气泡阱上，然后将其悬挂在六角形水浴中。反过来，水浴连接到废物容器以收集用过的Tyrode溶液。
   1. 每次实验前用完全软化水清洁所有试管。
   2. 在实验开始之前，在室温下用碳原（5%CO₂ 和95%O₂）给Tyrode的溶液充气30分钟。用NaOH将Tyrode溶液的pH值调节至7.4。
   3. 将每个 Tyrode 溶液填充 500 mL 到相应的储液器中，并通过灌注系统运行 Tyrode 溶液对管和气泡阱进行脱气，直到在管中或气泡阱中看不到更多的被困气泡。
   4. 在整个实验过程中，继续用碳原在储层中给Tyrode溶液充气，以确保灌注液的pH值在灌注过程中保持稳定。
   5. 用水热泵将灌注系统加热至37°C。通过使用额外的加热元件（如防水加热电缆）来保持水浴内的灌注液温度恒定。
      注意:在实验过程中，在 Tyrode 的储液罐耗尽之前重新填充它们至关重要。否则，气泡会进入心脏，堵塞血管并导致缺血。
3. 鼠标制备
   1. 在心脏隔离程序前30分钟皮下注射0.1mL的500即肝素。
   2. 用冰冷的Tyrode溶液填充6厘米培养皿和2毫升注射器。放在体视显微镜下。
   3. 通过饱和异氟醚环境对小鼠进行短时间麻醉2分钟，然后立即颈椎脱位。
      注意:为了验证足够的麻醉，检查阴性的脚趾间反射是绝对必要的。
   4. 打开胸部，取出心脏，如其他地方^所述23，并将其放入6厘米培养皿中，用冰冷的Tyrode溶液。由于温度下降，心脏跳动会减少。
   5. 在体视显微镜下进行精细准备，详见^{其他部分23}。将主动脉连接到钝针上，并用缝合材料固定血管。
   6. 作为对照，通过针头将冰冷的Tyrode溶液注入心脏，并检查心脏是否紧密安装。这一步还将剩余的血液冲洗出心脏。
   7. 将安装的心脏转移到灌注系统。确保灌注液流动以防止空气进入心脏，同时将针头与气泡阱连接。检查心脏是否在水浴中被泰罗德溶液覆盖。步骤 2.3.4、2.3.5 和 2.3.7 如图 2 所示。
   8. 确保心脏在几分钟内开始跳动。让心脏适应灌注设置15至20分钟，如果要进行光学映射，则分别切换到低K ⁺泰罗德溶液与匹纳地尔和布比他汀（步骤2.1.5）。
4. 心律失常诱导和光学除颤
   1. 将其中一个心电图电极尽可能靠近心脏表面，以确保良好的信号质量。将第二个心电图电极悬浮在泰罗德的溶液中。确保所选AD记录采集的心电图。
   2. 将micro-LED阵列放在研究的感兴趣区域，例如，放在左心室上。
   3. 将灌注改为低K ⁺ Tyrode's和Pinacidil，并灌注心脏15至30分钟。
   4. 为了诱发心律失常，用 LED 1 和 LED 2 照射心脏，用 20 到 50 个光脉冲串亮心脏，频率为 25 到 35 Hz，脉冲持续时间 W_ind 为 2 到 15 ms，光强度 LI_{opt_ind 为} 2.8 mW ^mm-2。
   5. 重复该过程，直到诱发心律失常。
      注意:心律失常很容易在心电图信号中识别，因为信号的频率和形态与正常的窦性心律不同。如果心律失常在接下来的 5 秒内终止，将其归类为自我终止，并开始新的诱导尝试。
   6. 一旦目视检测到持续性心律失常，使用阵列的三个、六个或九个微型 LED 以 15 mA 的脉冲电流 I 脉冲施加不同宽度 W def 和频率 f_def 的脉冲脉冲_脉冲，产生光强度 LI_μLED = 33.31 ± 2.05 mW ^mm-2。
   7. 如果在五次基于 micro-LED 阵列的除颤试验后心律失常仍在继续，请将尝试归类为不成功并开始备用除颤。
   8. 对于备用除颤，请使用 LED 1 和 LED 2，使用与微型 LED 阵列设置的相同定时参数。
      注意:由于心脏在整个实验期间都暴露于缺血和代谢应激中，因此即使使用备用除颤，心律失常的终止尝试也可能不成功。每当发生这种情况时，将灌注溶液更改为常规的Tyrode，让心脏恢复5至10分钟。当心电图恢复到窦性心律时，再次重复步骤2.4.3中的方案。
5. 光学映射
   1. 用步骤2.1.5中制备的布比他汀溶液灌注心脏，并等待机械解耦发生。这是在心脏停止跳动时完成的，但心电图信号仍然可以测量。
      注意:将布比他汀溶液混合到上述浓度并保持心脏与该溶液灌注，在整个实验过程中保持心脏机械活动与电活动不耦合。
   2. 在朗根多夫灌注的气泡阱中快速推注 1 mL 电压染料 DI-4-ANBDQPQ（在步骤 2.1.4 中制备）。等待5至10分钟，让染料均匀地灌注心脏。
      注意:在没有记录时关闭红灯，避免染料的光漂白。如果记录的信噪比太小（采集的信号噪声太大），请重复步骤2.1.4和2.5.2。
   3. 将相机对焦到心脏表面，打开LED 3，然后施加1.27 mW ^mm-2 光功率。
   4. 关闭实验室灯并开始录制。通过将获得的信号的频率与记录的ECG的频率进行比较，确保正在获取光信号。这确保了获得的光信号纯粹与心脏的电活动有关。
      注意:由于染料发出的荧光非常周，因此光学映射是在暗室中进行的。这避免了来自任何其他光源的信号干扰。

结果

该协议允许使用LED 1和LED 2（图1）产生的光刺激脉冲诱导完整鼠心脏中的室性心律失常，_{频率f ind}在25 Hz和35 Hz之间，脉冲持续时间W_ind在2 ms和10 ms之间。请注意，这种快速光脉冲的目的不是捕捉心律，而是使心脏活动不平衡，从而产生不稳定的电波，从而促进心律失常。用光诱导心律失常比用电刺激诱导的优点是心电图中不会引起伪影，从而可以不受限制地对...

讨论

成功治疗快速性心律失常是心脏治疗的关键。然而，心律失常发生、延续和终止的生物物理机制尚不完全清楚。因此，心脏研究旨在优化电击疗法，以更温和地终止心律失常，从而提高患者的生活质量²⁸，²⁹，^30，31。低能量电方法有望显着减少严重的副作用，但仍可能诱发不必要的肌肉兴奋。心脏光?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemical Components
Blebbistatin	TargetMol	T6038	10 mM stock solution
BSA/Albumin	Sigma-Aldrich	A4919
Calcium Chloride	Sigma-Aldrich	C1016	CaCl2
Carbogen	Westfalen		50 l bottle
DI-4-ANBDQPQ	AAT Bioquest	21499	Dye for Optical Mapping
Glucose	Sigma-Aldrich	D9434	C6H12O6
Heparin	LEO Pharma		Heparin-Natrium Leo 25.000 I.E./5 ml, available only on prescription
Hydrochlorid Acid	Merck	1.09057.1000	HCl, 1 M stock solution
Isoflurane	CP Pharma		1 ml/ml, available only on prescription
Magnesium Chloride	Merck	8.14733.0500	MgCl2
Monopotassium Phosphate	Sigma-Aldrich	30407	KH2PO4
Pinacidil monohydrate	Sigma-Aldrich	P154-500mg	10 mM stock solution
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P5405	KCl
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761	NaHCO3
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S5886	NaCl
Sodium Hydroxide	Merck	1.09137.1000	NaOH, 1 M stock solution
Electrical Setup
Biopac MP150	Biopac Systems	MP150WSW	data acquisition and analysis system
Custom-built ECG, alternative ECG100C	Biopac Systems	ECG100C	Electrocardiogram Amplifier
Custom-built water bath heater using heating cable	RMS Heating System	HK-5,0-12	Heating cable 120W
Hexagonal water bath
LED Driver Power supply	Thorlabs	KPS101	15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for One K- or T-Cube.
LEDD1B LED Driver	Thorlabs	LEDD1B	T-Cube LED Driver, 1200 mA Max Drive Current
MAP, ECG Electrode	Hugo Sachs Elektronik	BS4 73-0200	Mini-ECG Electrode for isoalted hearts
micro-LED Driver e.g. AFG	Agilent Instruments	A-2230	Arbitrary function generator (AFG)
Signal Generator	Agilent Instruments	A-2230	AFG
micro-LED Array Components
Epoxid glue	Epoxy Technology	EPO-TEK 353ND	Two component epoxy
Fluoropolymer	Asahi Glass Co. Ltd.	Cytop 809M	Fluoropolymer with high transparency
Image reversal photoresist	Merck KGaA	AZ 5214E	Image Reversal Resist for High Resolution
LED chip	Cree Inc.	C460TR2227-S2100	Blue micro-LED
Photoresist	Merck KGaA	AZ 9260	Thick Positive Photoresists
Polyimide	UBE Industries Ltd.	U-Varnish S	Polyimide Solution
Silicone	NuSil Technology LLC	MED-6215	Low viscosity silicone elastomer
Solvent free adhesive	John P. Kummer GmbH	Epo-Tek 301-2	Epoxy resin with low viscosity
Optical Mapping
Blue Filter	Chroma Technology Corporation	ET470/40x	Blue excitation filter
Camera	Photometrics	Cascade 128+	High performance EMCCD Camera
Camera Objective	Navitar	DO-5095	Navitar high speed fixed focal length lenses work with CCD and CMOS cameras
Dichroic Mirror	Semrock	FF685-Di02-25x36	685 nm edge BrightLine® single-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter
Emmision Filter	Semrock	FF01-775/140-25	775/140 nm BrightLine® single-band bandpass filter
Heatsink	Advanced Thermal Solutions	ATSEU-077A-C3-R0	Heat Sinks - LED STAR LED Heatsink, 45mm dia., 68mm, Black/Silver, Unthreaded Baseplate Hardware
LED 1 and LED 2	LED Engin Osram	LZ4-00B208	High Power LEDs - Single Colour Blue, 460 nm 130 lm, 700mA
LED 3	Thorlabs	M625L3	625 nm, 700 mW (Min) Mounted LED, 1000 mA
Lenses	LED Engin Osram	LLNF-2T06-H	LED Lighting Lenses Assemblies LZ4 LENS NARROW FLOOD BEAM
Photodiode for power meter	Thorlabs	S120VC	Standard Photodiode Power Sensor
Power Meter	Thorlabs	PM100D	Compact Power and Energy Meter
Red Filter	Semrock	FF02-628/40-25	BrightLine® single-band bandpass filter