JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

עבודה זו מדווחת על שיטה לשליטה בקצב הלב של לבבות מורין שלמים של עכברי channelrhodopsin-2 מהונדסים (ChR2) באמצעות פוטוסטימולציה מקומית עם מערך מיקרו-LED ומיפוי אופטי סימולטני של פוטנציאל קרום הלב.

Abstract

טכיאריתמיות חדריות הן גורם מרכזי לתמותה ולתחלואה ברחבי העולם. דפיברילציה חשמלית באמצעות שוקים חשמליים באנרגיה גבוהה היא כיום הטיפול היחיד בפרפור חדרים מסכן חיים. עם זאת, לדפיברילציה עלולות להיות תופעות לוואי, כולל כאבים בלתי נסבלים, נזק לרקמות והחמרה בפרוגנוזה, מה שמעיד על צורך רפואי משמעותי בפיתוח אסטרטגיות עדינות יותר לניהול קצב הלב. מלבד גישות חשמליות מפחיתות אנרגיה, אופטוגנטיקה לבבית הוצגה ככלי רב עוצמה להשפעה על פעילות הלב באמצעות תעלות יונים רגישות לאור ופולסים של אור. במחקר הנוכחי תתואר שיטה חזקה ותקפה לפוטוסימולציה מוצלחת של לבבות מורין שלמים של לנגנדורף על בסיס קצב רב-אתרים המפעיל מערך של 3 x 3 של דיודות פולטות אור מיקרו (micro-LED). מיפוי אופטי סימולטני של גלי מתח ממברנה אפיקרדיאלית מאפשר לחקור את ההשפעות של גירוי ספציפי לאזור ומעריך את הפעילות הלבבית החדשה שנוצרה ישירות באתר. התוצאות המתקבלות מראות כי היעילות של דפיברילציה תלויה מאוד בפרמטרים שנבחרו עבור פוטוסטימולציה במהלך הפרעת קצב לב. יודגם כי האזור המואר של הלב ממלא תפקיד מכריע להצלחת ההפסקה, כמו גם כיצד ניתן להשיג שליטה ממוקדת בפעילות הלב במהלך ההארה לשינוי דפוסי הפרעות קצב. לסיכום, טכניקה זו מספקת אפשרות לייעל את מניפולציית המנגנון באתר בדרך לבקרת משוב בזמן אמת של קצב הלב, ובנוגע לספציפיות האזור, גישות חדשות בהפחתת הנזק הפוטנציאלי למערכת הלב בהשוואה לשימוש ביישומי הלם חשמלי לא ספציפיים.

Introduction

חקירות מוקדמות של הדינמיקה המרחבית-טמפורלית במהלך הפרעות קצב גילו כי הדפוסים החשמליים המורכבים במהלך פרפור הלב מונעים על ידי גלי עירור מסתובבים דמויי מערבולת1. ממצא זה נתן תובנות חדשות על המנגנונים הבסיסיים של הפרעות קצב, מה שהוביל לאחר מכן לפיתוח טיפולים חדשניים לסיום חשמלי המבוססים על עירור רב-אתרים של שריר הלב 2,3,4. עם זאת, טיפולים באמצעות גירוי שדה חשמלי אינם מקומיים ועלולים להחדיר את כל התאים המעוררים שמסביב, כולל רקמת שריר, ולגרום נזק לתאים ולרקמות, כמו גם לכאב בלתי נסבל. בניגוד לטיפולים חשמליים, גישות אופטוגנטיות מספקות טכניקה ספציפית ומגינה על רקמות לעידוד פוטנציאל פעולה קרדיומיוציטים בדיוק מרחבי וזמני גבוה. לכן, לגירוי אופטוגנטי יש פוטנציאל לשליטה זעיר פולשנית בדפוסי ההפעלה הכאוטיים במהלך פרפור הלב.

הכנסת תעלת היונים הרגישה לאור channelrhodopsin-2 (ChR2) לתאים מעוררים באמצעות מניפולציה גנטית 5,6,7, אפשרה דה-פולריזציה של פוטנציאל הממברנה של תאים מעוררים באמצעות פוטוסטימולציה. מספר יישומים רפואיים, כולל הפעלת רשתות נוירונים, שליטה על פעילות הלב, שחזור ראייה ושמיעה, טיפול בפגיעות בחוט השדרה ואחריםפותחו 8,9,10,11,12,13,14. היישום של ChR2 בקרדיולוגיה הוא בעל פוטנציאל משמעותי בשל זמן התגובה של אלפית השנייה15, מה שהופך אותו מתאים היטב לבקרה ממוקדת של דינמיקה לבבית קצבית.

במחקר זה מוצגת פוטוסטימולציה מרובת אתרים של לבבות שלמים של מודל עכבר מהונדס. לסיכום, קו עכברי אלפא-MHC-ChR2 מהונדסים הוקם במסגרת תוכנית המסגרת השביעית של הקהילה האירופית FP7/2007-2013 (HEALTH-F2-2009-241526) וסופק בחביבות על ידי פרופ 'ס. א. לנארט. באופן כללי, זכר בוגר מהונדס C57/B6/J, המבטא Cre-recombinase תחת שליטה של אלפא-MHC היו מזווגים להזדווג עם נקבה B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm27.1(CAG-COP4*H134R/tdTomato)Hye/J. מכיוון שקלטת ה-STOP של הלב נמחקה בדור השני, הצאצאים הראו ביטוי MHC-ChR2 יציב ושימשו לשמירה על מושבות רגישות לב. כל הניסויים נעשו עם עכברים בוגרים משני המינים בגיל 36 - 48 שבועות. התאורה מושגת באמצעות מערך מיקרו-LED בגודל 3 x 3, המיוצר כמתוארב-16,17, אלא שהמארז המבוסס על סיליקון וסיבי הזכוכית האופטיים הקצרים אינם מיושמים. השימוש הראשון שלה ביישום לב נמצא ב18. מערך מיקרו-LED ליניארי המבוסס על טכנולוגיית ייצור דומה יושם כגשושית חודרת לקצב לב19. נוריות המיקרו-נוריות מסודרות במערך של 3 על 3 במגרש של 550 מיקרומטר, ומספקות הן רזולוציה מרחבית גבוהה והן הספק קורן גבוה על שטח קטן מאוד. המחברים מדגימים בעבודה זו פוטוסטימולציה מקומית רב-תכליתית מרובת אתרים שעשויה לפתוח את הדרך לפיתוח שיטות טיפול חדשניות נגד הפרעות קצב.

הפרוטוקול הניסיוני הבא כולל פרפוזיה מדרדרת של Langendorff ex vivo, שעבורה אבי העורקים המשומר מתפקד ככניסת פרפוזיה. בשל לחץ הזלוף המופעל והתכווצות הלב המבושם זורם דרך העורקים הכליליים, המסתעפים מאבי העורקים. בעבודה המוצגת, הלב הוא perfused באמצעות מערך לחץ קבוע שהושג על ידי העלאת מאגרי perfusate לגובה 1 מ ', שווה ערך 73.2 מ"מ כספית, אשר מניב לקצב זרימה של 2.633 ± 0.583 מ"ל / דקה. שני סוגים של תמיסה של טירודה משמשים כמטען במהלך הניסוי. התמיסה של טירודה רגילה תומכת בקצב סינוסים יציב, בעוד שהפתרון של Low-K+ Tyrode מעורבב עם Pinacidil כדי לאפשר השראה של הפרעות קצב בלבבות מורין. השימוש באמבט מים משושה מאפשר תצפית על הלב דרך שישה חלונות מישוריים שונים, ומאפשר צימוד של מספר רכיבים אופטיים עם פחות עיוות על ידי שבירה.

Protocol

כל הניסויים פעלו בקפדנות על פי הרגולציה לרווחת בעלי חיים, בהסכמה עם החקיקה הגרמנית, התניות מקומיות, ובהתאם להמלצות הפדרציה של איגודי מדעי חיות המעבדה האירופיים (FELASA). הבקשה לאישור ניסויים בבעלי חיים אושרה על ידי הרשות האחראית לרווחת בעלי חיים, וכל הניסויים דווחו לנציגי רווחת בעלי החיים שלנו.

1. הכנת ניסויים וחומרים

  1. הגדרת מיפוי אופטי
    הערה: ההתקנה האופטית, כמו גם ההתקנה החשמלית, מוצגים באיור 1. כל הרכיבים המשמשים במערך האופטי והחשמלי מפורטים בפירוט בטבלת החומרים.
    1. השתמש ב-LED 1 ו-LED 2 להשראת הפרעות קצב ודפיברילציה לגיבוי. בחר נוריות LED בהספק גבוה עם אורך גלλ כחול ליד 475 ננומטר, שהוא שיא אורך גל העירור של ChR26. כדי לצמצם עוד יותר את הספקטרום האופטי, השתמש במסנן פס פס של 470 ± 20 ננומטר.
      הערה: בעבודה זו, LED 1 ו- LED 2 הם בעלי שטף קורן טיפוסי של 3.9 עד 5.3 W, על פי גליון הנתונים20.
    2. האר את האפיקרדיום למיפוי אופטי באמצעות נורית LED אדומה בעוצמה גבוהה (LED 3 באיור 1), הפולטת אור עם אורך גל מרכזי של λאדום = 625 ננומטר ושטף קורן של 700 mW21. האור האדום מסונן באמצעות מסנן פס פס של 628 ± 20 ננומטר ומוחזר על ידי מראה דיכרואית בעלת מעבר ארוך (DM) עם אורך גל מנותק של λDM = 685 ננומטר.
    3. השתמש במסנן פליטה עםמצלמת מסנן λ = 775 ± 70 ננומטר מול מטרת המצלמה כדי להקליט רק את הפליטה הפלואורסצנטית של פעילות הלב. השתמש במטרה מהירה המתאימה היטב ליישומים בתאורה חלשה.
      הערה: תדירות הפרפור של לב עכבר נעה בין 20 ל -35 הרץ; לכן, השתמש במצלמה מהירה מספיק כדי להקליט בתדר של 1 עד 2 קילוהרץ, או אפילו גבוה יותר.
  2. מערך מיקרו-LED
    הערה: מערכי המיקרו-LED המיושמים כאן מתממשים באמצעות עיבוד מיקרו-מערכות כמפורט במקום אחר16,17.
    1. יש לסובב שכבת פולימיד (PI) בעובי 5 מיקרומטר על מצעי סיליקון בגודל 4 אינץ' (מלוטשים בצד אחד, בעובי 525 מיקרומטר).
    2. לרפא שכבת PI זו בטמפרטורה מקסימלית של 450 מעלות צלזיוס תחת אטמוספירת חנקן. שמור על טמפרטורה מקסימלית קבועה למשך 10 דקות.
    3. הפקדה ותבנית של פוטורסיסט היפוך תמונה (PR) באמצעות ליתוגרפיה אולטרה סגולה (UV) והפקדת מפזר שכבת פלטינה דקה של 250 ננומטר (Pt).
    4. עבו את המטליזציה מבוססת ה-Pt הזו על ידי ציפוי חשמלי של שכבת זהב (Au) בעובי 1 מיקרומטר, כאשר ה-PR המעוצב משמש כשכבת מיסוך.
    5. לפני סיבוב שכבת PI שנייה, חשוף את הוופל עם שכבת ה-PI הראשונה שלו ואת המטאליזציה המצופה Au-electroplated לפלזמת חמצן שמפעילה כימית את פני השטח של שכבת ה-PI.
    6. לרפא שוב את שכבת ה-PI השנייה בטמפרטורה של 450 מעלות צלזיוס, להחיל ליתוגרפיה של UV על תבנית שכבת יחסי ציבור ולפתוח את רפידות המגע של המערך עבור שבבי המיקרו-LED והמעגל המודפס המתממשק (PCB) על ידי תחריט יונים תגובתי (RIE) באמצעות יחסי הציבור המעוצבים כשכבת מיסוך.
      הערה: בשלבי תהליך RIE אלה, מומלץ להחיל 200 W ו- 100 W למשך 10 ו- 30 דקות, בהתאמה, כדי להגדיר את פתחי כריות המגע וכן את הצורה החיצונית של מערך המיקרו-LED הדו-ממדי (2D).
    7. הפשיטו את יחסי הציבור באמצעות ממיסים ותחריטי פלזמה. עיבוי נוסף של רפידות המגע על ידי ציפוי חשמלי נוסף של שכבת זהב בעובי 6 מיקרומטר.
    8. חבר את שבבי המיקרו-LED לרפידות המגע באמצעות בונדר שבב הפוך.
    9. הפעל את משטח ה- PI בפלזמת חמצן ומלא את שבבי המיקרו-LED בדבק ללא ממסים. לרפא לאחר מכן את הדבק במשך 12 שעות ב 120 מעלות צלזיוס.
    10. כדי לתמצת את שבבי המיקרו-LED, בצע טיפול פלזמה נוסף עם ארגון ויישם שכבת פלואורופולימר דקה באופן ידני. יש לרפא שכבה זו מראש בטמפרטורה של 80°C למשך שעה אחת.
    11. יש למרוח סיליקון באופן ידני כשכבת האנקפסולציה הסופית לאחר חשיפת מערך המיקרו-LED לפלסמת חמצן, המשמשת לשיפור הידבקות הסיליקון לשכבת הפלואורופולימר שמתחת. לרפא את שכבת הסיליקון ב-80°C וב-180°C למשך שעה כל אחת. שלבי הריפוי הסופיים האלה גם מרפאים לחלוטין את שכבת הפלואורופולימר.
    12. הלחמה של רפידות המגע של מצע PI למעגל מודפס הנושא מחברי פס לחיבור המערך למכשור חיצוני. כסו את רפידות ההלחמה על לוח המעגלים המודפסים באמצעות דבק.
  3. מערך חשמלי
    1. השתמש באלקטרודות המתאימות לרישום אלקטרוקרדיוגרמה (א.ק.ג.), כגון אלקטרודות כסף/כסף-כלוריד או אלקטרודות פוטנציאל פעולה מונופאזי (MAP) ומגבר א.ק.ג. כדי לנטר את הפעילות החשמלית של הלב באופן רציף. יתר על כן, השתמש במכשיר רכישה מתאים (AD) כדי להקליט את כל האותות החשמליים שהתקבלו.
    2. בחר מנהל התקן מתאים היטב עבור נוריות LED בעלות הספק גבוה (LED 1, LED 2 ו- LED 3), שיכולות לנהל את הזרם המרבי המוחל על כל התקן. השתמש במחולל פונקציות שרירותי (AFG) כדי לשלוט בפלט של מנהלי ההתקן של LED באופן מדויק.
    3. השתמש בדרייבר LED רב-ערוצי כדי לשלוט בזרם הזורם דרך מערך המיקרו-LED. AFG עם יציאות מרובות מתאים גם למשימה זו.
      הערה: מומלץ לבחור מנהלי התקן LED המגבילים את הזרם לזרם המרבי של המיקרו-LED, אחרת הדיודות עלולות להינזק. דוגמה אחת של מנהל התקן מיקרו-LED רב-ערוצי מתוארת בעבודה אחרת18. במידת הצורך, ייתכן שה-AFG או כל מנהל התקן LED אחר מחובר למחשב כדי לשלוט מרחוק בהגדרות ה-micro-LED. במקרה זה, חבר את מנהל ההתקן של נורית ה-LED למחשב באמצעות פרוטוקול התקשורת שבחרת, לדוגמה, אפיק ממשק לשימוש כללי (GPIB) או חיבור טורי.

   

2. הליכים ניסיוניים

  1. הכנת פתרונות
    1. הכן את הפתרון של טירוד: 130 mM NaCl, 4 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 24 mM NaHCO3, 1.8 mM CaCl 2, 1.2 mM KH 2 PO4, 5.6 mM גלוקוז, 0.1% BSA / אלבומין.
    2. הכן את הפתרון של Low-K+ Tyrode: Low-K+ Tyrode's מיוצר באותו אופן כמו הפתרון של טירודה רגילה, אלא שרק מחצית מכמות ה-KCl מתווספת (2 mM במקום 4 mM KCl).
      הערה: לניסוי שנמשך 3 שעות בדרך כלל מספיקים 2-3 ליטר של טירוד Low-K+ (מעורבב בנוסף עם Blebbistatin (שלב 2.1.5) אם מתבצע מיפוי אופטי) ו-1-2 ליטר של טירודה רגילה.
    3. הוסיפו את Pinacidil לתמיסת הטירודה Low-K+ כדי להקל על תהליך אינדוקציה של הפרעות קצב, כפי שמתוארב-22, כדי להגיע לריכוז של 100 mM. יש ללבוש כפפות מעבדה מגן בעת טיפול Pinacidil.
    4. הכן 1 מ"ל של 50 μM DI-4-ANBDQPQ עם פתרון רגיל של טירוד. יש להגן על הצבע מפני אור כדי למנוע הלבנת תמונות.
    5. צור פתרון מלאי של 10 mM של Blebbistatin. למיפוי אופטי, ערבבו את Blebbistatin עם התמיסה של 100 mM Pinacidil-Tyrode (שלב 2.1.3) כדי לקבל תמיסה של 5 מיקרומטר. יש ללבוש כפפות מעבדה מגן בעת טיפול בבלביסטטין.
      הערה: שמור הן את הצבע והן את תמיסת Blebbistatin בצד עד לתחילת המיפוי האופטי.
  2. לנגנדורף
    הערה: ההתקנה מורכבת משני מאגרים עבור שני הפתרונות של Tyrode. הם מחוברים למלכודת בועות דרך צינורות עם תלת כיווני. הלב מחובר מאוחר יותר למלכודת הבועות על ידי מחבר מנעול Luer, ולאחר מכן הוא תלוי באמבט מים משושה. אמבט המים, בתורו, מחובר למיכל פסולת כדי לאסוף את הפתרון המשומש של טירוד.
    1. נקו את כל הצינורות לפני כל ניסוי עם מים שעברו דה-מינרליזציה מלאה.
    2. אווררו את שני הפתרונות של טירודה עם קרבוגן (5% CO 2 ו-95% O2) למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר לפני תחילת הניסוי. התאם את ערך ה- pH של פתרונות הטירודה ל- 7.4 עם NaOH.
    3. מלאו 500 מ"ל של כל תמיסה של טירודה במאגר המתאים ואווררו את הצינורות כמו גם את מלכודת הבועות על ידי הפעלת התמיסה של טירודה דרך מערכת הזלוף עד שלא ייראו עוד בועות אוויר לכודות בצינורות או במלכודת הבועות.
    4. המשך לאוורר את תמיסות הטירודה במהלך כל הניסוי במאגרים עם קרבוגן כדי להבטיח שה- pH של המבוך יישאר יציב מאוחר יותר במהלך הזליפה.
    5. מחממים את מערכת הזלוף ל-37°C באמצעות משאבת חום מים. שמרו על טמפרטורה קבועה בתוך אמבט המים באמצעות גוף חימום נוסף כגון כבל חימום עמיד למים.
      הערה: במהלך הניסוי, חיוני למלא מחדש את מאגרי הטירוד לפני שהם מתרוקנים. אחרת, בועות אוויר יכול להיכנס ללב, אשר יכול לסתום את כלי ולהוביל איסכמיה.
  3. הכנת עכבר
    1. להזריק תת עורית 0.1 מ"ל של 500 I.E. הפרין 30 דקות לפני הליך בידוד לב.
    2. מלאו צלחת פטרי בקוטר 6 ס"מ ומזרק 2 מ"ל בתמיסת טיירוד קרה כקרח. מניחים מתחת למיקרוסקופ הסטריאוסקופי.
    3. בצע הרדמה בזמן קצר של עכברים על ידי סביבת איזופלורן רוויה למשך 2 דקות ונקע צוואר הרחם מיידי לאחר מכן.
      הערה: על מנת לוודא הרדמה מספקת, יש צורך בהחלט לבדוק את הרפלקס השלילי בין האצבעות.
    4. פותחים את החזה, מסירים את הלב, כפי שתואר במקום אחר23, ומכניסים אותו לתוך צלחת פטרי בקוטר 6 ס"מ עם התמיסה של טירודה קרה כקרח. פעימות הלב יפחתו עקב ירידת הטמפרטורה.
    5. בצע את ההכנה העדינה תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי, כמפורט במקום אחר23. חבר את אבי העורקים על מחט קהה לקבע את הכלי עם חומר תפר.
    6. כבקרה, הזריקו את התמיסה של טירודה קרה כקרח דרך המחט לתוך הלב ובדקו שהלב מותקן היטב. שלב זה גם שוטף את שארית הדם מהלב.
    7. העבר את הלב רכוב למערכת הזליפה. ודאו שהבקבוק זורם כדי למנוע כניסת אוויר ללב תוך חיבור המחט למלכודת הבועות. בדוק כי הלב מכוסה בתמיסה של טירוד באמבט המים. שלבים 2.3.4, 2.3.5 ו-2.3.7 מתוארים באיור 2.
    8. ודא שהלב מתחיל לפעום תוך מספר דקות. תן ללב להסתגל למערך הזלוף למשך 15 עד 20 דקות, ולאחר מכן עבור לפתרון של טירודה נמוכה+ K עם Pinacidil (שלב 2.1.3) בהתאמה פתרון של טירודה נמוכה+ עם Pinacidil ו- Blebbistatin (שלב 2.1.5) אם יש לבצע מיפוי אופטי.
  4. אינדוקציה של הפרעות קצב ודפיברילציה אופטית
    1. הניחו את אחת מאלקטרודות האק"ג קרוב ככל האפשר למשטח הלב כדי להבטיח איכות אות טובה. השעה את אלקטרודת האק"ג השנייה בתמיסת הטירודה. ודא שהאק"ג שנרכש נרשם על ידי המודעה שבחרת.
    2. מקם את מערך המיקרו-LED על אזור העניין של המחקר, למשל, על החדר השמאלי.
    3. החליפו את הזלוף ל-+Low-K + Tyrode's עם Pinacidil והכניסו את הלב למשך 15 עד 30 דקות.
    4. כדי לגרום להפרעות קצב, להאיר את הלב עם LED 1 ו- LED 2 עם רכבת של 20 עד 50 פולסים קלים עם תדר f ind של 25 עד 35 הרץ, משך הדופק Wind של 2 עד 15 ms, ועוצמת האור LIopt_ind של 2.8 mW mm-2.
    5. חזור על התהליך עד הפרעות קצב הוא המושרה.
      הערה: קל לזהות הפרעות קצב באות האק"ג מכיוון שהתדר והמורפולוגיה של האות שונים מקצב סינוסים רגיל. אם הפרעת הקצב תסתיים בתוך 5 השניות הבאות, סווג אותה כסיום עצמי, והתחל ניסיון אינדוקציה חדש.
    6. לאחר זיהוי חזותי של הפרעת קצב מתמשכת, יש להפעיל פרץ של פולסים ברוחב שונה W def ותדרים fdef, באמצעות שלוש, שישה או תשעה מיקרו-נוריות של המערך בזרם פועם Iפולס של 15 mA הנכנע לעוצמת אור LIμLED = 33.31 ± 2.05 mW mm-2.
    7. אם הפרעת הקצב תמשיך להימשך לאחר חמישה ניסויי דפיברילציה מבוססי מערך מיקרו-LED, סווג את הניסיון כלא מוצלח והתחל דפיברילציה לגיבוי.
    8. עבור דפיברילציה לגיבוי, השתמש ב-LED 1 וב-LED 2 באמצעות אותם פרמטרי תזמון שנקבעו עבור מערך המיקרו-LED.
      הערה: מכיוון שהלב חשוף ללחץ איסכמי ומטבולי במשך כל תקופת הניסוי, ייתכן שניסיונות הפסקת הפרעות קצב אינם מצליחים אפילו עם דפיברילציה לגיבוי. בכל פעם שזה קורה, לשנות את פתרון הזלוף הרגיל של Tyrode ולתת ללב להתאושש במשך 5 עד 10 דקות. כאשר האק"ג חוזר לקצב הסינוסים, חזור שוב על הפרוטוקול משלב 2.4.3.
  5. מיפוי אופטי
    1. יש לחדור ללב עם תמיסת Blebbistatin שהוכנה בשלב 2.1.5 ולהמתין עד להתרחשות פירוק מכני. זה נעשה כאשר הלב מפסיק לפעום, אבל אות א.ק.ג. עדיין ניתן למדידה.
      הערה: ערבוב תמיסת Blebbistatin לריכוז שהוזכר ושמירה על הלב מחובר לתמיסה זו שומרת על הפעילות המכנית של הלב ללא פעילות חשמלית במהלך הניסוי כולו.
    2. תן את צבע המתח של 1 מ"ל DI-4-ANBDQPQ (מוכן בשלב 2.1.4) כבולוס במלכודת הבועות של הזלוף לנגנדורף. המתן 5 עד 10 דקות כדי לאפשר לצבע לחדור ללב באופן אחיד.
      הערה: הימנע מהלבנת תמונות של הצבע על-ידי כיבוי האור האדום בכל פעם שלא מתבצעת הקלטה. אם יחס האות לרעש של ההקלטה הופך קטן מדי (האות הנרכש רועש מדי), חזור על שלבים 2.1.4 ו- 2.5.2.
    3. מקד את המצלמה על משטח הלב, הפעל את LED 3 והפעל הספק אופטי של 1.27 mW mm-2 .
    4. כבו את אורות המעבדה והתחילו להקליט. ודא כי אות אופטי נרכש על ידי השוואת תדירות האות המתקבל לתדר האק"ג המוקלט. זה מבטיח כי האות האופטי המתקבל קשור אך ורק לפעילות החשמלית של הלב.
      הערה: מאחר שהאור הפלואורסצנטי הנפלט מהצבע הוא שבועי מאוד, המיפוי האופטי נעשה בחדר חשוך. פעולה זו מונעת הפרעות אות ממקורות אור אחרים.

תוצאות

הפרוטוקול מאפשר אינדוקציה של הפרעות קצב חדריות בלבבות מורין שלמים באמצעות פולסים פוטוסטימולציה הנוצרים על ידי LED 1 ו-LED 2 (איור 1) עם תדר f ind בין 25 הרץ ל-35 הרץ ומשך פולס Wind בין 2 אלפיות השנייה ל-10 אלפיות השנייה. שימו לב שהמטרה של פעימות אור מהירות כאלה היא לא ללכוד את ?...

Discussion

טיפול מוצלח של tachyarrhythmias לב הוא המפתח לטיפול לב. עם זאת, המנגנונים הביופיזיקליים העומדים בבסיס התחלת הפרעות קצב, הנצחה וסיום אינם מובנים במלואם. לכן, מחקר לב שואף לייעל את הטיפול בהלם חשמלי לקראת סיום עדין יותר של הפרעות קצב, ובכך להגדיל את איכות החיים של המטופלים 28,29,30,31.

Disclosures

המחברים אינם מצהירים על ניגוד עניינים כלשהו.

Acknowledgements

המחברים רוצים להודות למריון קונזה וטינה אלטהאוס על התמיכה הטכנית המצוינת שלהם במהלך הניסויים. המחקר שהוביל לתוצאות קיבל מימון מתוכנית המסגרת השביעית של הקהילה האירופית FP7/2007-2013 במסגרת הסכם מענק מספר HEALTH-F2-2009-241526. התמיכה ניתנה גם על ידי המרכז הגרמני לחקר הלב וכלי הדם, DZHK e.V. (פרויקט MD28), האתר השותף Goettingen, קרן המחקר הגרמנית CRC 1002 (פרויקט C03), ואגודת מקס פלנק. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי BrainLinks-BrainTools, אשכול מצוינות במימון קרן המחקר הגרמנית (DFG, מענק מספר EXC 1086).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Chemical Components
BlebbistatinTargetMolT603810 mM stock solution
BSA/AlbuminSigma-AldrichA4919
Calcium ChlorideSigma-AldrichC1016CaCl2
CarbogenWestfalen50 l bottle
DI-4-ANBDQPQAAT Bioquest21499Dye for Optical Mapping
GlucoseSigma-AldrichD9434C6H12O6
HeparinLEO PharmaHeparin-Natrium Leo 25.000 I.E./5 ml, available only on prescription
Hydrochlorid AcidMerck1.09057.1000HCl, 1 M stock solution
IsofluraneCP Pharma1 ml/ml, available only on prescription
Magnesium ChlorideMerck8.14733.0500MgCl2
Monopotassium PhosphateSigma-Aldrich30407KH2PO4
Pinacidil monohydrateSigma-AldrichP154-500mg10 mM stock solution
Potassium ChlorideSigma-AldrichP5405KCl
Sodium BicarbonateSigma-AldrichS5761NaHCO3
Sodium ChlorideSigma-AldrichS5886NaCl
Sodium HydroxideMerck1.09137.1000NaOH, 1 M stock solution
Electrical Setup
Biopac MP150Biopac SystemsMP150WSWdata acquisition and analysis system
Custom-built ECG, alternative ECG100CBiopac SystemsECG100CElectrocardiogram Amplifier
Custom-built water bath heater using heating cableRMS Heating SystemHK-5,0-12Heating cable 120W
Hexagonal water bath
LED Driver Power supplyThorlabsKPS10115 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for One K- or T-Cube.
LEDD1B LED DriverThorlabsLEDD1BT-Cube LED Driver, 1200 mA Max Drive Current
MAP, ECG ElectrodeHugo Sachs ElektronikBS4 73-0200Mini-ECG Electrode for isoalted hearts
micro-LED Driver e.g. AFGAgilent InstrumentsA-2230Arbitrary function generator (AFG)
Signal GeneratorAgilent InstrumentsA-2230AFG
micro-LED Array Components
Epoxid glueEpoxy TechnologyEPO-TEK 353NDTwo component epoxy
Fluoropolymer Asahi Glass Co. Ltd.Cytop 809MFluoropolymer with high transparency
Image reversal photoresistMerck KGaAAZ 5214EImage Reversal Resist for High Resolution
LED chip Cree Inc.C460TR2227-S2100Blue micro-LED
PhotoresistMerck KGaAAZ 9260Thick Positive Photoresists
PolyimideUBE Industries Ltd.U-Varnish SPolyimide Solution
SiliconeNuSil Technology LLCMED-6215Low viscosity silicone elastomer
Solvent free adhesiveJohn P. Kummer GmbHEpo-Tek 301-2Epoxy resin with low viscosity
Optical Mapping
Blue FilterChroma Technology CorporationET470/40xBlue excitation filter
CameraPhotometricsCascade 128+High performance EMCCD Camera
Camera ObjectiveNavitarDO-5095Navitar high speed fixed focal length lenses work with CCD and CMOS cameras
Dichroic MirrorSemrockFF685-Di02-25x36685 nm edge BrightLine® single-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter
Emmision FilterSemrockFF01-775/140-25775/140 nm BrightLine® single-band bandpass filter
HeatsinkAdvanced Thermal SolutionsATSEU-077A-C3-R0Heat Sinks - LED STAR LED Heatsink, 45mm dia., 68mm, Black/Silver, Unthreaded Baseplate Hardware
LED 1 and LED 2LED Engin OsramLZ4-00B208High Power LEDs - Single Colour Blue, 460 nm 130 lm, 700mA
LED 3ThorlabsM625L3625 nm, 700 mW (Min) Mounted LED, 1000 mA
LensesLED Engin OsramLLNF-2T06-HLED Lighting Lenses Assemblies LZ4 LENS NARROW FLOOD BEAM
Photodiode for power meterThorlabsS120VCStandard Photodiode Power Sensor
Power MeterThorlabsPM100DCompact Power and Energy Meter
Red FilterSemrockFF02-628/40-25BrightLine® single-band bandpass filter

References

  1. Davidenko, J. M., Pertsov, A. V., Salamonsz, R. Stationary and drifting spiral waves of excitation in isolated cardiac muscle. Nature. 355, 349-351 (1992).
  2. Fenton, F. H., et al. Termination of atrial fibrillation using pulsed low-energy far-field stimulation. Circulation. 120 (6), 467-476 (2009).
  3. Luther, S., et al. Low-energy control of electrical turbulence in the heart. Nature. 475, 235-239 (2011).
  4. Pumir, A., et al. Wave emission from heterogeneities opens a way to controlling chaos in the heart. Physical Review Letters. 99, 208101 (2007).
  5. Deisseroth, K. Optogenetics. Nature Methods. 8, 26-29 (2011).
  6. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
  7. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  8. Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo. Nature Methods. 7, 897-900 (2010).
  9. Natasha, G., et al. et al.Channelrhodopsins: visual regeneration and neural activation by a light switch. New Biotechnology. 30 (5), 461-474 (2013).
  10. Zhang, F., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446, 633-639 (2007).
  11. Alilain, W. J., et al. Light-induced rescue of breathing after spinal cord injury. Journal of Neuroscience. 28 (46), 11862-11870 (2008).
  12. Ahmad, A., Ashraf, S., Komai, S. Optogenetics applications for treating spinal cord injury. Asian Spine Journal. 9 (2), 299-305 (2015).
  13. Dieter, A., Keppeler, D., Moser, T. Towards the optical cochlear implant: Optogenetic approaches for hearing restoration. EMBO Molecular Medicine. 12 (4), e11618 (2020).
  14. Keppeler, D., et al. Multichannel optogenetic stimulation of the auditory pathway using microfabricated LED cochlear implants in rodents. Science Translational Medicine. 12 (553), eabb8086 (2020).
  15. Verhoefen, M. K., Bamann, C., Blöcher, R., Förster, U., Bamberg, E. The photocycle of channelrhodopsin-2: ultrafast reaction dynamics and subsequent reaction steps. ChemPhysChem. 11 (14), 3113-3122 (2010).
  16. Schwaerzle, M., Elmlinger, P., Paul, O., Ruther, P. Miniaturized tool for optogenetics based on an LED and an optical fiber interfaced by a silicon housing. , 5252-5255 (2014).
  17. Schwaerzle, M., Elmlinger, P., Paul, O., Ruther, P. Miniaturized 3 x 3 optical fiber array for optogenetics with integrated 460 nm light sources and flexible electrical interconnection. , 162-165 (2015).
  18. Diaz-Maue, L., Schwaerzle, M., Ruther, P., Luther, S., Richter, C. Follow the light - From low-energy defibrillation to multi-site photostimulation. , 4832-4835 (2018).
  19. Zgierski-Johnston, C., et al. Cardiac pacing using transmural multi-LED probes in channelrhodopsin-expressing mouse hearts. Progress in Biophysics and Molecular Biology. , 51-61 (2020).
  20. . mouser.de, LED Engin, [Online] Available from: https://www.mouser.de/datasheet/2/228/5412893-LED_2520Engin_Datasheet_LuxiGen_LZ4-00B208 (2020)
  21. . thorlabs.com, thorlabs, [Online] Available from: https://www.thorlabs.com/_sd.cfm?fileName=25135-S01.pdf&partNumber=M625L3 (2020)
  22. Bruegmann, T., et al. Optogenetic defibrillation terminates ventricular arrhythmia in mouse hearts and human simulations. Journal of Clinical Investigation. 126 (10), 3894-3904 (2016).
  23. Richter, C., Christoph, J., Lehnart, S. E., Luther, S. Optogenetic light crafting tools for the control of cardiac arrhythmias. Methods in Molecular Biology. 1408, 293-302 (2016).
  24. Quiñonez Uribe, R. A., Luther, S., Diaz-Maue, L., Richter, C. Energy-reduced arrhythmia termination using global photostimulation in optogenetic murine hearts. Frontiers in Physiology. 9 (1651), (2018).
  25. Moreno, I. LED irradiance pattern at short distances. Applied Optics. 59 (1), 190-195 (2020).
  26. Behrend, A., Bittihn, P., Luther, S. Predicting unpinning success rates for a pinned spiral in an excitable medium. , 345-348 (2010).
  27. Kappadan, V., et al. High-resolution optical measurement of cardiac restitution, contraction, and fibrillation dynamics in beating vs. blebbistatin-uncoupled isolated rabbit hearts. Frontiers in Physiology. 11 (464), (2020).
  28. Christoph, J., et al. Electromechanical vortex filaments during cardiac fibrillation. Nature. 555, 667-672 (2018).
  29. O'Shea, C. Cardiac optogenetics and optical mapping - Overcoming spectral congestion in all-optical cardiac electrophysiology. Frontiers in Physiology. 10 (182), (2019).
  30. Aras, K. K., Faye, N. R., Cathey, B., Efimov, I. R. Critical volume of human myocardium necessary to maintain ventricular fibrillation. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 11 (11), e006692 (2018).
  31. Trayanova, N., Doshi, A. N., Prakosa, A. How personalized heart modeling can help treatment of lethal arrhythmias: A focus on ventricular tachycardia ablation strategies in post-infarction patients. Wiley Interdisciplinary Reviews in System Biology and Medicine. 12 (3), 1477 (2020).
  32. Bingen, B., et al. Light-induced termination of spiral wave arrhythmias by optogenetic engineering of atrial cardiomyocytes. Cardiovascular Research. 104 (1), 194-205 (2014).
  33. Burton, R. A. B., et al. Optical control of excitation waves in cardiac tissue. Nature Photonics. 9 (12), 813-816 (2015).
  34. Dura, M., Schröder-Schetelig, J., Luther, S., Lehnart, S. E. Toward panoramic in situ mapping of action potential propagation in transgenic hearts to investigate initiation and therapeutic control of arrhythmias. Frontiers in Physiology. 5, 337 (2014).
  35. Crocini, C., et al. Optogenetics design of mechanistically-based stimulation patterns for cardiac defibrillation. Science Reports. 6 (35628), (2016).
  36. Nyns, E. C. A., et al. Optogenetic termination of ventricular arrhythmias in the whole heart: towards biological cardiac rhythm management. European Heart Journal. 38 (27), 2132-2136 (2017).
  37. Wilde, A. A. K+atp channel opening and arrhythmogenesis. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 24 (4), 35-40 (1994).
  38. Christoph, J., Luther, S. Marker-free tracking for motion artifact compensation and deformation measurements in optical mapping videos of contracting hearts. Frontiers in Physiology. 9 (1483), (2018).
  39. Christoph, J., Schröder-Schetelig, J., Luther, S. Electromechanical optical mapping. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 130(B), 150-169 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

174LEDDI 4 ANBDQPQBlebbistatinchannelrhodopsin 2ChR2

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved