Murin Kalplerde Optogenetik Çok Bölgeli Fotostimülasyon Uygulayarak İleri Kardiyak Ritim Yönetimi

Özet

Bu çalışma, transgenik channelrhodopsin-2 (ChR2) farelerinin bozulmamış murin kalplerinin kardiyak ritmini, bir mikro-LED dizisi ile lokal fotostimülasyon ve epikardiyal membran potansiyelinin eşzamanlı optik haritalamasını kullanarak kontrol etmek için bir yöntem bildirmektedir.

Özet

Ventriküler taşiaritmiler tüm dünyada mortalite ve morbiditenin önemli bir nedenidir. Yüksek enerjili elektrik şokları kullanan elektriksel defibrilasyon şu anda hayatı tehdit eden ventriküler fibrilasyonun tek tedavisidir. Bununla birlikte, defibrilasyonun dayanılmaz ağrı, doku hasarı ve prognozun kötüleşmesi gibi yan etkileri olabilir, bu da daha yumuşak kardiyak ritim yönetimi stratejilerinin geliştirilmesi için önemli bir tıbbi ihtiyacı gösterir. Enerji azaltıcı elektriksel yaklaşımların yanı sıra, kardiyak optogenetik, ışığa duyarlı membran iyon kanalları ve ışık darbeleri kullanarak kardiyak aktiviteyi etkilemek için güçlü bir araç olarak tanıtıldı. Bu çalışmada, Langendorff perfüze edilmiş sağlam murin kalplerinin başarılı fotostimülasyonu için sağlam ve geçerli bir yöntem, 3 x 3 mikro ışık yayan diyotlar dizisi (mikro-LED) uygulanan çok bölgeli pacing temelinde tanımlanacaktır. Epikardiyal membran voltaj dalgalarının eşzamanlı optik haritalanması, bölgeye özgü stimülasyonun etkilerinin araştırılmasına izin verir ve yeni indüklenen kardiyak aktiviteyi doğrudan yerinde değerlendirir. Elde edilen sonuçlar, defibrilasyonun etkinliğinin, kardiyak aritmi sırasında fotostimülasyon için seçilen parametrelere güçlü bir şekilde bağlı olduğunu göstermektedir. Kalbin aydınlatılmış bölgesinin sonlandırma başarısı için çok önemli bir rol oynadığı ve aritmi paternlerinin değiştirilmesi için aydınlatma sırasında kardiyak aktivitenin hedeflenen kontrolünün nasıl sağlanabileceği gösterilecektir. Özetle, bu teknik, kardiyak ritmin gerçek zamanlı geri besleme kontrolüne giden yolda yerinde mekanizma manipülasyonunu optimize etme imkanı ve bölgeye özgüllük açısından, spesifik olmayan elektrik şoku uygulamalarının kullanımına kıyasla kalp sistemine potansiyel zararı azaltmada yeni yaklaşımlar sunmaktadır.

Giriş

Aritmi sırasında mekansal-zamansal dinamiklerin erken araştırmaları, kardiyak fibrilasyon sırasındaki karmaşık elektriksel paternlerin vorteks benzeri dönen uyarma dalgaları tarafından yönlendirildiğini ortaya koymuştur¹. Bu bulgu, aritmilerin altında yatan mekanizmalar hakkında yeni bilgiler verdi ve bu da daha sonra miyokard ^2,3,4'ün çok bölgeli uyarılmasına dayanan yeni elektriksel sonlandırma tedavilerinin geliştirilmesine yol açtı. Bununla birlikte, elektrik alan stimülasyonu kullanan tedaviler lokal değildir ve kas dokusu da dahil olmak üzere çevredeki tüm uyarılabilir hücreleri innerve edebilir, hücresel ve doku hasarına ve dayanılmaz ağrıya neden olabilir. Elektriksel tedavilerin aksine, optogenetik yaklaşımlar, kardiyomiyosit aksiyon potansiyellerini yüksek uzamsal ve zamansal hassasiyetle uyandırmak için spesifik ve doku koruyucu bir teknik sağlar. Bu nedenle, optogenetik stimülasyon, kardiyak fibrilasyon sırasında kaotik aktivasyon paternlerinin minimal invaziv kontrolü için potansiyele sahiptir.

Işığa duyarlı iyon kanalı channelrhodopsin-2'nin (ChR2) genetik manipülasyon ^5,6,7 yoluyla uyarılabilir hücrelere sokulması^, fotostimülasyon kullanılarak uyarılabilir hücrelerin membran potansiyelinin depolarizasyonunu sağlamıştır. Nöronal ağların aktivasyonu, kardiyak aktivitenin kontrolü, görme ve işitmenin restorasyonu, omurilik yaralanmalarının tedavisi ve diğerleri^dahil olmak üzere çeşitli tıbbi uygulamalar geliştirilmiştir 8,9,10,11,12,13,14. ChR2'nin kardiyolojide uygulanması, milisaniye yanıt süresi¹⁵ nedeniyle önemli bir potansiyele sahiptir ve bu da onu aritmik kardiyak dinamiklerin hedeflenen kontrolü için çok uygun hale getirmektedir.

Bu çalışmada, transgenik bir fare modelinin sağlam kalplerinin çok bölgeli fotostimülasyonu gösterilmiştir. Özetle, Avrupa Topluluğu'nun Yedinci Çerçeve Programı FP7/2007-2013 (HEALTH-F2-2009-241526) kapsamında transgenik bir alfa-MHC-ChR2 fare hattı kurulmuş ve Prof. S. E. Lehnart tarafından sağlanmıştır. Genel olarak, alfa-MHC kontrolü altında Cre-rekombinaz eksprese eden transgenik yetişkin erkek C57 / B6 / J, dişi B6.Cg-Gt (ROSA) 26Sortm27.1 (CAG-COP4 * H134R / tdTomato) Hye / J ile çiftleşmek üzere eşleştirildi. Kardiyak STOP kaseti ikinci nesilde silindiğinden, yavrular stabil bir MHC-ChR2 ekspresyonu gösterdi ve kardiyak ışığa duyarlı kolonileri korumak için kullanıldı. Tüm deneyler, 36-48 haftalıkken her iki cinsiyetten yetişkin farelerle yapıldı. Aydınlatma, silikon bazlı mahfaza ve kısa optik cam elyaflarının uygulanmaması dışında,^16,17'de açıklandığı gibi imal edilen 3 x 3 mikro-LED dizisi kullanılarak elde edilir. Kardiyak bir uygulamada ilk kullanımı¹⁸ yılında bulunur. Benzer bir imalat teknolojisine dayanan doğrusal bir mikro-LED dizisi, kalp hızı¹⁹ için nüfuz edici bir prob olarak uygulanmıştır. Mikro LED'ler, 550 μm'lik bir aralıkta 3 x 3'lük bir dizilim halinde düzenlenmiştir ve çok küçük bir alanda hem yüksek uzamsal çözünürlük hem de yüksek radyant gücü sağlar. Yazarlar bu çalışmada, yeni anti-aritmik tedavi yöntemlerinin geliştirilmesinin yolunu açabilecek çok yönlü bir yerel çok bölgeli fotostimülasyon göstermektedir.

Aşağıdaki deneysel protokol, kanüle aortun perfüzyon girişi olarak işlev gördüğü retrograd Langendorff perfüzyon ex vivo'yu içerir. Uygulanan perfüzyon basıncı ve kardiyak kasılma nedeniyle perfüzyon, aorttan ayrılan koroner arterlerden akmaktadır. Sunulan çalışmada, kalp, perfüzyon rezervuarlarının 1 m yüksekliğe, 73.2 mmHg'ye eşdeğer olarak 2.633 ± 0.583 mL / dak akış hızına ulaşmasıyla elde edilen sabit bir basınç ayarı kullanılarak perfüze edilir. Deney sırasında iki çeşit Tyrode çözeltisi perfüzyon olarak kullanılır. Düzenli Tyrode çözeltisi kararlı bir sinüs ritmini desteklerken, Low-K ⁺ Tyrode çözeltisi, murin kalplerinde aritmi indüksiyonunu sağlamak için Pinacidil ile karıştırılır. Altıgen bir su banyosunun kullanılması, kalbin altı farklı düzlemsel pencereden gözlemlenmesine izin verir ve birkaç optik bileşenin kırılma ile daha az bozulma ile birleştirilmesine izin verir.

Protokol

Tüm deneyler, Alman mevzuatı, yerel hükümler ve Avrupa Laboratuvar Hayvanları Bilimi Dernekleri Federasyonu'nun (FELASA) tavsiyelerine uygun olarak hayvan refahı yönetmeliğini sıkı bir şekilde takip etti. Hayvan deneylerinin onaylanması için yapılan başvuru, sorumlu hayvan refahı otoritesi tarafından onaylanmış ve tüm deneyler hayvan refahı temsilcilerimize bildirilmiştir.

1. Deney hazırlama ve materyalleri

1. Optik haritalama kurulumu
   NOT: Optik kurulum ve elektrik kurulumu Şekil 1'de gösterilmiştir. Optik ve elektrik kurulumunda kullanılan tüm bileşenler Malzeme Tablosunda ayrıntılı olarak listelenmiştir.
   1. Aritmi indüksiyonu ve yedek defibrilasyon için LED 1 ve LED 2 kullanın. ChR2^6'nın uyarma dalga boyunun zirvesi olan 475 nm'ye yakın λ_mavi dalga boyuna sahip yüksek güçlü LED'leri seçin. Optik spektrumu daha da daraltmak için 470 ± 20 nm bandpass filtresi kullanın.
      NOT: Bu çalışmada, veri sayfası^20'ye göre, LED 1 ve LED 2, 3,9 ila 5,3 W tipik bir radyant akıya sahiptir.
   2. Optik haritalama için epikardiyumu, λ kırmızı = 625 nm merkez dalga boyuna ve 700 mW 21 radyant akıya sahip ışık yayan yüksek güçlü_kırmızı bir LED (Şekil^1'de LED 3) ile aydınlatın. Kırmızı ışık, 628 ± 20 nm bandpass filtresi ile filtrelenir ve λ DM = 685 nm kesme dalga boyuna sahip uzun geçişli dikroik ayna (_DM ) tarafından yansıtılır.
   3. Sadece kardiyak aktivitenin floresan emisyonunu kaydetmek için kamera hedefinin önünde λ_{filtre kamı} = 775 ± 70 nm olan bir emisyon filtresi kullanın. Düşük ışıklı uygulamalar için çok uygun olan hızlı bir hedef kullanın.
      NOT: Bir fare kalbinin fibrilasyon frekansı 20 ila 35 Hz arasında değişir; bu nedenle, 1 ila 2 kHz veya daha yüksek bir frekansta kayıt yapmak için yeterince hızlı bir kamera kullanın.
2. Mikro-LED dizisi
   NOT: Burada uygulanan mikro-LED dizileri,^16,17 başka bir yerde daha ayrıntılı olarak açıklandığı gibi mikro sistem işleme kullanılarak gerçekleştirilir.
   1. Spin, 5 μm kalınlığında bir poliimid (PI) tabakayı 4 inç silikon substratlar üzerine (tek tarafı cilalı, 525-μm kalınlığında) kaplayın.
   2. Bu PI tabakasını azot atmosferi altında maksimum 450 °C sıcaklıkta kürleyin. Maksimum sıcaklığı 10 dakika boyunca sabit tutun.
   3. Ultraviyole (UV) litografi kullanarak bir görüntü tersine çevrilmiş fotodirenci (PR) biriktirin ve desenleyin ve püskürtün, 250 nm ince bir platin tabaka (Pt) biriktirin.
   4. Bu Pt bazlı metalizasyonu, maskeleme tabakası görevi gören desenli PR ile 1 μm kalınlığında altın (Au) bir tabakayı elektro kaplama yaparak kalınlaştırın.
   5. İkinci bir PI katmanını spin kaplamadan önce, gofreti ilk PI tabakası ve Au-elektrolize metalizasyonu ile PI tabakasının yüzeyini kimyasal olarak aktive eden bir oksijen plazmasına maruz bırakın.
   6. İkinci PI katmanını 450 ° C'de tekrar kürleyin, bir PR katmanını modellemek için UV litografisi uygulayın ve desenli PR'yi maskeleme katmanı olarak kullanarak reaktif iyon aşındırma (RIE) ile mikro-LED çipleri ve ara yüzey baskılı devre kartı (PCB) için dizinin temas pedlerini açın.
      NOT: Bu RIE işlem adımlarında, kontak pedi açıklıklarını ve iki boyutlu (2B) mikro-LED dizisinin dış şeklini tanımlamak için sırasıyla 10 ve 30 dakika boyunca 200 W ve 100 W uygulanması önerilir.
   7. PR'yi çözücüler ve plazma aşındırma kullanarak sıyırın. Ek 6 μm kalınlığında altın tabakayı elektro kaplama yaparak temas pedlerini daha da kalınlaştırın.
   8. Mikro-LED çipleri, bir flip-chip bağlayıcı kullanarak temas pedlerine takın.
   9. PI yüzeyini bir oksijen plazmasında etkinleştirin ve mikro-LED çiplerini solventsiz bir yapıştırıcı ile doldurun. Daha sonra yapıştırıcıyı 120 ° C'de 12 saat kürleyin.
   10. Mikro-LED çipleri kapsüllemek için, Argon ile başka bir plazma işlemi gerçekleştirin ve manuel olarak ince bir floropolimer tabakası uygulayın. Bu tabakayı 1 saat boyunca 80 ° C'de önceden kürleyin.
   11. Mikro-LED dizisini altta yatan floropolimer tabakasına silikon yapışmasını iyileştirmek için kullanılan bir oksijen plazmasına maruz bıraktıktan sonra silikonu son kapsülleme tabakası olarak manuel olarak uygulayın. Silikon tabakayı her biri 1 saat boyunca 80 °C ve 180 °C'de kürleyin. Bu son kürleme adımları aynı zamanda floropolimer tabakasını tamamen iyileştirir.
   12. PI substratının temas pedlerini, dizinin harici bir enstrümantasyona birbirine bağlanması için şerit konektörleri taşıyan baskılı bir devre kartına lehimleyin. PCB üzerindeki lehim pedlerini bir yapıştırıcı kullanarak örtün.
3. Elektrik tesisatı
   1. Kalbin elektriksel aktivitesini sürekli izlemek için bir elektrokardiyogram (EKG) kaydetmek için uygun elektrotlar, örneğin gümüş / gümüş-klorür elektrotları veya Monofazik Eylem Potansiyeli (MAP) elektrotları ve bir EKG amplifikatörü kullanın. Ayrıca, elde edilen tüm elektrik sinyallerini kaydetmek için uygun bir toplama cihazı (AD) kullanın.
   2. Her aygıta uygulanan maksimum akımı yönetebilen yüksek güçlü LED'ler (LED 1, LED 2 ve LED 3) için çok uygun bir sürücü seçin. LED sürücülerin çıkışını doğru bir şekilde kontrol etmek için rastgele bir işlev üreteci (AFG) kullanın.
   3. Mikro LED dizisinden akan akımı kontrol etmek için çok kanallı bir LED sürücüsü kullanın. Birden fazla çıkışa sahip bir AFG de bu görev için uygundur.
      NOT: Akımı mikro-LED'in maksimum akımıyla sınırlayan LED sürücülerin seçilmesi önerilir, aksi takdirde diyotlar hasar görebilir. Çok kanallı bir mikro-LED sürücünün bir örneği başka bir çalışmada açıklanmıştır¹⁸. Gerekirse, mikro LED ayarlarını uzaktan denetlemek için AFG veya başka bir LED sürücüsü bir bilgisayara bağlanabilir. Bu durumda, LED sürücüsünü seçtiğiniz iletişim protokolüyle bilgisayara bağlayın, örneğin Genel Amaçlı Arabirim Veri Yolu (GPIB) veya seri bağlantı.

   

2. Deneysel prosedürler

1. Çözelti hazırlama
   1. Tyrode çözeltisini hazırlayın: 130 mM NaCl, 4 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 24 mM NaHCO₃, 1.8 mM CaCl 2, 1.2 mM KH ₂ PO₄, 5.6 mM Glikoz,% 0.1 BSA/ Albümin.
   2. Low-K+ Tyrode çözümünü hazırlayın: Low-K⁺ Tyrode'lar, KCl miktarının sadece yarısı eklenmesi dışında normal Tyrode çözeltisiyle aynı şekilde yapılır (4 mM KCl yerine 2 mM).
      NOT: 3 saat süren bir deney için genellikle 2-3 L Low-K⁺ Tyrode (ayrıca optik haritalama yapılırsa Blebbistatin (Adım 2.1.5) ile karıştırılır) ve 1-2 L normal Tyrode yeterlidir.
   3. 100 mM'lik bir konsantrasyon elde etmek için^22'de açıklandığı gibi aritmi indüksiyon işlemini kolaylaştırmak için Low-K ⁺ Tyrode çözeltisine Pinacidil ekleyin. Pinacidil'i kullanırken koruyucu laboratuvar eldivenleri giyin.
   4. Düzenli Tyrode çözeltisi ile 1 mL 50 μM DI-4-ANBDQPQ hazırlayın. Fotobeyazlatmayı önlemek için boyayı ışıktan koruyun.
   5. 10 mM'lik bir Blebbistatin stok çözeltisi yapın. Optik haritalama için, 5 μM'lik bir çözelti elde etmek için Blebbistatin'i 100 mM Pinacidil-Tyrode çözeltisi (Adım 2.1.3) ile karıştırın. Blebbistatin'i kullanırken koruyucu laboratuvar eldivenleri giyin.
      NOT: Optik haritalama başlayana kadar hem boyayı hem de Blebbistatin çözeltisini bir kenara bırakın.
2. Langendorff perfüzyonu
   NOT: Kurulum, iki Tyrode çözümü için iki rezervuardan oluşur. Üç yönlü musluklara sahip tüplerle bir kabarcık tuzağına bağlanırlar. Kalp daha sonra bir Luer kilit konektörü ile kabarcık tuzağına bağlanır ve daha sonra altıgen bir su banyosunda askıya alınır. Su banyosu, sırayla, kullanılmış Tyrode çözeltisini toplamak için bir atık kabına bağlanır.
   1. Her deneyden önce tüm tüpleri tamamen demineralize su ile temizleyin.
   2. Deneye başlamadan önce her iki Tyrode çözeltisini de oda sıcaklığında 30 dakika boyunca Karbojenli (%5 CO 2_{ve %} 95_O2) havalandırın. Tyrode çözeltilerinin pH değerini NaOH ile 7,4'e ayarlayın.
   3. Her Tyrode çözeltisinin 500 mL'sini ilgili rezervuara doldurun ve tüplerde veya kabarcık tuzağında daha fazla sıkışmış hava kabarcığı görülmeyene kadar Tyrode'un çözeltisini perfüzyon sisteminden geçirerek tüplerin ve kabarcık tuzağının havasını giderin.
   4. Perfüzyonun pH'ının daha sonra perfüzyon sırasında sabit kalmasını sağlamak için rezervuarlardaki tüm deney boyunca Tyrode çözeltilerini Karbojenle havalandırmaya devam edin.
   5. Perfüzyon sistemini bir su ısı pompası ile 37 ° C'ye ısıtın. Su geçirmez bir ısıtma kablosu gibi ek bir ısıtma elemanı kullanarak su banyosu içinde perfüzyon sıcaklığını sabit tutun.
      NOT: Deney sırasında, Tyrode'un rezervuarlarını boş çalışmadan önce yeniden doldurmak çok önemlidir. Aksi takdirde, hava kabarcıkları kalbe girebilir, bu da damarları tıkayabilir ve iskemiye yol açabilir.
3. Fare Hazırlığı
   1. Kalp izolasyon prosedüründen 30 dakika önce deri altından 0.1 mL 500 yani Heparin enjekte edin.
   2. 6 cm'lik bir Petri kabını ve 2 mL'lik bir şırıngayı buz gibi soğuk Tyrode çözeltisi ile doldurun. Stereoskopik mikroskop altına yerleştirin.
   3. 2 dakika boyunca doymuş bir İzofluran ortamı ile farelerin kısa süreli anestezisini ve daha sonra derhal servikal çıkığı gerçekleştirin.
      NOT: Yeterli anesteziyi doğrulamak için negatif ayak parmakları arası refleksin kontrol edilmesi kesinlikle gereklidir.
   4. Göğsü açın, başka bir yerde açıklandığı gibi kalbi çıkarın²³ ve buz gibi soğuk Tyrode çözeltisi ile 6 cm'lik Petri kabına yerleştirin. Kardiyak atım, sıcaklık düşüşü nedeniyle azalacaktır.
   5. İnce hazırlığı, başka bir yerde detaylandırıldığı gibi stereoskopik bir mikroskop altında^{yapın 23}. Aortu künt iğneye takın ve damarı dikiş malzemesiyle sabitleyin.
   6. Bir kontrol olarak, buz gibi soğuk Tyrode'un solüsyonunu iğneden kalbe enjekte edin ve kalbin sıkıca monte edildiğini kontrol edin. Bu adım aynı zamanda kalpten kalan kanı da durular.
   7. Monte edilmiş kalbi perfüzyon sistemine aktarın. İğneyi kabarcık tuzağına bağlarken havanın kalbe girmesini önlemek için perfüzyonun aktığından emin olun. Kalbin su banyosunda Tyrode çözeltisi ile kaplı olup olmadığını kontrol edin. Adım 2.3.4, 2.3.5 ve 2.3.7 Şekil 2'de gösterilmiştir.
   8. Kalbin birkaç dakika içinde atmaya başladığından emin olun. Kalbin 15 ila 20 dakika boyunca perfüzyon kurulumuna adapte olmasına izin verin, ardından optik haritalama yapılacaksa, Pinacidil ile düşük K ⁺ Tyrode çözeltisine (Adım 2.1.3) sırasıyla Pinacidil ve Blebbistatin ile düşük K ⁺ Tyrode çözeltisine (Adım 2.1.5) geçin.
4. Aritmi indüksiyonu ve optik defibrilasyon
   1. İyi sinyal kalitesi sağlamak için EKG elektrotlarından birini kalp yüzeyine mümkün olduğunca yakın yerleştirin. İkinci EKG elektrodunu Tyrode çözeltisinde askıya alın. Edinilen EKG'nin tercih edilen AD tarafından kaydedildiğinden emin olun.
   2. Mikro-LED dizisini çalışmanın ilgi alanına, örneğin sol ventriküle yerleştirin.
   3. Perfüzyonu Pinacidil ile düşük K ⁺ Tyrode'lara değiştirin ve kalbi 15 ila 30 dakika boyunca perfüze edin.
   4. Aritmi indüklemek için, kalbi LED 1 ve LED 2 ile, 25 ila 35 Hz frekans f_ind, 2 ila 15 ms darbe W_ind ve 2,8 mW ^mm-2 ışık yoğunluğu LI_{opt_ind} ile 20 ila 50 ışık darbesinden oluşan bir trenle aydınlatın.
   5. Aritmi indüklenene kadar işlemi tekrarlayın.
      NOT: EKG sinyalinde aritmilerin tanımlanması kolaydır, çünkü sinyalin frekansı ve morfolojisi normal sinüs ritminden farklıdır. Aritmi sonraki 5 saniye içinde sona ererse, kendi kendine sonlanan olarak sınıflandırın ve yeni bir indüksiyon girişimi başlatın.
   6. Sürekli bir aritmi görsel olarak tespit edildikten sonra, 15 mA'lık bir darbe akımında dizinin üç, altı veya dokuz mikro LED'ini kullanarak, farklı genişliklerde W def ve frekansları f_def olan bir_darbe patlaması uygulayın I darbe, ışık yoğunluğuna LI_μLED = 33.31 ± 2.05 mW ^mm-2'ye kadar verir.
   7. Beş mikro-LED dizi tabanlı defibrilasyon denemesinden sonra aritmi devam ederse, girişimi başarısız olarak sınıflandırın ve yedek defibrilasyona başlayın.
   8. Yedek defibrilasyon için, mikro LED dizisi için ayarlanan zamanlama parametrelerinin aynısını kullanarak LED 1 ve LED 2'yi kullanın.
      NOT: Kalp tüm deney süresi boyunca iskemik ve metabolik strese maruz kaldığından, yedek defibrilasyonda bile aritmi sonlandırma girişimlerinin başarısız olması mümkündür. Bu olduğunda, perfüzyon solüsyonunu normal Tyrode'lara değiştirin ve kalbin 5 ila 10 dakika iyileşmesine izin verin. EKG sinüs ritmine döndüğünde, Adım 2.4.3'teki protokolü tekrar tekrarlayın.
5. Optik Haritalama
   1. Kalbi Adım 2.1.5'te hazırlanan Blebbistatin çözeltisi ile perfüze edin ve mekanik ayrılma gerçekleşene kadar bekleyin. Bu, kalp atmayı bıraktığında gerçekleştirilir, ancak bir EKG sinyali hala ölçülebilir.
      NOT: Blebbistatin çözeltisinin belirtilen konsantrasyona karıştırılması ve kalbin bu çözelti ile perfüze edilmesi, tüm deney boyunca elektriksel aktiviteden ayrılan kardiyak mekanik aktiviteyi korur.
   2. 1 mL gerilim boyası DI-4-ANBDQPQ'yu (Adım 2.1.4'te hazırlanmıştır) Langendorff perfüzyonunun kabarcık tuzağında bir bolus olarak verin. Boyanın kalbi düzgün bir şekilde delmesine izin vermek için 5 ila 10 dakika bekleyin.
      NOT: Kayıt yapılmadığında kırmızı ışığı kapatarak boyanın fotobeyazlatılmasını önleyin. Kaydın sinyal-gürültü oranı çok küçülürse (alınan sinyal çok gürültülüyse), 2.1.4 ve 2.5.2 numaralı adımları tekrarlayın.
   3. Fotoğraf makinesini kalp yüzeyine odaklayın, LED 3'ü açın ve 1,27 mW ^mm-2 optik güç uygulayın.
   4. Laboratuvar ışıklarını kapatın ve kayda başlayın. Elde edilen sinyalin frekansını kaydedilen EKG'nin frekansı ile karşılaştırarak optik bir sinyalin alındığından emin olun. Bu, elde edilen optik sinyalin tamamen kalbin elektriksel aktivitesi ile ilgili olmasını sağlar.
      NOT: Boyanın yaydığı floresan ışığı çok hafta olduğundan, optik haritalama karanlık bir odada yapılır. Bu, diğer ışık kaynaklarından gelen sinyal parazitini önler.

Sonuçlar

Protokol, LED 1 ve LED 2 (Şekil 1) tarafından üretilen fotostimülasyon darbelerini kullanarak sağlam murin kalplerde ventriküler aritmilerin indüklenmesine izin verir ve 25 Hz ile 35 Hz arasında bir frekans f ind ve 2 ms ile 10 ms arasında bir nabız süresi W_ind. Bu kadar hızlı ışık darbelerinin amacının kalp ritmini yakalamak değil, kardiyak aktivitenin dengesini bozmak olduğunu, böylece düzensiz elektrik dalgalarının üretilebileceğini ve bunun...

Tartışmalar

Kardiyak taşiaritmilerin başarılı bir tedavisi kardiyak tedavinin anahtarıdır. Ancak aritmi başlangıcı, sürekliliği ve sonlandırılmasının altında yatan biyofiziksel mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Bu nedenle, kardiyak araştırmalar, elektrik şoku tedavisini aritmilerin daha yumuşak bir şekilde sonlandırılmasına yönelik olarak optimize etmeyi ve böylece hastaların yaşam kalitesini arttırmayı amaçlamaktadır 28,29,30,31....

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemical Components
Blebbistatin	TargetMol	T6038	10 mM stock solution
BSA/Albumin	Sigma-Aldrich	A4919
Calcium Chloride	Sigma-Aldrich	C1016	CaCl2
Carbogen	Westfalen		50 l bottle
DI-4-ANBDQPQ	AAT Bioquest	21499	Dye for Optical Mapping
Glucose	Sigma-Aldrich	D9434	C6H12O6
Heparin	LEO Pharma		Heparin-Natrium Leo 25.000 I.E./5 ml, available only on prescription
Hydrochlorid Acid	Merck	1.09057.1000	HCl, 1 M stock solution
Isoflurane	CP Pharma		1 ml/ml, available only on prescription
Magnesium Chloride	Merck	8.14733.0500	MgCl2
Monopotassium Phosphate	Sigma-Aldrich	30407	KH2PO4
Pinacidil monohydrate	Sigma-Aldrich	P154-500mg	10 mM stock solution
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P5405	KCl
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761	NaHCO3
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S5886	NaCl
Sodium Hydroxide	Merck	1.09137.1000	NaOH, 1 M stock solution
Electrical Setup
Biopac MP150	Biopac Systems	MP150WSW	data acquisition and analysis system
Custom-built ECG, alternative ECG100C	Biopac Systems	ECG100C	Electrocardiogram Amplifier
Custom-built water bath heater using heating cable	RMS Heating System	HK-5,0-12	Heating cable 120W
Hexagonal water bath
LED Driver Power supply	Thorlabs	KPS101	15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for One K- or T-Cube.
LEDD1B LED Driver	Thorlabs	LEDD1B	T-Cube LED Driver, 1200 mA Max Drive Current
MAP, ECG Electrode	Hugo Sachs Elektronik	BS4 73-0200	Mini-ECG Electrode for isoalted hearts
micro-LED Driver e.g. AFG	Agilent Instruments	A-2230	Arbitrary function generator (AFG)
Signal Generator	Agilent Instruments	A-2230	AFG
micro-LED Array Components
Epoxid glue	Epoxy Technology	EPO-TEK 353ND	Two component epoxy
Fluoropolymer	Asahi Glass Co. Ltd.	Cytop 809M	Fluoropolymer with high transparency
Image reversal photoresist	Merck KGaA	AZ 5214E	Image Reversal Resist for High Resolution
LED chip	Cree Inc.	C460TR2227-S2100	Blue micro-LED
Photoresist	Merck KGaA	AZ 9260	Thick Positive Photoresists
Polyimide	UBE Industries Ltd.	U-Varnish S	Polyimide Solution
Silicone	NuSil Technology LLC	MED-6215	Low viscosity silicone elastomer
Solvent free adhesive	John P. Kummer GmbH	Epo-Tek 301-2	Epoxy resin with low viscosity
Optical Mapping
Blue Filter	Chroma Technology Corporation	ET470/40x	Blue excitation filter
Camera	Photometrics	Cascade 128+	High performance EMCCD Camera
Camera Objective	Navitar	DO-5095	Navitar high speed fixed focal length lenses work with CCD and CMOS cameras
Dichroic Mirror	Semrock	FF685-Di02-25x36	685 nm edge BrightLine® single-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter
Emmision Filter	Semrock	FF01-775/140-25	775/140 nm BrightLine® single-band bandpass filter
Heatsink	Advanced Thermal Solutions	ATSEU-077A-C3-R0	Heat Sinks - LED STAR LED Heatsink, 45mm dia., 68mm, Black/Silver, Unthreaded Baseplate Hardware
LED 1 and LED 2	LED Engin Osram	LZ4-00B208	High Power LEDs - Single Colour Blue, 460 nm 130 lm, 700mA
LED 3	Thorlabs	M625L3	625 nm, 700 mW (Min) Mounted LED, 1000 mA
Lenses	LED Engin Osram	LLNF-2T06-H	LED Lighting Lenses Assemblies LZ4 LENS NARROW FLOOD BEAM
Photodiode for power meter	Thorlabs	S120VC	Standard Photodiode Power Sensor
Power Meter	Thorlabs	PM100D	Compact Power and Energy Meter
Red Filter	Semrock	FF02-628/40-25	BrightLine® single-band bandpass filter