Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.
Method Article
* Bu yazarlar eşit katkıda bulunmuştur
Bu çalışma, transgenik channelrhodopsin-2 (ChR2) farelerinin bozulmamış murin kalplerinin kardiyak ritmini, bir mikro-LED dizisi ile lokal fotostimülasyon ve epikardiyal membran potansiyelinin eşzamanlı optik haritalamasını kullanarak kontrol etmek için bir yöntem bildirmektedir.
Ventriküler taşiaritmiler tüm dünyada mortalite ve morbiditenin önemli bir nedenidir. Yüksek enerjili elektrik şokları kullanan elektriksel defibrilasyon şu anda hayatı tehdit eden ventriküler fibrilasyonun tek tedavisidir. Bununla birlikte, defibrilasyonun dayanılmaz ağrı, doku hasarı ve prognozun kötüleşmesi gibi yan etkileri olabilir, bu da daha yumuşak kardiyak ritim yönetimi stratejilerinin geliştirilmesi için önemli bir tıbbi ihtiyacı gösterir. Enerji azaltıcı elektriksel yaklaşımların yanı sıra, kardiyak optogenetik, ışığa duyarlı membran iyon kanalları ve ışık darbeleri kullanarak kardiyak aktiviteyi etkilemek için güçlü bir araç olarak tanıtıldı. Bu çalışmada, Langendorff perfüze edilmiş sağlam murin kalplerinin başarılı fotostimülasyonu için sağlam ve geçerli bir yöntem, 3 x 3 mikro ışık yayan diyotlar dizisi (mikro-LED) uygulanan çok bölgeli pacing temelinde tanımlanacaktır. Epikardiyal membran voltaj dalgalarının eşzamanlı optik haritalanması, bölgeye özgü stimülasyonun etkilerinin araştırılmasına izin verir ve yeni indüklenen kardiyak aktiviteyi doğrudan yerinde değerlendirir. Elde edilen sonuçlar, defibrilasyonun etkinliğinin, kardiyak aritmi sırasında fotostimülasyon için seçilen parametrelere güçlü bir şekilde bağlı olduğunu göstermektedir. Kalbin aydınlatılmış bölgesinin sonlandırma başarısı için çok önemli bir rol oynadığı ve aritmi paternlerinin değiştirilmesi için aydınlatma sırasında kardiyak aktivitenin hedeflenen kontrolünün nasıl sağlanabileceği gösterilecektir. Özetle, bu teknik, kardiyak ritmin gerçek zamanlı geri besleme kontrolüne giden yolda yerinde mekanizma manipülasyonunu optimize etme imkanı ve bölgeye özgüllük açısından, spesifik olmayan elektrik şoku uygulamalarının kullanımına kıyasla kalp sistemine potansiyel zararı azaltmada yeni yaklaşımlar sunmaktadır.
Aritmi sırasında mekansal-zamansal dinamiklerin erken araştırmaları, kardiyak fibrilasyon sırasındaki karmaşık elektriksel paternlerin vorteks benzeri dönen uyarma dalgaları tarafından yönlendirildiğini ortaya koymuştur1. Bu bulgu, aritmilerin altında yatan mekanizmalar hakkında yeni bilgiler verdi ve bu da daha sonra miyokard 2,3,4'ün çok bölgeli uyarılmasına dayanan yeni elektriksel sonlandırma tedavilerinin geliştirilmesine yol açtı. Bununla birlikte, elektrik alan stimülasyonu kullanan tedaviler lokal değildir ve kas dokusu da dahil olmak üzere çevredeki tüm uyarılabilir hücreleri innerve edebilir, hücresel ve doku hasarına ve dayanılmaz ağrıya neden olabilir. Elektriksel tedavilerin aksine, optogenetik yaklaşımlar, kardiyomiyosit aksiyon potansiyellerini yüksek uzamsal ve zamansal hassasiyetle uyandırmak için spesifik ve doku koruyucu bir teknik sağlar. Bu nedenle, optogenetik stimülasyon, kardiyak fibrilasyon sırasında kaotik aktivasyon paternlerinin minimal invaziv kontrolü için potansiyele sahiptir.
Işığa duyarlı iyon kanalı channelrhodopsin-2'nin (ChR2) genetik manipülasyon 5,6,7 yoluyla uyarılabilir hücrelere sokulması, fotostimülasyon kullanılarak uyarılabilir hücrelerin membran potansiyelinin depolarizasyonunu sağlamıştır. Nöronal ağların aktivasyonu, kardiyak aktivitenin kontrolü, görme ve işitmenin restorasyonu, omurilik yaralanmalarının tedavisi ve diğerleridahil olmak üzere çeşitli tıbbi uygulamalar geliştirilmiştir 8,9,10,11,12,13,14. ChR2'nin kardiyolojide uygulanması, milisaniye yanıt süresi15 nedeniyle önemli bir potansiyele sahiptir ve bu da onu aritmik kardiyak dinamiklerin hedeflenen kontrolü için çok uygun hale getirmektedir.
Bu çalışmada, transgenik bir fare modelinin sağlam kalplerinin çok bölgeli fotostimülasyonu gösterilmiştir. Özetle, Avrupa Topluluğu'nun Yedinci Çerçeve Programı FP7/2007-2013 (HEALTH-F2-2009-241526) kapsamında transgenik bir alfa-MHC-ChR2 fare hattı kurulmuş ve Prof. S. E. Lehnart tarafından sağlanmıştır. Genel olarak, alfa-MHC kontrolü altında Cre-rekombinaz eksprese eden transgenik yetişkin erkek C57 / B6 / J, dişi B6.Cg-Gt (ROSA) 26Sortm27.1 (CAG-COP4 * H134R / tdTomato) Hye / J ile çiftleşmek üzere eşleştirildi. Kardiyak STOP kaseti ikinci nesilde silindiğinden, yavrular stabil bir MHC-ChR2 ekspresyonu gösterdi ve kardiyak ışığa duyarlı kolonileri korumak için kullanıldı. Tüm deneyler, 36-48 haftalıkken her iki cinsiyetten yetişkin farelerle yapıldı. Aydınlatma, silikon bazlı mahfaza ve kısa optik cam elyaflarının uygulanmaması dışında,16,17'de açıklandığı gibi imal edilen 3 x 3 mikro-LED dizisi kullanılarak elde edilir. Kardiyak bir uygulamada ilk kullanımı18 yılında bulunur. Benzer bir imalat teknolojisine dayanan doğrusal bir mikro-LED dizisi, kalp hızı19 için nüfuz edici bir prob olarak uygulanmıştır. Mikro LED'ler, 550 μm'lik bir aralıkta 3 x 3'lük bir dizilim halinde düzenlenmiştir ve çok küçük bir alanda hem yüksek uzamsal çözünürlük hem de yüksek radyant gücü sağlar. Yazarlar bu çalışmada, yeni anti-aritmik tedavi yöntemlerinin geliştirilmesinin yolunu açabilecek çok yönlü bir yerel çok bölgeli fotostimülasyon göstermektedir.
Aşağıdaki deneysel protokol, kanüle aortun perfüzyon girişi olarak işlev gördüğü retrograd Langendorff perfüzyon ex vivo'yu içerir. Uygulanan perfüzyon basıncı ve kardiyak kasılma nedeniyle perfüzyon, aorttan ayrılan koroner arterlerden akmaktadır. Sunulan çalışmada, kalp, perfüzyon rezervuarlarının 1 m yüksekliğe, 73.2 mmHg'ye eşdeğer olarak 2.633 ± 0.583 mL / dak akış hızına ulaşmasıyla elde edilen sabit bir basınç ayarı kullanılarak perfüze edilir. Deney sırasında iki çeşit Tyrode çözeltisi perfüzyon olarak kullanılır. Düzenli Tyrode çözeltisi kararlı bir sinüs ritmini desteklerken, Low-K + Tyrode çözeltisi, murin kalplerinde aritmi indüksiyonunu sağlamak için Pinacidil ile karıştırılır. Altıgen bir su banyosunun kullanılması, kalbin altı farklı düzlemsel pencereden gözlemlenmesine izin verir ve birkaç optik bileşenin kırılma ile daha az bozulma ile birleştirilmesine izin verir.
Tüm deneyler, Alman mevzuatı, yerel hükümler ve Avrupa Laboratuvar Hayvanları Bilimi Dernekleri Federasyonu'nun (FELASA) tavsiyelerine uygun olarak hayvan refahı yönetmeliğini sıkı bir şekilde takip etti. Hayvan deneylerinin onaylanması için yapılan başvuru, sorumlu hayvan refahı otoritesi tarafından onaylanmış ve tüm deneyler hayvan refahı temsilcilerimize bildirilmiştir.
1. Deney hazırlama ve materyalleri
2. Deneysel prosedürler
Protokol, LED 1 ve LED 2 (Şekil 1) tarafından üretilen fotostimülasyon darbelerini kullanarak sağlam murin kalplerde ventriküler aritmilerin indüklenmesine izin verir ve 25 Hz ile 35 Hz arasında bir frekans f ind ve 2 ms ile 10 ms arasında bir nabız süresi Wind. Bu kadar hızlı ışık darbelerinin amacının kalp ritmini yakalamak değil, kardiyak aktivitenin dengesini bozmak olduğunu, böylece düzensiz elektrik dalgalarının üretilebileceğini ve bunun...
Kardiyak taşiaritmilerin başarılı bir tedavisi kardiyak tedavinin anahtarıdır. Ancak aritmi başlangıcı, sürekliliği ve sonlandırılmasının altında yatan biyofiziksel mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Bu nedenle, kardiyak araştırmalar, elektrik şoku tedavisini aritmilerin daha yumuşak bir şekilde sonlandırılmasına yönelik olarak optimize etmeyi ve böylece hastaların yaşam kalitesini arttırmayı amaçlamaktadır 28,29,30,31....
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.
Yazarlar, deneyler sırasında mükemmel teknik destekleri için Marion Kunze ve Tina Althaus'a teşekkür eder. Sonuçlara yol açan araştırma, Avrupa Topluluğu'nun Yedinci Çerçeve Programı FP7/2007-2013'ten HEALTH-F2-2009-241526 hibe anlaşması numarası altında fon almıştır. Alman Kardiyovasküler Araştırma Merkezi, DZHK e.V. (Proje MD28), ortak site Goettingen, Alman Araştırma Vakfı CRC 1002 (proje C03) ve Max Planck Derneği tarafından da destek sağlandı. Bu çalışma kısmen Alman Araştırma Vakfı tarafından finanse edilen BrainLinks-BrainTools, Mükemmellik Kümesi (DFG, hibe numarası EXC 1086) tarafından desteklenmiştir.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chemical Components | |||
Blebbistatin | TargetMol | T6038 | 10 mM stock solution |
BSA/Albumin | Sigma-Aldrich | A4919 | |
Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | CaCl2 |
Carbogen | Westfalen | 50 l bottle | |
DI-4-ANBDQPQ | AAT Bioquest | 21499 | Dye for Optical Mapping |
Glucose | Sigma-Aldrich | D9434 | C6H12O6 |
Heparin | LEO Pharma | Heparin-Natrium Leo 25.000 I.E./5 ml, available only on prescription | |
Hydrochlorid Acid | Merck | 1.09057.1000 | HCl, 1 M stock solution |
Isoflurane | CP Pharma | 1 ml/ml, available only on prescription | |
Magnesium Chloride | Merck | 8.14733.0500 | MgCl2 |
Monopotassium Phosphate | Sigma-Aldrich | 30407 | KH2PO4 |
Pinacidil monohydrate | Sigma-Aldrich | P154-500mg | 10 mM stock solution |
Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | KCl |
Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | NaHCO3 |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | NaCl |
Sodium Hydroxide | Merck | 1.09137.1000 | NaOH, 1 M stock solution |
Electrical Setup | |||
Biopac MP150 | Biopac Systems | MP150WSW | data acquisition and analysis system |
Custom-built ECG, alternative ECG100C | Biopac Systems | ECG100C | Electrocardiogram Amplifier |
Custom-built water bath heater using heating cable | RMS Heating System | HK-5,0-12 | Heating cable 120W |
Hexagonal water bath | |||
LED Driver Power supply | Thorlabs | KPS101 | 15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for One K- or T-Cube. |
LEDD1B LED Driver | Thorlabs | LEDD1B | T-Cube LED Driver, 1200 mA Max Drive Current |
MAP, ECG Electrode | Hugo Sachs Elektronik | BS4 73-0200 | Mini-ECG Electrode for isoalted hearts |
micro-LED Driver e.g. AFG | Agilent Instruments | A-2230 | Arbitrary function generator (AFG) |
Signal Generator | Agilent Instruments | A-2230 | AFG |
micro-LED Array Components | |||
Epoxid glue | Epoxy Technology | EPO-TEK 353ND | Two component epoxy |
Fluoropolymer | Asahi Glass Co. Ltd. | Cytop 809M | Fluoropolymer with high transparency |
Image reversal photoresist | Merck KGaA | AZ 5214E | Image Reversal Resist for High Resolution |
LED chip | Cree Inc. | C460TR2227-S2100 | Blue micro-LED |
Photoresist | Merck KGaA | AZ 9260 | Thick Positive Photoresists |
Polyimide | UBE Industries Ltd. | U-Varnish S | Polyimide Solution |
Silicone | NuSil Technology LLC | MED-6215 | Low viscosity silicone elastomer |
Solvent free adhesive | John P. Kummer GmbH | Epo-Tek 301-2 | Epoxy resin with low viscosity |
Optical Mapping | |||
Blue Filter | Chroma Technology Corporation | ET470/40x | Blue excitation filter |
Camera | Photometrics | Cascade 128+ | High performance EMCCD Camera |
Camera Objective | Navitar | DO-5095 | Navitar high speed fixed focal length lenses work with CCD and CMOS cameras |
Dichroic Mirror | Semrock | FF685-Di02-25x36 | 685 nm edge BrightLine® single-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter |
Emmision Filter | Semrock | FF01-775/140-25 | 775/140 nm BrightLine® single-band bandpass filter |
Heatsink | Advanced Thermal Solutions | ATSEU-077A-C3-R0 | Heat Sinks - LED STAR LED Heatsink, 45mm dia., 68mm, Black/Silver, Unthreaded Baseplate Hardware |
LED 1 and LED 2 | LED Engin Osram | LZ4-00B208 | High Power LEDs - Single Colour Blue, 460 nm 130 lm, 700mA |
LED 3 | Thorlabs | M625L3 | 625 nm, 700 mW (Min) Mounted LED, 1000 mA |
Lenses | LED Engin Osram | LLNF-2T06-H | LED Lighting Lenses Assemblies LZ4 LENS NARROW FLOOD BEAM |
Photodiode for power meter | Thorlabs | S120VC | Standard Photodiode Power Sensor |
Power Meter | Thorlabs | PM100D | Compact Power and Energy Meter |
Red Filter | Semrock | FF02-628/40-25 | BrightLine® single-band bandpass filter |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır