Gestione avanzata del ritmo cardiaco applicando la fotostimolazione multi-sito optogenetica nei cuori murini

Riepilogo

Questo lavoro riporta un metodo per controllare il ritmo cardiaco di cuori murini intatti di topi transgenici channelrhodopsin-2 (ChR2) utilizzando la fotostimolazione locale con un array di micro-LED e la mappatura ottica simultanea del potenziale della membrana epicardica.

Abstract

Le tachiaritmie ventricolari sono una delle principali cause di mortalità e morbilità in tutto il mondo. La defibrillazione elettrica con scosse elettriche ad alta energia è attualmente l'unico trattamento per la fibrillazione ventricolare pericolosa per la vita. Tuttavia, la defibrillazione può avere effetti collaterali, tra cui dolore intollerabile, danno tissutale e peggioramento della prognosi, indicando una significativa necessità medica per lo sviluppo di strategie di gestione del ritmo cardiaco più delicate. Oltre agli approcci elettrici che riducono l'energia, l'optogenetica cardiaca è stata introdotta come un potente strumento per influenzare l'attività cardiaca utilizzando canali ionici a membrana sensibili alla luce e impulsi luminosi. Nel presente studio, verrà descritto un metodo robusto e valido per la fotostimolazione di successo di cuori murini intatti perfusi di Langendorff basato sulla stimolazione multi-sito applicando un array 3 x 3 di diodi micro emettitori di luce (micro-LED). La mappatura ottica simultanea delle onde di tensione della membrana epicardica consente di studiare gli effetti della stimolazione regionale-specifica e valuta l'attività cardiaca appena indotta direttamente in loco. I risultati ottenuti mostrano che l'efficacia della defibrillazione dipende fortemente dai parametri scelti per la fotostimolazione durante un'aritmia cardiaca. Sarà dimostrato che l'area illuminata del cuore svolge un ruolo cruciale per il successo della terminazione e come è possibile ottenere il controllo mirato dell'attività cardiaca durante l'illuminazione per modificare i modelli di aritmia. In sintesi, questa tecnica offre la possibilità di ottimizzare la manipolazione del meccanismo in loco sulla strada per il controllo del feedback in tempo reale del ritmo cardiaco e, per quanto riguarda la specificità della regione, nuovi approcci nel ridurre il potenziale danno al sistema cardiaco rispetto all'uso di applicazioni di scosse elettriche non specifiche.

Introduzione

Le prime indagini sulle dinamiche spazio-temporali durante l'aritmia hanno rivelato che i complessi schemi elettrici durante la fibrillazione cardiaca sono guidati da onde di eccitazione rotanti simili a vortici¹. Questa scoperta ha fornito nuove informazioni sui meccanismi alla base delle aritmie, che hanno poi portato allo sviluppo di nuove terapie di terminazione elettrica basate sull'eccitazione multi-sito del miocardio ^2,3,4. Tuttavia, i trattamenti che utilizzano la stimolazione del campo elettrico non sono locali e possono innervare tutte le cellule eccitabili circostanti, incluso il tessuto muscolare, causando danni cellulari e tissutali, nonché dolore intollerabile. A differenza delle terapie elettriche, gli approcci optogenetici forniscono una tecnica specifica e protettiva dei tessuti per evocare potenziali d'azione dei cardiomiociti con elevata precisione spaziale e temporale. Pertanto, la stimolazione optogenetica ha il potenziale per un controllo minimamente invasivo dei modelli di attivazione caotica durante la fibrillazione cardiaca.

L'introduzione della canalistica ionica sensibile alla lucerhodopsin-2 (ChR2) nelle cellule eccitabili tramite manipolazione genetica ^5,6,7, ha permesso la depolarizzazione del potenziale di membrana delle cellule eccitabili utilizzando la fotostimolazione. Sono state sviluppate diverse applicazioni mediche, tra cui l'attivazione delle reti neuronali, il controllo dell'attività cardiaca, il ripristino della vista e dell'udito, il trattamento delle lesioni del midollo spinale e altre 8,9,10,11,12,13,14. L'applicazione di ChR2 in cardiologia ha un potenziale significativo grazie al suo tempo di risposta al millisecondo¹⁵, rendendolo adatto per il controllo mirato della dinamica cardiaca aritmica.

In questo studio, viene mostrata la fotostimolazione multi-sito di cuori intatti di un modello murino transgenico. In sintesi, una linea di topi transgenici alfa-MHC-ChR2 è stata istituita nell'ambito del Settimo Programma Quadro FP7/2007-2013 della Comunità Europea (HEALTH-F2-2009-241526) e gentilmente fornita dal Prof. S. E. Lehnart. In generale, i maschi adulti transgenici C57/B6/J, che esprimono Cre-ricombinasi sotto controllo dell'alfa-MHC, sono stati accoppiati per accoppiarsi con B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm27.1(CAG-COP4*H134R/tdTomato)Hye/J. Poiché la cassetta STOP cardiaca è stata eliminata nella seconda generazione, la prole ha mostrato un'espressione stabile di MHC-ChR2 ed è stata utilizzata per mantenere le colonie fotosensibili cardiache. Tutti gli esperimenti sono stati condotti con topi adulti di entrambi i sessi ad un'età di 36 - 48 settimane. L'illuminazione è ottenuta utilizzando un array di micro-LED 3 x 3, fabbricato come descritto in^16,17 tranne per il fatto che l'alloggiamento a base di silicio e le fibre corte di vetro ottico non sono implementati. Il suo primo utilizzo in un'applicazione cardiaca si trova in¹⁸. Un array lineare di micro-LED basato su una tecnologia di fabbricazione simile è stato applicato come sonda penetrante per la stimolazione cardiaca¹⁹. I micro-LED sono disposti in un array 3 x 3 con un passo di 550 μm, fornendo sia un'elevata risoluzione spaziale che un'elevata potenza radiante su un'area molto piccola. Gli autori dimostrano in questo lavoro una versatile fotostimolazione locale multi-sito che può aprire la strada allo sviluppo di nuovi metodi di terapia anti-aritmica.

Il seguente protocollo sperimentale prevede una perfusione retrograda di Langendorff ex vivo, per la quale l'aorta cannulata funge da ingresso di perfusione. A causa della pressione di perfusione applicata e della contrazione cardiaca, il perfusato scorre attraverso le arterie coronarie, che si diramano dall'aorta. Nel lavoro presentato, il cuore viene perfuso utilizzando una configurazione a pressione costante ottenuta elevando i serbatoi di perfuso a 1 m di altezza, equivalente a 73,2 mmHg, che produce una portata di 2,633 ± 0,583 ml / min. Due tipi di soluzione di Tyrode sono usati come perfufuto durante l'esperimento. La soluzione di Regular Tyrode supporta un ritmo sinusale stabile, mentre la soluzione di Low-K⁺ Tyrode viene miscelata con Pinacidil per consentire l'induzione dell'aritmia nei cuori murini. L'utilizzo di un bagno d'acqua esagonale consente l'osservazione del cuore attraverso sei diverse finestre planari, consentendo l'accoppiamento di più componenti ottici con meno distorsione per rifrazione.

Protocollo

Tutti gli esperimenti hanno seguito rigorosamente il regolamento sul benessere degli animali, in accordo con la legislazione tedesca, le disposizioni locali e in conformità con le raccomandazioni della Federazione delle associazioni europee di scienze degli animali da laboratorio (FELASA). La domanda di approvazione degli esperimenti sugli animali è stata approvata dall'autorità responsabile per il benessere degli animali e tutti gli esperimenti sono stati segnalati ai nostri rappresentanti per il benessere degli animali.

1. Preparazione dell'esperimento e materiali

1. Configurazione della mappatura ottica
   NOTA: la configurazione ottica e la configurazione elettrica sono illustrate nella Figura 1. Tutti i componenti utilizzati nella configurazione ottica ed elettrica sono elencati in dettaglio nella tabella dei materiali.
   1. Utilizzare LED 1 e LED 2 per l'induzione dell'aritmia e la defibrillazione di backup. Scegli LED ad alta potenza con una lunghezza d'onda λ_blu vicino a 475 nm, che è il picco della lunghezza d'onda di eccitazione di ChR2⁶. Per restringere ulteriormente lo spettro ottico, utilizzare un filtro passa-banda da 470 ± 20 nm.
      NOTA: In questo lavoro, LED 1 e LED 2 hanno un flusso radiante tipico da 3,9 a 5,3 W, secondo la scheda tecnica²⁰.
   2. Illuminare l'epicardio per la mappatura ottica con un LED rosso ad alta potenza (LED 3 in Figura 1), che emette luce con una lunghezza d'onda centrale di λ_rosso = 625 nm e un flusso radiante di 700 mW²¹. La luce rossa viene filtrata con un filtro passa banda 628 ± 20 nm e riflessa da uno specchio dicroico a passaggio lungo (DM) con una lunghezza d'onda di taglio di λ_DM = 685 nm.
   3. Utilizzare un filtro di emissione con λ_filtro-camma = 775 ± 70 nm davanti all'obiettivo della telecamera per registrare solo l'emissione di fluorescenza dell'attività cardiaca. Utilizzare un obiettivo veloce adatto per applicazioni in condizioni di scarsa illuminazione.
      NOTA: La frequenza di fibrillazione di un cuore di topo varia da 20 a 35 Hz; pertanto, utilizzare una fotocamera abbastanza veloce per registrare con una frequenza da 1 a 2 kHz o anche superiore.
2. Array di micro-LED
   NOTA: Gli array di micro-LED qui applicati sono realizzati utilizzando l'elaborazione di microsistemi come ulteriormente dettagliato altrove^16,17.
   1. Spin coat uno strato di poliimmide (PI) spesso 5 μm su substrati di silicio da 4 pollici (lucidati su un solo lato, spessi 525 μm).
   2. Polimerizzare questo strato di PI ad una temperatura massima di 450 °C in atmosfera di azoto. Mantenere costante la temperatura massima per 10 minuti.
   3. Depositare e modellare un fotoresist di inversione dell'immagine (PR) utilizzando la litografia ultravioletta (UV) e lo sputter depositano uno strato di platino sottile (Pt) di 250 nm.
   4. Addensare questa metallizzazione a base di Pt galvanizzando uno strato di oro (Au) spesso 1 μm con il PR modellato che funge da strato di mascheratura.
   5. Prima di rivestire in rotazione un secondo strato di PI, esporre il wafer con il suo primo strato PI e la metallizzazione elettrolitica Au a un plasma di ossigeno che attiva chimicamente la superficie dello strato PI.
   6. Polimerizzare nuovamente il secondo strato PI a 450 °C, applicare la litografia UV per modellare uno strato PR e aprire i pad di contatto dell'array per i chip micro-LED e il circuito stampato (PCB) di interfacciamento mediante incisione ionica reattiva (RIE) utilizzando il PR modellato come strato di mascheramento.
      NOTA: in questa fase del processo RIE, si consiglia di applicare 200 W e 100 W per 10 e 30 minuti, rispettivamente, per definire le aperture del pad di contatto e la forma esterna dell'array di micro-LED bidimensionale (2D).
   7. Striscia il PR usando solventi e incisione al plasma. Ispessire ulteriormente i cuscinetti di contatto galvanizzando un ulteriore strato d'oro spesso 6 μm.
   8. Collegare i chip micro-LED ai pad di contatto utilizzando un bonder flip-chip.
   9. Attivare la superficie PI in un plasma di ossigeno e riempire i chip micro-LED con un adesivo privo di solventi. Polimerizzare quindi l'adesivo per 12 h a 120 °C.
   10. Per incapsulare i chip micro-LED, eseguire un altro trattamento al plasma con Argon e applicare manualmente un sottile strato di fluoropolimero. Pre-polimerizzare questo strato a 80 °C per 1 ora.
   11. Applicare manualmente il silicone come strato finale di incapsulamento dopo aver esposto l'array di micro-LED a un plasma di ossigeno, utilizzato per migliorare l'adesione del silicio allo strato di fluoropolimero sottostante. Polimerizzare lo strato di silicone a 80 °C e 180 °C per 1 h ciascuno. Queste fasi finali di polimerizzazione polimerizzano completamente anche lo strato di fluoropolimero.
   12. Saldare i pad di contatto del substrato PI a un circuito stampato che trasporta connettori a striscia per l'interconnessione dell'array a una strumentazione esterna. Coprire i cuscinetti di saldatura sul PCB usando un adesivo.
3. Configurazione elettrica
   1. Utilizzare elettrodi adatti per la registrazione di un elettrocardiogramma (ECG), ad esempio elettrodi di argento/cloruro d'argento o elettrodi monofasici con potenziale d'azione (MAP) e un amplificatore ECG per monitorare continuamente l'attività elettrica del cuore. Inoltre, utilizzare un dispositivo di acquisizione appropriato (AD) per registrare tutti i segnali elettrici ottenuti.
   2. Scegli un driver adatto per i LED ad alta potenza (LED 1, LED 2 e LED 3), in grado di gestire la corrente massima applicata a ciascun dispositivo. Utilizzare un generatore di funzioni arbitrarie (AFG) per controllare con precisione l'uscita dei driver LED.
   3. Utilizzare un driver LED multicanale per controllare la corrente che scorre attraverso l'array di micro-LED. Un AFG con uscite multiple è adatto anche per questo compito.
      NOTA: Si consiglia di scegliere driver LED che limitino la corrente alla corrente massima del micro-LED, altrimenti i diodi potrebbero danneggiarsi. Un esempio di driver micro-LED multicanale è descritto in un altro lavoro¹⁸. Se necessario, AFG o qualsiasi altro driver LED potrebbe essere collegato a un computer per controllare a distanza le impostazioni micro-LED. In questo caso, collegare il driver LED al computer con il protocollo di comunicazione di propria scelta, ad esempio General Purpose Interface Bus (GPIB) o una connessione seriale.

   

2. Procedure sperimentali

1. Preparazione della soluzione
   1. Preparare la soluzione di Tyrode: 130 mM NaCl, 4 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 24 mM NaHCO₃, 1,8 mM CaCl 2, 1,2 mM KH₂ PO₄, 5,6 mM glucosio, 0,1% BSA/albumina.
   2. Preparare la soluzione di Tyrode a basso K+: la soluzione di Tyrode a basso K⁺ viene prodotta allo stesso modo della soluzione di Tyrode normale, tranne per il fatto che viene aggiunta solo la metà della quantità di KCl (2 mM invece di 4 mM KCl).
      NOTA: Per un esperimento della durata di 3 ore, di solito sono sufficienti 2-3 L di Tyrode Low-K⁺ (miscelati inoltre con Blebbistatin (Passo 2.1.5) se viene eseguita la mappatura ottica) e 1-2 L di Tyrode normale.
   3. Aggiungere Pinacidil alla soluzione di Low-K⁺ Tyrode per facilitare il processo di induzione dell'aritmia, come descritto al^{punto 22}, per ottenere una concentrazione di 100 mM. Indossare guanti protettivi da laboratorio quando si maneggia Pinacidil.
   4. Preparare 1 mL di 50 μM DI-4-ANBDQPQ con la soluzione normale di Tyrode. Proteggere il colorante dalla luce per evitare il fotosbiancamento.
   5. Preparare una soluzione madre 10 mM di blebbistatina. Per la mappatura ottica, miscelare Blebbistatin con la soluzione 100 mM di Pinacidil-Tyrode (Fase 2.1.3) per ottenere una soluzione da 5 μM. Indossare guanti protettivi da laboratorio quando si maneggia Blebbistatin.
      NOTA: Tenere da parte sia il colorante che la soluzione di blebbistatina fino all'inizio della mappatura ottica.
2. Perfusione di Langendorff
   NOTA: La configurazione è composta da due serbatoi per le due soluzioni Tyrode. Sono collegati a una trappola a bolle tramite tubi con rubinetti a tre vie. Il cuore viene successivamente attaccato alla trappola a bolle da un connettore Luer lock, e viene quindi sospeso in un bagno d'acqua esagonale. Il bagno d'acqua è, a sua volta, collegato a un contenitore di rifiuti per raccogliere la soluzione di Tyrode usata.
   1. Pulire tutti i tubi prima di ogni esperimento con acqua completamente demineralizzata.
   2. Aerare entrambe le soluzioni di Tyrode con Carbogen (5% CO 2 e 95% O₂) per 30 minuti a temperatura ambiente prima dell'inizio dell'esperimento. Regolare il valore pH delle soluzioni di Tyrode a 7,4 con NaOH.
   3. Riempire 500 mL di ogni soluzione di Tyrode nel serbatoio corrispondente e disaerare i tubi e la trappola a bolle facendo passare la soluzione di Tyrode attraverso il sistema di perfusione fino a quando non si vedono più bolle d'aria intrappolate nei tubi o nella trappola a bolle.
   4. Continuare ad aerare le soluzioni di Tyrode durante l'intero esperimento nei serbatoi con Carbogen per garantire che il pH del perfufato rimanga stabile più tardi durante la perfusione.
   5. Riscaldare il sistema di perfusione a 37 °C con una pompa di calore ad acqua. Mantenere costante la temperatura del perfusto all'interno del bagno d'acqua utilizzando un elemento riscaldante aggiuntivo come un cavo riscaldante impermeabile.
      NOTA: Durante l'esperimento, è fondamentale riempire i serbatoi del Tyrode prima che si svuotino. Altrimenti, le bolle d'aria possono entrare nel cuore, che può ostruire i vasi e portare all'ischemia.
3. Preparazione del mouse
   1. Iniettare per via sottocutanea 0,1 ml di 500 cioè eparina 30 minuti prima della procedura di isolamento cardiaco.
   2. Riempire una capsula di Petri da 6 cm e una siringa da 2 ml con la soluzione di Tyrode ghiacciata. Posto sotto il microscopio stereoscopico.
   3. Eseguire l'anestesia a breve termine dei topi con un ambiente saturo di isoflurano per 2 minuti e la lussazione cervicale immediata in seguito.
      NOTA: Al fine di verificare un'anestesia sufficiente è assolutamente necessario controllare il riflesso inter-dito negativo.
   4. Aprire il torace, rimuovere il cuore, come descritto altrove²³, e metterlo nella capsula di Petri da 6 cm con la soluzione ghiacciata di Tyrode. Il battito cardiaco sarà diminuito a causa del calo di temperatura.
   5. Eseguire la preparazione fine al microscopio stereoscopico, come dettagliato altrove²³. Attaccare l'aorta sull'ago smussato e fissare la nave con materiale di sutura.
   6. Come controllo, iniettare la soluzione ghiacciata di Tyrode attraverso l'ago nel cuore e controllare che il cuore sia montato saldamente. Questo passaggio risciacqua anche il sangue rimanente dal cuore.
   7. Trasferire il cuore montato al sistema di perfusione. Assicurarsi che il perfusato scorra per evitare che l'aria entri nel cuore mentre si collega l'ago con la trappola a bolle. Controllare che il cuore sia coperto con la soluzione di Tyrode a bagnomaria. I passaggi 2.3.4, 2.3.5 e 2.3.7 sono illustrati nella Figura 2.
   8. Assicurati che il cuore inizi a battere entro pochi minuti. Lasciare che il cuore si adatti alla configurazione della perfusione per 15-20 minuti, quindi passare alla soluzione di Tyrode a basso K+ con Pinacidil (Fase 2.1.3) rispettivamente alla soluzione di Tyrode a basso K⁺ con Pinacidil e Blebbistatina (Fase 2.1.5) se deve essere eseguita la mappatura ottica.
4. Induzione di aritmia e defibrillazione ottica
   1. Posizionare uno degli elettrodi ECG il più vicino possibile alla superficie del cuore per garantire una buona qualità del segnale. Sospendere il secondo elettrodo ECG nella soluzione di Tyrode. Assicurarsi che l'ECG acquisito venga registrato dall'AD di scelta.
   2. Posizionare l'array di micro-LED sull'area di interesse dello studio, ad esempio, sul ventricolo sinistro.
   3. Cambiare la perfusione in Tyrode a basso K⁺ con Pinacidil e perfondere il cuore per 15-30 minuti.
   4. Per indurre l'aritmia, illuminare il cuore con LED 1 e LED 2 con un treno di 20-50 impulsi luminosi con una frequenza f ind da 25 a 35 Hz, durata dell'impulso W_ind da 2 a 15 ms e intensità luminosa LI_{opt_ind} di 2,8 mW ^mm-2.
   5. Ripetere il processo fino a quando non viene indotta l'aritmia.
      NOTA: Le aritmie sono facili da identificare nel segnale ECG perché la frequenza e la morfologia del segnale differiscono dal normale ritmo sinusale. Se l'aritmia termina entro i prossimi 5 secondi, classificarla come auto-terminata e iniziare un nuovo tentativo di induzione.
   6. Una volta rilevata visivamente un'aritmia prolungata, applicare una raffica di impulsi con diverse larghezze W def e frequenze f_def, utilizzando tre, sei o nove micro-LED dell'array a un_impulso di corrente pulsata I di 15 mA che produce un'intensità luminosa LI_μLED = 33,31 ± 2,05 mW ^mm-2.
   7. Se l'aritmia continua dopo cinque prove di defibrillazione basate su array di micro-LED, classificare il tentativo come non riuscito e avviare la defibrillazione di backup.
   8. Per la defibrillazione di backup, utilizzare LED 1 e LED 2 utilizzando gli stessi parametri di temporizzazione impostati per l'array di micro-LED.
      NOTA: Poiché il cuore è esposto a stress ischemico e metabolico durante l'intero periodo sperimentale, è possibile che i tentativi di interruzione dell'aritmia non abbiano successo anche con la defibrillazione di backup. Ogni volta che ciò accade, cambiare la soluzione di perfusione con la normale Tyrode e lasciare che il cuore si riprenda per 5-10 minuti. Quando l'ECG ritorna al ritmo sinusale, ripetere nuovamente il protocollo dal passaggio 2.4.3.
5. Mappatura ottica
   1. Perfondere il cuore con la soluzione di blebbistatina preparata al punto 2.1.5 e attendere fino a quando non si verifica il disaccoppiamento meccanico. Ciò si ottiene quando il cuore smette di battere, ma un segnale ECG è ancora misurabile.
      NOTA: Miscelando la soluzione di blebbistatina alla concentrazione menzionata e mantenendo il cuore perfuso con questa soluzione mantiene l'attività meccanica cardiaca disaccoppiata dall'attività elettrica durante l'intero esperimento.
   2. Somministrare il colorante di tensione da 1 mL DI-4-ANBDQPQ (preparato al punto 2.1.4) come bolo nella trappola a bolle della perfusione di Langendorff. Attendere da 5 a 10 minuti per consentire al colorante di perfondere uniformemente il cuore.
      NOTA: Evitare il fotosbiancamento del colorante spegnendo la luce rossa ogni volta che non viene effettuata alcuna registrazione. Se il rapporto segnale/rumore della registrazione diventa troppo piccolo (il segnale acquisito è troppo rumoroso), ripetere i passaggi 2.1.4 e 2.5.2.
   3. Mettere a fuoco la fotocamera sulla superficie cardiaca, accendere LED 3 e applicare una potenza ottica di 1,27 mW ^mm-2 .
   4. Spegni le luci del laboratorio e inizia a registrare. Assicurarsi che venga acquisito un segnale ottico confrontando la frequenza del segnale ottenuto con la frequenza dell'ECG registrato. Ciò garantisce che il segnale ottico ottenuto sia puramente correlato all'attività elettrica del cuore.
      NOTA: Poiché la luce di fluorescenza emessa dal colorante è molto settimanale, la mappatura ottica viene eseguita in una stanza buia. Ciò evita interferenze di segnale da qualsiasi altra fonte di luce.

Risultati

Il protocollo consente l'induzione di aritmie ventricolari in cuori murini intatti utilizzando impulsi di fotostimolazione generati da LED 1 e LED 2 (Figura 1) con una frequenza f ind compresa tra 25 Hz e 35 Hz e una durata dell'impulso W_ind compresa tra 2 ms e 10 ms. Si noti che lo scopo di tali impulsi luminosi rapidi non è quello di catturare il ritmo cardiaco, ma piuttosto di sbilanciare l'attività cardiaca in modo che possano essere generate onde elettriche irreg...

Discussione

Un trattamento efficace delle tachiaritmie cardiache è la chiave per la terapia cardiaca. Tuttavia, i meccanismi biofisici alla base dell'inizio, della perpetuazione e della cessazione dell'aritmia non sono completamente compresi. Pertanto, la ricerca cardiaca mira a ottimizzare la terapia con scosse elettriche verso una cessazione più delicata delle aritmie, aumentando così la qualità della vita dei pazienti 28,29,30,31.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemical Components
Blebbistatin	TargetMol	T6038	10 mM stock solution
BSA/Albumin	Sigma-Aldrich	A4919
Calcium Chloride	Sigma-Aldrich	C1016	CaCl2
Carbogen	Westfalen		50 l bottle
DI-4-ANBDQPQ	AAT Bioquest	21499	Dye for Optical Mapping
Glucose	Sigma-Aldrich	D9434	C6H12O6
Heparin	LEO Pharma		Heparin-Natrium Leo 25.000 I.E./5 ml, available only on prescription
Hydrochlorid Acid	Merck	1.09057.1000	HCl, 1 M stock solution
Isoflurane	CP Pharma		1 ml/ml, available only on prescription
Magnesium Chloride	Merck	8.14733.0500	MgCl2
Monopotassium Phosphate	Sigma-Aldrich	30407	KH2PO4
Pinacidil monohydrate	Sigma-Aldrich	P154-500mg	10 mM stock solution
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P5405	KCl
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761	NaHCO3
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S5886	NaCl
Sodium Hydroxide	Merck	1.09137.1000	NaOH, 1 M stock solution
Electrical Setup
Biopac MP150	Biopac Systems	MP150WSW	data acquisition and analysis system
Custom-built ECG, alternative ECG100C	Biopac Systems	ECG100C	Electrocardiogram Amplifier
Custom-built water bath heater using heating cable	RMS Heating System	HK-5,0-12	Heating cable 120W
Hexagonal water bath
LED Driver Power supply	Thorlabs	KPS101	15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for One K- or T-Cube.
LEDD1B LED Driver	Thorlabs	LEDD1B	T-Cube LED Driver, 1200 mA Max Drive Current
MAP, ECG Electrode	Hugo Sachs Elektronik	BS4 73-0200	Mini-ECG Electrode for isoalted hearts
micro-LED Driver e.g. AFG	Agilent Instruments	A-2230	Arbitrary function generator (AFG)
Signal Generator	Agilent Instruments	A-2230	AFG
micro-LED Array Components
Epoxid glue	Epoxy Technology	EPO-TEK 353ND	Two component epoxy
Fluoropolymer	Asahi Glass Co. Ltd.	Cytop 809M	Fluoropolymer with high transparency
Image reversal photoresist	Merck KGaA	AZ 5214E	Image Reversal Resist for High Resolution
LED chip	Cree Inc.	C460TR2227-S2100	Blue micro-LED
Photoresist	Merck KGaA	AZ 9260	Thick Positive Photoresists
Polyimide	UBE Industries Ltd.	U-Varnish S	Polyimide Solution
Silicone	NuSil Technology LLC	MED-6215	Low viscosity silicone elastomer
Solvent free adhesive	John P. Kummer GmbH	Epo-Tek 301-2	Epoxy resin with low viscosity
Optical Mapping
Blue Filter	Chroma Technology Corporation	ET470/40x	Blue excitation filter
Camera	Photometrics	Cascade 128+	High performance EMCCD Camera
Camera Objective	Navitar	DO-5095	Navitar high speed fixed focal length lenses work with CCD and CMOS cameras
Dichroic Mirror	Semrock	FF685-Di02-25x36	685 nm edge BrightLine® single-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter
Emmision Filter	Semrock	FF01-775/140-25	775/140 nm BrightLine® single-band bandpass filter
Heatsink	Advanced Thermal Solutions	ATSEU-077A-C3-R0	Heat Sinks - LED STAR LED Heatsink, 45mm dia., 68mm, Black/Silver, Unthreaded Baseplate Hardware
LED 1 and LED 2	LED Engin Osram	LZ4-00B208	High Power LEDs - Single Colour Blue, 460 nm 130 lm, 700mA
LED 3	Thorlabs	M625L3	625 nm, 700 mW (Min) Mounted LED, 1000 mA
Lenses	LED Engin Osram	LLNF-2T06-H	LED Lighting Lenses Assemblies LZ4 LENS NARROW FLOOD BEAM
Photodiode for power meter	Thorlabs	S120VC	Standard Photodiode Power Sensor
Power Meter	Thorlabs	PM100D	Compact Power and Energy Meter
Red Filter	Semrock	FF02-628/40-25	BrightLine® single-band bandpass filter