Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Method Article
* Estos autores han contribuido por igual
Este trabajo informa un método para controlar el ritmo cardíaco de corazones murinos intactos de ratones transgénicos con canalrodopsina-2 (ChR2) utilizando fotoestimulación local con una matriz de micro-LED y mapeo óptico simultáneo del potencial de la membrana epicárdica.
Las taquiarritmias ventriculares son una causa importante de mortalidad y morbilidad en todo el mundo. La desfibrilación eléctrica mediante descargas eléctricas de alta energía es actualmente el único tratamiento para la fibrilación ventricular potencialmente mortal. Sin embargo, la desfibrilación puede tener efectos secundarios, como dolor intolerable, daño tisular y empeoramiento del pronóstico, lo que indica una necesidad médica significativa para el desarrollo de estrategias de manejo del ritmo cardíaco más suaves. Además de los enfoques eléctricos reductores de energía, la optogenética cardíaca se introdujo como una herramienta poderosa para influir en la actividad cardíaca utilizando canales iónicos de membrana sensibles a la luz y pulsos de luz. En el presente estudio, se describirá un método robusto y válido para la fotoestimulación exitosa de corazones murinos intactos perfundidos por Langendorff basado en la estimulación multisitio aplicando una matriz de 3 x 3 de micro diodos emisores de luz (micro-LED). El mapeo óptico simultáneo de las ondas de voltaje de la membrana epicárdica permite la investigación de los efectos de la estimulación específica de la región y evalúa la actividad cardíaca recién inducida directamente en el sitio. Los resultados obtenidos muestran que la eficacia de la desfibrilación depende en gran medida de los parámetros elegidos para la fotoestimulación durante una arritmia cardíaca. Se demostrará que el área iluminada del corazón juega un papel crucial para el éxito de la terminación, así como cómo se puede lograr el control específico de la actividad cardíaca durante la iluminación para modificar los patrones de arritmia. En resumen, esta técnica ofrece la posibilidad de optimizar la manipulación del mecanismo in situ en el camino hacia el control de retroalimentación en tiempo real del ritmo cardíaco y, con respecto a la especificidad de la región, nuevos enfoques para reducir el daño potencial al sistema cardíaco en comparación con el uso de aplicaciones de descargas eléctricas no específicas.
Las primeras investigaciones de la dinámica espacio-temporal durante la arritmia revelaron que los complejos patrones eléctricos durante la fibrilación cardíaca son impulsados por ondas de excitación giratorias similares a vórtices1. Este hallazgo proporcionó nuevos conocimientos sobre los mecanismos subyacentes de las arritmias, que luego condujeron al desarrollo de nuevas terapias de terminación eléctrica basadas en la excitación multisitio del miocardio 2,3,4. Sin embargo, los tratamientos que utilizan estimulación del campo eléctrico no son locales y pueden inervar todas las células excitables circundantes, incluido el tejido muscular, causando daño celular y tisular, así como dolor intolerable. A diferencia de las terapias eléctricas, los enfoques optogenéticos proporcionan una técnica específica y protectora de tejidos para evocar potenciales de acción de cardiomiocitos con alta precisión espacial y temporal. Por lo tanto, la estimulación optogenética tiene el potencial de un control mínimamente invasivo de los patrones de activación caótica durante la fibrilación cardíaca.
La introducción del canal iónico sensible a la luz canalrodopsina-2 (ChR2) en células excitables mediante manipulación genética 5,6,7, permitió la despolarización del potencial de membrana de las células excitables mediante fotoestimulación. Se han desarrollado varias aplicaciones médicas, incluyendo la activación de redes neuronales, el control de la actividad cardíaca, la restauración de la visión y la audición, el tratamiento de lesiones medulares, y otras 8,9,10,11,12,13,14. La aplicación de ChR2 en cardiología tiene un potencial significativo debido a su tiempo de respuesta de milisegundos15, lo que lo hace muy adecuado para el control dirigido de la dinámica cardíaca arrítmica.
En este estudio, se muestra la fotoestimulación multisitio de corazones intactos de un modelo de ratón transgénico. En resumen, se estableció una línea de ratones alfa-MHC-ChR2 transgénicos en el ámbito del Séptimo Programa Marco FP7/2007-2013 de la Comunidad Europea (HEALTH-F2-2009-241526) y amablemente proporcionada por el Prof. S. E. Lehnart. En general, los machos adultos transgénicos C57/B6/J, que expresaban Cre-recombinasa bajo control de alfa-MHC se emparejaron para aparearse con hembras B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm27.1(CAG-COP4*H134R/tdTomato)Hye/J. Dado que el casete STOP cardíaco se eliminó en la segunda generación, la descendencia mostró una expresión estable de MHC-ChR2 y se utilizó para mantener colonias fotosensibles cardíacas. Todos los experimentos se realizaron con ratones adultos de ambos sexos a una edad de 36 a 48 semanas. La iluminación se logra utilizando una matriz de micro-LED de 3 x 3, fabricada como se describe en16,17, excepto que la carcasa a base de silicio y las fibras cortas de vidrio óptico no están implementadas. Su primer uso en una aplicación cardíaca se encuentra en18. Se ha aplicado una matriz lineal de micro-LED basada en una tecnología de fabricación similar como sonda penetrante para la estimulación cardíaca19. Los micro-LED están dispuestos en una matriz de 3 x 3 a un paso de 550 μm, proporcionando una alta resolución espacial y una alta potencia radiante en un área muy pequeña. Los autores demuestran en este trabajo una fotoestimulación multisitio local versátil que puede abrir el camino para desarrollar nuevos métodos de terapia antiarrítmica.
El siguiente protocolo experimental implica una perfusión de Langendorff retrógrada ex vivo, para la cual la aorta canulada funciona como entrada de perfusión. Debido a la presión de perfusión aplicada y la contracción cardíaca, el perfusión fluye a través de las arterias coronarias, que se ramifican de la aorta. En el trabajo presentado, el corazón se perfunde utilizando una configuración de presión constante lograda elevando los reservorios de perfusión a 1 m de altura, equivalente a 73.2 mmHg, lo que produce un caudal de 2.633 ± 0.583 mL / min. Dos tipos de solución de Tyrode se utilizan como perfusión durante el experimento. La solución regular de Tyrode apoya un ritmo sinusal estable, mientras que la solución de Low-K+ Tyrode se mezcla con Pinacidil para permitir la inducción de arritmia en corazones murinos. El uso de un baño de agua hexagonal permite la observación del corazón a través de seis ventanas planas diferentes, lo que permite el acoplamiento de varios componentes ópticos con menos distorsión por refracción.
Todos los experimentos siguieron estrictamente la regulación de bienestar animal, de acuerdo con la legislación alemana, las estipulaciones locales y de acuerdo con las recomendaciones de la Federación Europea de Asociaciones de Ciencia de Animales de Laboratorio (FELASA). La solicitud de aprobación de experimentos con animales ha sido aprobada por la autoridad responsable de bienestar animal, y todos los experimentos fueron reportados a nuestros representantes de bienestar animal.
1. Preparación de experimentos y materiales
2. Procedimientos experimentales
El protocolo permite la inducción de arritmias ventriculares en corazones murinos intactos mediante pulsos de fotoestimulación generados por LED 1 y LED 2 (Figura 1) con una frecuencia f ind entre 25 Hz y 35 Hz y una duración de pulso Wind entre 2 ms y 10 ms. Tenga en cuenta que el objetivo de tales pulsos de luz rápidos no es capturar el ritmo cardíaco, sino desequilibrar la actividad cardíaca para que se puedan generar ondas eléctricas erráticas, que luego fac...
Un tratamiento exitoso de las taquiarritmias cardíacas es clave para la terapia cardíaca. Sin embargo, los mecanismos biofísicos subyacentes a la iniciación, perpetuación y terminación de la arritmia no se comprenden completamente. Por lo tanto, la investigación cardíaca tiene como objetivo optimizar la terapia de choque eléctrico hacia una terminación más suave de las arritmias, aumentando así la calidad de vida de los pacientes 28,29,30,31.
Los autores no declaran ningún conflicto de intereses.
Los autores desean agradecer a Marion Kunze y Tina Althaus por su excelente apoyo técnico durante los experimentos. La investigación que ha dado lugar a los resultados ha recibido financiación del Séptimo Programa Marco FP7/2007-2013 de la Comunidad Europea en virtud del acuerdo de subvención número HEALTH-F2-2009-241526. El apoyo también fue proporcionado por el Centro Alemán de Investigación Cardiovascular, DZHK e.V. (Proyecto MD28), el sitio asociado Goettingen, la Fundación Alemana de Investigación CRC 1002 (proyecto C03) y la Sociedad Max Planck. Este trabajo fue apoyado en parte por BrainLinks-BrainTools, Cluster of Excellence financiado por la Fundación Alemana de Investigación (DFG, número de subvención EXC 1086).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chemical Components | |||
Blebbistatin | TargetMol | T6038 | 10 mM stock solution |
BSA/Albumin | Sigma-Aldrich | A4919 | |
Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | CaCl2 |
Carbogen | Westfalen | 50 l bottle | |
DI-4-ANBDQPQ | AAT Bioquest | 21499 | Dye for Optical Mapping |
Glucose | Sigma-Aldrich | D9434 | C6H12O6 |
Heparin | LEO Pharma | Heparin-Natrium Leo 25.000 I.E./5 ml, available only on prescription | |
Hydrochlorid Acid | Merck | 1.09057.1000 | HCl, 1 M stock solution |
Isoflurane | CP Pharma | 1 ml/ml, available only on prescription | |
Magnesium Chloride | Merck | 8.14733.0500 | MgCl2 |
Monopotassium Phosphate | Sigma-Aldrich | 30407 | KH2PO4 |
Pinacidil monohydrate | Sigma-Aldrich | P154-500mg | 10 mM stock solution |
Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | KCl |
Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | NaHCO3 |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | NaCl |
Sodium Hydroxide | Merck | 1.09137.1000 | NaOH, 1 M stock solution |
Electrical Setup | |||
Biopac MP150 | Biopac Systems | MP150WSW | data acquisition and analysis system |
Custom-built ECG, alternative ECG100C | Biopac Systems | ECG100C | Electrocardiogram Amplifier |
Custom-built water bath heater using heating cable | RMS Heating System | HK-5,0-12 | Heating cable 120W |
Hexagonal water bath | |||
LED Driver Power supply | Thorlabs | KPS101 | 15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for One K- or T-Cube. |
LEDD1B LED Driver | Thorlabs | LEDD1B | T-Cube LED Driver, 1200 mA Max Drive Current |
MAP, ECG Electrode | Hugo Sachs Elektronik | BS4 73-0200 | Mini-ECG Electrode for isoalted hearts |
micro-LED Driver e.g. AFG | Agilent Instruments | A-2230 | Arbitrary function generator (AFG) |
Signal Generator | Agilent Instruments | A-2230 | AFG |
micro-LED Array Components | |||
Epoxid glue | Epoxy Technology | EPO-TEK 353ND | Two component epoxy |
Fluoropolymer | Asahi Glass Co. Ltd. | Cytop 809M | Fluoropolymer with high transparency |
Image reversal photoresist | Merck KGaA | AZ 5214E | Image Reversal Resist for High Resolution |
LED chip | Cree Inc. | C460TR2227-S2100 | Blue micro-LED |
Photoresist | Merck KGaA | AZ 9260 | Thick Positive Photoresists |
Polyimide | UBE Industries Ltd. | U-Varnish S | Polyimide Solution |
Silicone | NuSil Technology LLC | MED-6215 | Low viscosity silicone elastomer |
Solvent free adhesive | John P. Kummer GmbH | Epo-Tek 301-2 | Epoxy resin with low viscosity |
Optical Mapping | |||
Blue Filter | Chroma Technology Corporation | ET470/40x | Blue excitation filter |
Camera | Photometrics | Cascade 128+ | High performance EMCCD Camera |
Camera Objective | Navitar | DO-5095 | Navitar high speed fixed focal length lenses work with CCD and CMOS cameras |
Dichroic Mirror | Semrock | FF685-Di02-25x36 | 685 nm edge BrightLine® single-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter |
Emmision Filter | Semrock | FF01-775/140-25 | 775/140 nm BrightLine® single-band bandpass filter |
Heatsink | Advanced Thermal Solutions | ATSEU-077A-C3-R0 | Heat Sinks - LED STAR LED Heatsink, 45mm dia., 68mm, Black/Silver, Unthreaded Baseplate Hardware |
LED 1 and LED 2 | LED Engin Osram | LZ4-00B208 | High Power LEDs - Single Colour Blue, 460 nm 130 lm, 700mA |
LED 3 | Thorlabs | M625L3 | 625 nm, 700 mW (Min) Mounted LED, 1000 mA |
Lenses | LED Engin Osram | LLNF-2T06-H | LED Lighting Lenses Assemblies LZ4 LENS NARROW FLOOD BEAM |
Photodiode for power meter | Thorlabs | S120VC | Standard Photodiode Power Sensor |
Power Meter | Thorlabs | PM100D | Compact Power and Energy Meter |
Red Filter | Semrock | FF02-628/40-25 | BrightLine® single-band bandpass filter |
Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este JoVE artículos
Solicitar permisoThis article has been published
Video Coming Soon
ACERCA DE JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados