超快力钳谱分析合成性肌球蛋白的机械酶学特性

摘要

这里介绍的是在合成肌球蛋白-5电机上进行超快力钳实验的综合协议，可以很容易地扩展到其他类别的加工电机的研究。该协议详细说明了所有必要的步骤，从实验设备的设置到样品制备，数据采集和分析。

摘要

超快力钳谱（UFFCS）是一种基于激光镊子的单分子技术，可以以前所未有的时间分辨率研究传统和非常规肌球蛋白在负载下的化学力学。特别是，在肌动蛋白-肌球蛋白键形成后立即在恒定力下探测肌球蛋白马达的可能性，以及高速率的力反馈（200 kHz），表明UFFCS是研究快速动力学（如肌球蛋白工作行程）的负载依赖性的宝贵工具。此外，UFFCS能够研究过程和非过程性肌球蛋白 - 肌动蛋白相互作用如何受到施加力的强度和方向的影响。

通过遵循该协议，将有可能在合成性肌球蛋白-5电机和各种非常规肌球蛋白上进行超快力钳实验。通过一些调整，该协议也可以很容易地扩展到其他类别的合成电机的研究，如驱动蛋白和动力蛋白。该协议包括所有必要的步骤，从实验设备的设置到样品制备，校准程序，数据采集和分析。

引言

在过去的几十年中，由于同时操纵和测量构象变化和酶动力学的可能性，光学镊子一直是阐明单分子水平蛋白质相互作用的机械化学的宝贵工具1^，2。特别是，在细胞中分子马达施加的力范围内施加和测量力的能力，以及测量亚纳米构象变化的能力，使光镊成为一种独特的单分子工具，用于揭示运动蛋白的化学力学特性及其机械调节。

超快力钳谱 （UFFCS） 是一种基于光镊的单分子力谱技术，旨在研究三珠几何形状中分子电机在负载下的快速动力学（图 1a）^3，4。UFFCS将施加到运动蛋白的力的时间滞后减少到光镊的物理极限，即系统的机械松弛时间，从而允许在肌球蛋白运行开始后快速施加力（几十微秒）³。这种能力已被用于研究快速骨骼 ³ 和心脏⁵ 肌肉肌球蛋白的早期机械事件，以揭示动力冲程的负荷依赖性，弱结合状态和强结合状态，以及生化（Pi）和机械（动力冲程）事件的顺序。

三磁珠几何形状通常用于研究非加工性电机，具有力夹的单磁珠几何形状通常用于研究加工性非常规肌球蛋白，例如肌球蛋白Va⁶。然而，有几个原因也倾向于三珠UFFCS测定，用于治疗性肌球蛋白。首先，在肌动蛋白-肌球蛋白结合后立即快速施加负载，可以测量力发展的早期事件，就像在非过程性电机中一样。此外，对于加工型电机，它还允许在整个过程中精确测量电机在恒定力下的运行长度和运行持续时间（图 1b）。此外，由于力反馈率高，系统可以在快速改变位置时保持力恒定，例如肌球蛋白工作行程，从而保证电机步进期间的恒定负载。该系统的高时间分辨率允许检测亚毫秒相互作用，为研究肌球蛋白与肌动蛋白的弱结合提供了可能性。最后，测定几何形状保证力沿肌动蛋白丝施加，力的横向和垂直分量可以忽略不计。这一点特别重要，因为垂直力分量已被证明显着影响电机动力学的负载依赖性7^，8。通过使用这种技术，我们可以对合成肌球蛋白-5B施加一系列辅助和电阻载荷，并直接测量其合成能力对宽范围力的负载依赖性⁴。

如图1a所示，在该系统中，单个肌动蛋白丝悬浮在捕获在双光镊聚焦中的两个聚苯乙烯珠（"哑铃"）之间。不平衡的净力F = F_{1-F 2}通过快速反馈系统施加在灯丝上，该系统使灯丝在一个方向上以恒定的速度移动，直到到达用户定义的反转点，其中净力在相反方向上反转。当运动蛋白不与灯丝相互作用时，哑铃可以自由地以三角波形状（图1b，底图）来回移动，横跨附着单个运动蛋白的基座珠。一旦建立了相互作用，哑铃携带的力就会非常迅速地传递到运动蛋白上，并且马达开始在相互作用时反馈系统施加的力强度和方向下步进来取代细丝，直到肌球蛋白与肌动蛋白分离。由于电机步进产生的位移取决于被捕获的肌动蛋白丝的极性，根据施加力的方向，负载可以是辅助的，即沿电机位移的同一方向推动（图1b上图中的推动），也可以是电阻性的，即相对于电机位移以相反的方向拉动（图1b中的拉力） 上图），从而可以通过施加负载的强度和方向性来研究运动合成力的化学力学调节。

在接下来的部分中，将全面描述使用超快力钳谱设置在不同负载下测量肌动蛋白-肌球蛋白-5B 相互作用的所有步骤，包括 1） 光学设置的设置、光学陷阱对准和校准程序，2） 所有组件的制备及其在样品室中的组装，3） 测量程序， 4）代表性数据和数据分析，提取重要的物理参数，如运行长度、步长和运动蛋白的速度。

研究方案

1. 光学设置

注意:实验装置由具有纳米指向稳定性和<1%激光强度波动的双光镊组成。在这些条件下，哑铃在典型的陷阱刚度（0.1 pN/nm）和张力（1 pN - 几十 pN）下保证了纳米级的稳定性。 图2 显示了光学设置的详细方案。

1. 光镊设计与施工 ⁹、^10、11.
   1. 根据 图2中的方案将设置的所有组件放在光学工作台上。请注意，光学工作台包括有源隔离器，以最大程度地减少机械振动。此外，显微镜结构安装在弹性隔离器上，以吸收声学噪声和机械共振。
   2. 在激光源附近插入一个光隔离器（ 图2中的"OI"），以避免由于光反馈引起的随机幅度波动。
   3. 将整个路径密封在一个封闭的盒子中，以减少可能影响激光指向稳定性的气流和湍流。
   4. 通过使用偏振分束器（PBS）将主激光源（Nd:YAG激光器， 图2中的1，064nm波长）分成两个具有正交偏振的分支来创建双光镊。应避免分时陷阱，因为它们会在张力下引起哑铃振荡¹².
   5. 使用由直接数字频率合成器 （DDS） 驱动的两个声光偏转器（图 2 中的 AOD），通过现场可编程门阵列 FPGA 板的数字输出直接驱动 DDS，允许两个陷阱的精细快速移动，并精确调节肌动蛋白张力（参见图 2）。
      注意:总反馈响应时间必须为<10 μs，以便在测量过程中快速校正并保持两个陷阱上的恒定力，包括未结合状态，肌球蛋白相互作用和运动。为此，位置检波器必须具有>= 100 kHz带宽，并且必须以>= 200 kHz采样率采集数据。对于采集的每个数据点（5 μs采集时间），FPGA计算两个陷阱的比例校正，并将其发送到驱动AOD的两个DDS。AOD响应时间必须低于5 μs，以满足所需的反馈响应时间。
   6. 对于捕获磁珠位置的nm检测，将两个象限光电二极管检测器（ 图2中的QPD）放在聚光镜的后焦平面中。在与聚光镜后焦平面共轭的平面中精确对准QPD，以及与物镜后焦平面共轭的平面中的AOD精确对准，将确保QPD信号与AOD频率无关。
   7. 将AOD安装在带有千分尺驱动的线性转换器上，并将其置换，直到晶体边缘靠近激光束。然后，用以螺纹物镜外壳为中心的光圈替换物镜，并调节其孔径以适合物镜后孔径尺寸。
   8. 将转换器移向激光束，直到光圈后可见被压电晶体阻挡的光束部分，将转换器稍微向后转动以使光束再次完全填充虹膜孔径。
   9. 对第二个 AOD 重复步骤 1.1.7-1.1.8。通过测量QPD的时间滞来检查反馈回路的响应时间，同时在粘在盖玻片¹³表面上的珠子上快速移动光束。
      注意:上述三个步骤（1.1.7-1-1-9）导致AOD晶体的仔细排列。这些步骤对于优化光束偏转和反馈的时间响应非常重要¹³。
2. 通过光电二极管测量显微镜入口处捕获激光的强度波动，该波动必须低于1%。请注意，光电二极管带宽必须大于成像速率。
3. 检查两个疏水阀的指向稳定性。
   1. 通过在 1 mL 丙酮中稀释 20 μL 硅胶珠（1.2 μm，10% 固体）在磷酸盐缓冲液 （PB） 中制备硅胶珠，超声处理 30 秒，短暂涡旋，并以 19，000 x g 离心 2 分钟。
   2. 除去上清液，重悬于1mL丙酮中，然后重复洗涤。重悬于1mL的50mM PB中，洗涤2次。最后，重悬于 100 μL 的 50 mM PB 中。
   3. 用硅胶珠进行光学镊子校准，方法是将盖玻片用双面胶带（约60μm厚）粘在显微镜载玻片上以构建流动室。用 1 mg/mL BSA（牛血清白蛋白）填充腔室并等待 3 分钟。
   4. 将PB中的1:1000稀释的硅胶珠流入腔室。使用装满硅脂的注射器小心密封腔室。在每个陷阱中捕获单个珠子，并应用功率谱方法¹⁴ 对其进行校准。
   5. 通过将 20 μL 硅胶珠（直径 1.2 μm，10% 固体）溶解在 1-1.5 mL 丙酮中，涡旋并超声处理 30 秒，制备乙酸戊酯中的硅胶珠（在室温下）。
   6. 以18，500× g 离心2分钟。弃去上清液并重悬于1mL丙酮中，然后重复洗涤。重悬于1mL乙酸戊酯中，并在乙酸戊酯中重复洗涤（离心机和重悬）2次。将沉淀重悬于100μL硝酸纤维素1%和900μL乙酸戊酯中。在4°C下储存2个月。
   7. 取一个 24 x 24 毫米的玻璃盖玻片，用浸有纯乙醇的纸仔细清洁。然后，在用干净的镊子握住的同时，直接用纯乙醇洗涤第二次冲洗。让它在温和的氮气流下干燥。如果需要，重复此操作以去除玻璃表面上的所有可见残留物。
   8. 取硅胶珠原料，涡旋并短暂超声处理~30秒。
   9. 清洁第二个盖玻片（24 x 60 mm）后，用它将其涂抹在盖玻片的一个表面上的2μL硅胶珠溶液，然后等待其干燥。
   10. 仔细清洁将用于创建流动室的显微镜载玻片（26 x 76 mm）。
   11. 切割两行双粘胶带（~3毫米大，60-100μm厚）并将它们固定在显微镜载玻片的一侧，如图 3所示。
   12. 通过使用干净的镊子，通过将涂层盖玻片（1.3.9）与粘性胶带线接触来关闭腔室（约20μL最终体积），硝酸纤维素+珠子层朝向腔室内部，如图 3a所示。用50mM磷酸盐缓冲液填充流动室，并用硅脂密封。
   13. 使用具有>1.4百万像素的电荷耦合器件（CCD）或互补金属氧化物半导体（CMOS）相机，在明场显微镜中以>200倍放大倍率对单个硅胶珠进行成像。使用反馈软件移动压电平台（具有纳米精度或更高）以补偿热漂移¹⁰。
   14. 将左侧陷阱的中心与磁珠的中心重叠（QPD 的 x-y 信号电平应与校准的信号电平匹配）。然后测量该陷阱的位置噪声和位置信号的标准偏差。
   15. 对右侧陷阱¹⁵ 重复上一步。
4. 陷阱位置校准:MHz 至 nm
   1. 准备一个流动室，在盖玻片表面（1.3.5-1.3.12）上附着有二氧化硅珠和浮动聚苯乙烯珠（使用α-肌动蛋白偶联珠，如以下第2.1节所述制备）。
   2. 将硅胶珠聚焦在从视场（FOV）中心略微偏心（~5μm）的盖玻片表面上，并获得FOV的图像。使用压电平台将磁珠向FOV中心移动10μm并获取第二个图像。使用质心算法或类似算法计算两个图像中磁珠的中心，并计算两个磁珠之间的像素距离，以获得明场相机的nm/像素校准。
   3. 将单个浮动粒子捕获在一个陷阱中。然后，使用AOD以小步（0.2 MHz）移动陷阱，并获取粒子的图像和每一步AOD的相应频率。像以前一样使用质心算法计算粒子在FOV中的位置，并使用上一步中获得的nm/像素校准将其转换为nm。
   4. 对频率位置数据执行线性拟合，并以nm/MHz为单位计算校准常数。
   5. 对第二个疏水阀重复校准
5. 捕集功率和刚度校准（兆赫与西）、QPD（兆赫与pN/纳米）
   1. 准备一个流动室，在盖玻片表面（1.3.5-1.3.12）上附着有硅胶珠和浮动聚苯乙烯珠（使用α-肌动蛋白偶联珠，如以下第2.1节所述制备），并将单个颗粒捕获在一个陷阱中。然后以小步长（0.2 MHz）通过AOD置换两个陷阱，并用QPD和AOD的相应频率记录两个陷阱中粒子的布朗运动。
   2. 计算每个位置探测器的平均功率，并通过将洛伦兹函数拟合到记录的布朗运动¹³ 的功率谱来获得陷阱刚度和 QPD 校准常数 beta。

2. 样品制备

1. 制备α-肌动蛋白偶联荧光珠
   1. 执行偶联¹⁶:取氨基官能化聚苯乙烯珠（直径1μm，固体含量2.5%），在500μL蒸馏水中洗涤两次，然后重悬于500μLPBS（pH 7.0）中。加入1mM HaloTag琥珀酰亚胺酯O₂ 配体，并在室温下孵育1小时。用 500 μL PBS 洗涤 3 次，并用 100-200 μM HaloTag α-肌动蛋白重悬。在37°C孵育1小时，并在500μLPBS中洗涤三次（在1.5周内使用珠子或在液氮中快速冷冻并储存在-80°C）。
   2. 标记:将 200 μL 珠子溶液与罗丹明-BSA 以 5 μg/mL 终浓度孵育 10 分钟。用 50 mM PB 洗涤 3 次，然后重悬于 500 μL PB 50 mM 中。这可以等分在-80°C下储存数月）。
2. 如^前所述表达和纯化生物素化的肌球蛋白-5B4^，17。
3. 聚合并标记F-肌动蛋白¹³:
   1. F-肌动蛋白聚合:混合 69 μL 超纯水、10 μL 肌动蛋白聚合缓冲液 10x（100 mM Tris HCl、20 mM MgCl₂、500 mM KCl、10 mM ATP、50 mM 碳酸胍 pH 7.5）、20 μL G-肌动蛋白 10 mg/mL 和 1 μL DL-二硫苏糖醇 （DTT） 1 M.将其放在冰上超过 1 小时。
   2. 用罗丹明标记 F-肌动蛋白（Ex/Em:546/575 nm）:取 25 μL 聚合的 F-肌动蛋白，加入 19.5 μL 超纯水、2.5 μL 肌动蛋白聚合缓冲液 10 倍（100 mM Tris HCl、20 mM MgCl 2、500 mM KCl、10 mM ATP、50 mM 碳酸胍 pH 7.5）、1 μL 1 M DTT 和₂ μL 250 μM 罗丹明鬼笔环肽。将其放在冰上过夜。对于捕获实验，罗丹明F-肌动蛋白可以储存在冰上并在一周内使用。
4. 样品组装
   1. 取流动室（1.3.5-1.3.12），孵育1mg / mL生物素化的BSA5分钟。用AB缓冲液（25mM MOPS，25mM KCl，4mM MgCl 2，1mM EGTA，1mM DTT，pH_7.2）洗涤后，孵育1mg / mL链霉亲和素5分钟，并用AB缓冲液再次洗涤。在 M5B 缓冲液（10 mM MOPS pH 7.3、0.5 M NaCl、0.1 mM EGTA、3 mM NaN 3）中以₃ nM 浓度孵育生物素化肌球蛋白-5B 重美肌肌蛋白 5B 重美肌蛋白 5 分钟。用三体积的 1 mg/mL 生物素化 BSA 洗涤，并在 AB 中补充有 2 μM CaM 并孵育 3 分钟。
   2. 孵育时制备反应混合物（RM）:0.005%α-肌动蛋白功能化珠子（第2.1节），1nM罗丹明F-肌动蛋白（第2.3节）在成像缓冲液中（IB:AB缓冲液，1.2μM葡萄糖氧化酶，0.2μM过氧化氢酶，17mM葡萄糖，20mM DTT，2μMCaM和ATP，实验所需的浓度）。
   3. 用RM清洗并用硅脂密封腔室。样品现在可以在显微镜下观察了。

3. 测量

1. 组装哑铃。
   1. 通过使用远程翻译器移动样品来寻找漂浮的α-肌动蛋白珠，打开一个陷阱并捕获一个珠子。
   2. 一旦第一个陷阱被占用，移动转换器将捕获的珠子靠近盖玻片表面，以避免捕获多个磁珠，并将另一个珠子困在第二个陷阱中。
   3. 通过调整AOD声波的功率，将两个陷阱调整为相等的刚度。刚度通常设置在 0.03 和 0.14 pN/nm 之间。刚度越小，力噪声越小，特别是在低力下。
   4. 然后翻转电动镜M（图2）切换到荧光显微镜，并通过长距离翻译器¹³置换样品来寻找漂浮在溶液中的肌动蛋白丝。更喜欢长丝（>5μm），因为合成性肌球蛋白会置换它并在分离前移动几微米。
   5. 移动样品，让其中一个被捕获的珠子接近灯丝的一端，直到它们相互附着。然后，将磁珠距离调整到近似的细丝长度，并通过向载物台沿其方向移动来沿未绑定的第二个珠子的方向创建流动。细丝将被流动拉伸，最终将与其结合¹³。珠-肌动蛋白-珠复合体被称为"哑铃"。
2. 建立肌动蛋白-肌球蛋白联系。
   1. 轻轻地将两个疏水阀分开，将灯丝预张力至约3 pN，并通过改变两个AOD之一的频率并使一个陷阱在三角波中振荡来探测哑铃的刚度，并验证运动随后通过其位置信号传输到尾随珠。
   2. 移动载物台，将哑铃放在基座硅胶珠附近，并通过调整被困珠中心的高度略低于硅胶珠直径，允许灯丝与附着在珠子表面上的蛋白质之间的接触。然后将硅胶珠的中心放在被困的珠子之间。
3. 力钳和 nm 稳定反馈:
   1. 打开具有 2-3 pN 力和 200 nm 振荡的超快力夹，并在垂直于肌动蛋白丝的方向上以约 20-30 nm 的离散步长扫描基座珠。等待每个位置发生交互（几秒钟），如果没有观察到交互，则向前迈进。随着蛋白质-细丝相互作用的建立，寻找相互作用更频繁的位置。
   2. 确保当合成肌球蛋白向肌动蛋白丝的一端（通常是+端）移动时，附着在+端的捕获珠向二氧化硅珠移动。将载物台移向灯丝末端，以便在肌球蛋白未结合时，硅胶珠尽可能靠近附着在灯丝末端的捕获珠，并开始纳米稳定反馈。这样，附着在灯丝+末端的被困珠撞到硅胶珠的概率最小。
4. 记录数据。

4. 数据分析⁴

注意:所描述的分析方法允许根据哑铃速度的变化来检测和测量由肌球蛋白步进引起的过程运行和快速步进事件。过程运行分析基于参考^{文献3，4，13}中描述的非过程性电机的数据分析方法进行。

1. 设置速度更改的阈值以允许步进事件检测。由于在这种情况下，预计会向前和向后步骤，因此在两个方向上都可以越过阈值。
2. 将每个步骤分配给相应的运行:如果两个后续步骤之间的时间间隔短于 3 ms，并且步骤的振幅< 90 nm，则将步骤分配给同一运行，否则将步骤分配给不同的运行⁴.
3. 辅助力的正确运行长度⁴.
   1. 通过根据测量的平均运行长度值 <RL_m>计算实际运行长度值 RL，从以下公式计算，在辅助力下校正运行长度，其中 D 是振荡范围:
      
      注意:有关此等式推导的详细信息，请参见参考^文献4。

结果

代表性数据包含在一段时间内的位置记录中，如图 4 所示。在位置记录中可以看到两种位移。首先，当肌球蛋白马达不与肌动蛋白丝相互作用时，被捕获的珠子在溶液的粘性拖曳力下以恒定速度移动，显示线性位移在三角波³ 中操作员设置的振荡范围内振荡（由于时间刻度较长，在图 4 中不可见）。其次，一旦肌球蛋白马...

讨论

尽管单分子技术（例如三珠测定）在技术上具有挑战性且通量低，但由于数据的高信噪比，UFFCS提高了分子相互作用的检测。UFFCS允许研究运动蛋白的负载依赖性，其主要优点是在马达与灯丝结合时非常迅速地施加力，以探测力产生的早期和非常快速的事件以及在受控力下的弱结合状态;在整个运行过程中保持力恒定，并通过完全控制力方向性来探测电机依赖性。关于最后一点，我们在这里使用的?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aliphatic Amine Latex Beads	ThermoFisher	A37362	1.0-μm diameter, 2% (w/v)
Acetone	Sigma	32201
Actin polymerization buffer	Cytoskeleton	BSA02	10X
AODs (acousto-optic deflectors)	AA Opto Electronic	DTS-XY 250	Laser beam deflectors
ATP	Sigma	A7699
Biotinylated-BSA	ThermoFisher	29130
BSA	Sigma	B4287
Calmodulin from porcine brain (CaM)	Merck Millipore	208783
Catalase from bovine liver	Sigma	C40
Condenser	Olympus	OlympusU-AAC, Aplanat, Achromat	NA 1.4, oil immersion
Creatine phosphate disodium salt tetrahydrate	Sigma	27920
Creatine Phosphokinase from rabbit muscle	Sigma	C3755
DDs	AA Opto Electronic	AA.DDS.XX	Two-channel digital synthesizer
DL-Dithiothreitol (DTT)/td>	Sigma	43819
EGTA	Sigma	E4378
G-actin protein	Cytoskeleton	AKL99
Glucose	Sigma	G7528
Glucose Oxidase from Aspergillus niger	Sigma	G7141
HaloTag succinimidyl ester O2 ligand	Promega	P1691
High vacuum silicone grease heavy	Merck Millipore	107921
KCl	Sigma	P9541
KH2PO4/K2HPO4	Sigma	P5379/ P8281
Labview	National Instruments	version 8.1	Data acquisition
Labview FPGA module	National Instruments	version 8.1	Fast Force-Clamp
Matlab	MathWorks	2016	Data analysis
MgCl2	Fluka	63020
Microscope Objective	Nikon	Plan-Apo 60X	NA 1.2, WD 0.2 mm, water imm.
MOPS	Sigma	M1254
Nitrocellulose	Sigma	N8267	0.45 pore size
Pentyl acetate solution	Sigma	46022
Pure Ethanol	Sigma	2860
QPDs	UDT	DLS-20	D Position Detecto
Rhodamine BSA	Molecular Probes	A23016
Rhodamine Phalloidin	Sigma	P1951
Silica beads	Bangslabs	SS04N	1.21 mm, 10% solids
Sodium azide	Sigma	S2002
Streptavidin protein	Sigma	189730