Analyse der mechanoenzymatischen Eigenschaften prozessiver Myosine mit ultraschneller Kraftklemmenspektroskopie

Zusammenfassung

Hier wird ein umfassendes Protokoll zur Durchführung von ultraschnellen Kraftklemmexperimenten an prozessiven Myosin-5-Motoren vorgestellt, das leicht auf die Untersuchung anderer Klassen von prozessiven Motoren ausgeweitet werden könnte. Das Protokoll beschreibt alle notwendigen Schritte, von der Einrichtung der Versuchsapparatur über die Probenvorbereitung bis hin zur Datenerfassung und Analyse.

Zusammenfassung

Die Ultrakurzzeit-Kraftklemmenspektroskopie (UFFCS) ist eine auf einer Laserpinzette basierende Einzelmolekültechnik, die es ermöglicht, die Chemomechanik sowohl konventioneller als auch unkonventioneller Myosine unter Last mit bisher unerreichter Zeitauflösung zu untersuchen. Insbesondere die Möglichkeit, Myosinmotoren direkt nach der Aktin-Myosin-Bindungsbildung unter konstanter Kraft zu untersuchen, hat zusammen mit der hohen Rate der Kraftrückkopplung (200 kHz) gezeigt, dass UFFCS ein wertvolles Werkzeug ist, um die Lastabhängigkeit schneller Dynamiken wie des Myosin-Arbeitsschlags zu untersuchen. Darüber hinaus ermöglicht UFFCS die Untersuchung, wie prozessive und nicht-prozessive Myosin-Aktin-Wechselwirkungen durch die Intensität und Richtung der angewendeten Kraft beeinflusst werden.

Durch die Befolgung dieses Protokolls wird es möglich sein, ultraschnelle Kraftklemmexperimente an prozessiven Myosin-5-Motoren und an einer Vielzahl von unkonventionellen Myosinen durchzuführen. Durch einige Anpassungen konnte das Protokoll auch leicht auf die Untersuchung anderer Klassen von Prozessmotoren wie Kinesine und Dyneine ausgedehnt werden. Das Protokoll umfasst alle notwendigen Schritte, vom Aufbau der Versuchsapparatur über die Probenvorbereitung bis hin zu Kalibrierverfahren, Datenerfassung und Analyse.

Einleitung

In den letzten Jahrzehnten waren optische Pinzetten ein wertvolles Werkzeug, um die Mechanochemie von Proteininteraktionen auf Einzelmolekülebene aufzuklären, da sie die Möglichkeit der gleichzeitigen Manipulation und Messung von Konformationsänderungen und enzymatischer Kinetik ^{auffallen lassen 1,2}. Insbesondere die Fähigkeit, Kräfte im Bereich molekularer Motoren in der Zelle aufzubringen und zu messen, sowie die Fähigkeit, Konformationsänderungen im Sub-Nanometer-Bereich zu messen, machten optische Pinzetten zu einem einzigartigen Einzelmolekülwerkzeug, um die chemomechanischen Eigenschaften von Motorproteinen und deren mechanische Regulation zu entschlüsseln.

Die Ultrakurzzeit-Kraftklemmenspektroskopie (UFFCS) ist eine Einzelmolekül-Kraftspektroskopie-Technik, die auf optischen Pinzetten basiert und entwickelt wurde, um die schnelle Kinetik molekularer Motoren unter Last in einer Drei-Perlen-Geometrie zu untersuchen (Abbildung 1a)^3,4. UFFCS reduziert die Zeitverzögerung für die Krafteinleitung auf das Motorprotein auf die physikalische Grenze einer optischen Pinzette, d.h. die mechanische Relaxationszeit des Systems, und ermöglicht so die schnelle Anwendung der Kraft nach Beginn eines Myosinlaufs (einige zehn Mikrosekunden)³. Diese Fähigkeit wurde genutzt, um die frühen mechanischen Ereignisse im schnellen Skelett-3- und Herz-5-Muskelmyosin zu untersuchen, um die Lastabhängigkeit des Powerstrokes, die schwachen und starken Bindungszustände sowie die Reihenfolge der biochemischen (Pi^{) und mechanischen} (Powerstroke) Ereignisse aufzudecken.

Die Drei-Perlen-Geometrie wird normalerweise verwendet, um nicht-prozessive Motoren zu untersuchen, eine einzelne Perlengeometrie mit einer Kraftklemme wurde häufig verwendet, um prozessive nicht-konventionelle Myosine wie Myosin Va⁶ zu untersuchen. Es gibt jedoch mehrere Gründe, einen Drei-Perlen-UFFCS-Assay auch für prozessive Myosine zu bevorzugen. Erstens ermöglicht das schnelle Anlegen von Lasten direkt nach der Aktin-Myosin-Bindung die Messung der frühen Ereignisse in der Kraftentwicklung wie bei nicht-prozessiven Motoren. Darüber hinaus ermöglicht es bei prozessiven Motoren auch eine genaue Messung der Lauflängen und der Laufdauer des Motors bei konstanter Kraft während des gesamten Verlaufs (Abbildung 1b). Darüber hinaus kann das System aufgrund der hohen Rate der Kraftrückkopplung die Kraft bei schnellen Positionsänderungen, wie z. B. dem Myosin-Arbeitshub, konstant halten und so eine konstante Belastung während des Motorschritts gewährleisten. Die hohe zeitliche Auflösung des Systems ermöglicht die Detektion von Sub-ms-Wechselwirkungen und eröffnet die Möglichkeit, die schwache Bindung von Myosin an Aktin zu untersuchen. Schließlich garantiert die Assay-Geometrie, dass die Kraft entlang des Aktinfilaments aufgebracht wird, mit vernachlässigbaren transversalen und vertikalen Komponenten der Kraft. Dieser Punkt ist von besonderer Relevanz, da gezeigt wurde, dass die vertikale Kraftkomponente die Lastabhängigkeit der Motorkinetik^{signifikant beeinflusst 7,8}. Mit dieser Technik konnten wir eine Reihe von assistiven und resistiven Lasten auf prozessives Myosin-5B anwenden und die Lastabhängigkeit seiner Prozessivität für einen weiten Bereich von Kräften^{direkt messen 4}.

Wie in Abbildung 1a gezeigt, ist in diesem System ein einzelnes Aktinfilament zwischen zwei Polystyrolkügelchen aufgehängt, die im Fokus einer doppelten optischen Pinzette (der "Hantel") gefangen sind. Eine unausgeglichene Nettokraft F = F_{1-F 2} wird durch ein schnelles Rückkopplungssystem auf das Filament ausgeübt, wodurch sich das Filament mit konstanter Geschwindigkeit in eine Richtung bewegt, bis es einen benutzerdefinierten Inversionspunkt erreicht, an dem die Nettokraft in die entgegengesetzte Richtung umgekehrt wird. Wenn das Motorprotein nicht mit dem Filament interagiert, kann sich die Hantel in einer dreieckigen Wellenform hin und her bewegen (Abbildung 1b, unteres Bild), die die Sockelperle überspannt, auf der ein einzelnes Motorprotein befestigt ist. Sobald die Wechselwirkung hergestellt ist, wird die von der Hantel getragene Kraft sehr schnell auf das Motorprotein übertragen und der Motor beginnt, das Filament zu verdrängen, indem er unter die Kraftintensität und -richtung tritt, die vom Rückkopplungssystem zum Zeitpunkt der Interaktion angewendet wurde, bis sich Myosin vom Aktin löst. Da die Verschiebung, die durch das Stepping des Motors erzeugt wird, von der Polarität des eingeschlossenen Aktinfilaments abhängt, kann die Last entsprechend der Richtung der aufgebrachten Kraft entweder unterstützend sein, d. h. in die gleiche Richtung der Motorverdrängung drücken (Push in Abbildung 1b obere Platte), oder resistiv, d. h. in die entgegengesetzte Richtung in Bezug auf die Motorverschiebung ziehen (Pull in Abbildung 1b B. obere Tafel), die es ermöglicht, die chemomechanische Regulation der motorischen Prozessivität sowohl durch die Intensität als auch durch die Richtungsabhängigkeit der aufgebrachten Last zu untersuchen.

In den nächsten Abschnitten werden alle Schritte zur Messung von Aktin-Myosin-5B-Wechselwirkungen unter verschiedenen Belastungen mit einem ultraschnellen Kraft-Klemm-Spektroskopie-Aufbau vollständig beschrieben, einschließlich 1) der Einrichtung des optischen Aufbaus, der Ausrichtung optischer Fallen und der Kalibrierungsverfahren, 2) der Vorbereitung aller Komponenten und ihrer Montage in der Probenkammer, 3) des Messverfahrens, 4) repräsentative Daten und Datenanalyse zur Extraktion wichtiger physikalischer Parameter, wie z.B. der Lauflänge, der Schrittweite und der Geschwindigkeit des Motorproteins.

Protokoll

1. Optischer Aufbau

HINWEIS: Der Versuchsaufbau besteht aus einer doppelten optischen Pinzette mit Nanometer-Ausrichtungsstabilität und < 1% Laserintensitätsschwankungen. Unter diesen Bedingungen ist die Stabilität der Hantel auf Nanometerebene unter typischer Fallensteifigkeit (0,1 pN/nm) und Spannung (1 pN - einige zehn pN) gewährleistet. Abbildung 2 zeigt ein detailliertes Schema des optischen Aufbaus.

1. Design und Konstruktion einer optischen Pinzette 9,10,11.
   1. Platzieren Sie alle Komponenten des Aufbaus gemäß dem Schema in Abbildung 2 auf einem optischen Tisch. Beachten Sie, dass der optische Tisch aktive Isolatoren enthält, um mechanische Vibrationen zu minimieren. Zusätzlich ist die Mikroskopstruktur auf elastomeren Isolatoren montiert, um akustisches Rauschen und mechanische Resonanzen zu absorbieren.
   2. Setzen Sie einen optischen Isolator in der Nähe der Laserquelle ("OI" in Abbildung 2) ein, um zufällige Amplitudenschwankungen aufgrund optischer Rückkopplung zu vermeiden.
   3. Versiegeln Sie den gesamten Pfad in einer geschlossenen Box, um Luftströmungen und Turbulenzen zu reduzieren, die die Stabilität der Laserpointierung beeinträchtigen könnten.
   4. Erzeugen Sie die doppelte optische Pinzette, indem Sie die Hauptlaserquelle (Nd:YAG-Laser, 1.064 nm Wellenlänge in Abbildung 2) unter Verwendung von polarisierenden Strahlteilern (PBS) in zwei Zweige mit orthogonaler Polarisation aufteilen. Time-Sharing-Fallen sollten vermieden werden, da sie eine Schwingung der Hantel unter Spannung¹² induzieren.
   5. Verwenden Sie zwei akusto-optische Deflektoren (AODs in Abbildung 2), die von Direct Digital Synthesizern (DDSs) angetrieben werden, um feine und schnelle Bewegungen der beiden Fallen und eine präzise Regulierung der Aktinspannung zu ermöglichen, indem die DDS direkt durch die digitalen Ausgänge der feldprogrammierbaren Gate-Array-FPGA-Platine gesteuert werden (siehe Abbildung 2).
      HINWEIS: Die Gesamtreaktionszeit der Rückkopplung muss <10 μs betragen, um die Kraft auf beide Fallen während der Messungen, einschließlich des ungebundenen Zustands, der Myosin-Wechselwirkung und der Bewegung, schnell zu korrigieren und konstant zu halten. Dazu müssen Positionsdetektoren eine Bandbreite von >= 100 kHz haben und Daten mit einer Abtastrate von >= 200 kHz erfasst werden. Für jeden erfassten Datenpunkt (5 μs Erfassungszeit) werden proportionale Korrekturen für die beiden Traps vom FPGA berechnet und an die beiden DDS gesendet, die die AODs ansteuern. Die AOD-Reaktionszeit muss unter 5 μs liegen, um die erforderliche Antwortzeit zu erreichen.
   6. Für die nm-Detektion der Position der gefangenen Kügelchen setzen Sie zwei Quadrant-Photodiodendetektoren (QPDs in Abbildung 2) in die hintere Brennebene des Kondensators. Die genaue Ausrichtung der QPDs in einer Ebene, die mit der hinteren Brennebene des Kondensators konjugiert ist, sowie der AODs in einer Ebene, die mit der hinteren Brennebene des Objektivs konjugiert ist, stellt sicher, dass QPDs-Signale unabhängig von der AOD-Frequenz sind.
   7. Montieren Sie den AOD auf einem Linearübersetzer mit Mikrometerantrieb und verschieben Sie ihn, bis der Kristallrand in die Nähe des Laserstrahls kommt. Ersetzen Sie dann das Objektiv durch eine Blende, die auf dem Objektivgehäuse mit Gewinde zentriert ist, und regulieren Sie die Blende so, dass sie zur Größe der hinteren Blende des Objektivs passt.
   8. Bewegen Sie den Übersetzer in Richtung des Laserstrahls, bis der vom Piezokristall blockierte Teil des Strahls nach der Blende sichtbar ist, drehen Sie den Übersetzer leicht nach hinten, damit der Strahl die Blendenöffnung wieder vollständig ausfüllt.
   9. Wiederholen Sie die Schritte 1.1.7 bis 1.1.8 für den zweiten AOD. Die Reaktionszeit der Rückkopplungsschleife wird überprüft, indem die Zeitverzögerung von den QPDs gemessen wird, während ein Strahl auf einer Perle, die auf der Oberfläche des Deckglases¹³ klebt, schnell bewegt wird.
      HINWEIS: Die oben genannten drei Schritte (1.1.7-1-1-9) führen zu einer sorgfältigen Ausrichtung der AOD-Kristalle. Diese Schritte sind wichtig, um das Zeitverhalten sowohl der Strahlablenkung als auch der Rückkopplung¹³ zu optimieren.
2. Messen Sie mit Hilfe einer Fotodiode die Intensitätsschwankungen des Fanglasers am Mikroskopeingang, die unter 1% liegen müssen. Beachten Sie, dass die Bandbreite der Fotodioden größer als die Abbildungsrate sein muss.
3. Überprüfen Sie die Ausrichtungsstabilität beider Fallen.
   1. Präparation von Kieselsäurekügelchen in Phosphatpuffer (PB) durch Verdünnen von 20 μL Kieselsäurekügelchen (1,2 μm, 10 % Feststoffe) in 1 ml Aceton, Ultraschall für 30 s, kurzzeitiger Wirbel und Zentrifuge für 2 min bei 19.000 x g.
   2. Entfernen Sie den Überstand, resuspendieren Sie in 1 ml Aceton und wiederholen Sie die Wäsche. Resuspendieren in 1 ml 50 mM PB, 2 mal waschen. Zum Schluss in 100 μL 50 mM PB resuspendieren.
   3. Führen Sie eine optische Pinzette mit Siliziumdioxidperlen durch, indem Sie ein Deckglas mit einem doppelseitigen Klebeband (ca. 60 μm dick) auf einen Objektträger kleben, um eine Durchflusskammer zu bauen. Füllen Sie die Kammer mit einem 1 mg/ml BSA (Rinderserumalbuminprotein) und warten Sie 3 Minuten.
   4. Eine 1:1000-Verdünnung von Kieselsäurekügelchen in PB wird in die Kammer fließen. Verwenden Sie eine Spritze, die mit Silikonfett gefüllt ist, um die Kammer sorgfältig zu verschließen. In jeder Falle wird eine einzelne Perle eingefangen und die Leistungsspektrummethode¹⁴ angewendet, um sie zu kalibrieren.
   5. Herstellen von Kieselsäurekügelchen in Pentylacetat (bei Raumtemperatur) durch Lösen von 20 μL Kieselsäurekügelchen (1,2 μm Durchmesser, 10% Feststoff) in 1-1,5 ml Aceton, Wirbel und Ultraschall für 30 s.
   6. Zentrifuge bei 18.500 x g für 2 min. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie in 1 ml Aceton, dann wiederholen Sie die Wäsche. In 1 ml Pentylacetat resuspendieren und 2-mal in Pentylacetat waschen (Zentrifuge und Resuspension). Das Pellet wird in 100 μL Nitrocellulose 1% und 900 μL Pentylacetat resuspendiert. 2 Monate bei 4 °C lagern.
   7. Nehmen Sie ein 24 x 24 mm großes Deckglas aus Glas und reinigen Sie es sorgfältig mit Papier, das mit reinem Ethanol getränkt ist. Dann, während Sie es mit einer sauberen Pinzette halten, spülen Sie es ein zweites Mal, indem Sie es direkt mit reinem Ethanol waschen. Lassen Sie es unter einem sanften Stickstoffstrom trocknen. Wiederholen Sie diesen Vorgang bei Bedarf, um alle sichtbaren Rückstände auf der Glasoberfläche zu entfernen.
   8. Nehmen Sie die Kieselsäureperlen, wirbeln Sie sie und beschallen Sie sie kurz für ~ 30 s.
   9. Nachdem Sie ein zweites Deckglas (24 x 60 mm) gereinigt haben, schmieren Sie damit 2 μl Silica-Kügelchenlösung auf eine Oberfläche des Deckglases und warten Sie, bis es getrocknet ist.
   10. Reinigen Sie sorgfältig einen Objektträger (26 x 76 mm), der zur Erstellung der Durchflusskammer verwendet wird.
   11. Schneiden Sie zwei Reihen doppeltes Klebeband (~ 3 mm groß, 60-100 μm dick) und befestigen Sie sie auf einer Seite des Objektträgers, wie in Abbildung 3 gezeigt.
   12. Mit einer sauberen Pinzette wird die Kammer (ca. 20 μl Endvolumen) verschlossen, indem das beschichtete Deckglas (1.3.9) mit den Klebebandlinien in Berührung kommt, wobei die Nitrocellulose + Perlenschicht der Innenseite der Kammer zugewandt ist, wie in Abbildung 3a dargestellt. Füllen Sie die Durchflusskammer mit 50 mM Phosphatpuffer und versiegeln Sie sie mit Silikonfett.
   13. Bilden Sie eine einzelne Siliziumdioxidperle in der Hellfeldmikroskopie bei >200-facher Vergrößerung mit einem ladungsgekoppelten Gerät (CCD) oder einer komplementären Metalloxid-Halbleiter-Kamera (CMOS) mit >1,4 Megapixeln ab. Verwenden Sie eine Feedback-Software, um den Piezotisch (mit Nanometergenauigkeit oder besser) zu bewegen, um thermische Drifts zu kompensieren¹⁰.
   14. Überlappen Sie die Mitte der linken Falle mit der Mitte der Perle (x-y-Signalpegel von der QPD sollten mit denen aus der Kalibrierung übereinstimmen). Messen Sie dann das Positionsrauschen und die Standardabweichung der Positionssignale für diese Falle.
   15. Wiederholen Sie den vorherigen Schritt für die rechte Falle¹⁵.
4. Kalibrierung der Fallenposition: MHz bis nm
   1. Es wird eine Durchflusskammer mit Kieselsäurekügelchen auf der Deckglasoberfläche (1.3.5-1.3.12) und schwimmenden Polystyrolkügelchen (verwenden Sie α-Aktinin-konjugierte Kügelchen, die wie im folgenden Abschnitt 2.1 hergestellt werden).
   2. Fokussieren Sie eine Siliziumdioxidperle auf die Deckglasoberfläche, die leicht dezentriert (~ 5 μm) von der Mitte des Sichtfeldes (FOV) entfernt ist, und nehmen Sie ein Bild des Sichtfelds auf. Bewegen Sie die Perle mit dem Piezotisch um 10 μm in Richtung FOV-Zentrum und nehmen Sie ein zweites Bild auf. Berechnen Sie den Mittelpunkt der Perle in den beiden Bildern mit einem Schwerpunktalgorithmus oder einem ähnlichen Algorithmus und berechnen Sie den Abstand zwischen den beiden Perlen in Pixeln, um die nm / Pixel-Kalibrierung der Hellfeldkamera zu erhalten.
   3. Fangen Sie ein einzelnes schwimmendes Teilchen in einer Falle ein. Bewegen Sie dann die Falle mit AOD in kleinen Schritten (0,2 MHz) und erfassen Sie für jeden Schritt ein Bild des Partikels und die entsprechende Frequenz des AOD. Berechnen Sie die Position des Partikels im Sichtfeld, indem Sie wie zuvor den Schwerpunktalgorithmus verwenden, und rechnen Sie ihn mit der im vorherigen Schritt erhaltenen nm/Pixel-Kalibrierung in nm um.
   4. Führen Sie eine lineare Anpassung an die Frequenzpositionsdaten durch und berechnen Sie die Kalibrierkonstante in nm/MHz.
   5. Erneute Kalibrierung für die zweite Falle
5. Kalibrierung der Trap-Leistung und -Steifigkeit (MHz vs. W), QPD (MHz vs. pN/nm)
   1. Es wird eine Durchflusskammer mit Kieselsäurekügelchen auf der Deckglasoberfläche (1.3.5-1.3.12) und schwimmenden Polystyrolkügelchen (Verwendung von α-Aktinin-konjugierten Kügelchen, die wie im folgenden Abschnitt 2.1 hergestellt wurden) vorbereitet und ein einzelnes Partikel in einer Falle aufgefangen. Verschieben Sie dann beide Fallen in kleinen Schritten (0,2 MHz) durch AODs und zeichnen Sie eine Brownsche Bewegung des Teilchens in beiden Fallen mit QPD und der entsprechenden Frequenz der AODs auf.
   2. Berechnen Sie eine durchschnittliche Leistung der Detektoren an jeder Position und erhalten Sie die Fangsteifigkeit und die QPD-Kalibrierungskonstante Beta, indem Sie eine Lorentzsche Funktion an ein Leistungsspektrum der aufgezeichneten Brownschen Bewegung¹³ anpassen.

2. Probenvorbereitung

1. Bereiten Sie α-Aktinin-konjugierte fluoreszierende Kügelchen vor
   1. Konjugation¹⁶ durchführen: Nehmen Sie aminofunktionalisierte Polystyrolkügelchen (1 μm Durchmesser, 2,5% Feststoffe), waschen Sie sie zweimal in 500 μL destilliertem Wasser und resuspendieren Sie sie in 500 μL PBS (pH 7,0). 1 mM HaloTag Succinimidylester_O2-Ligand zugeben und bei Raumtemperatur für 1 h inkubieren. Dreimal mit 500 μL PBS waschen und mit 100-200 μM HaloTag α-Aktinin resuspendieren. 1 h bei 37 °C inkubieren und dreimal in 500 μL PBS waschen (Kügelchen innerhalb von 1,5 Wochen verwenden oder in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei −80 °C lagern).
   2. Etikettierung: 200 μL Kügelchenlösung mit Rhodamin-BSA bei 5 μg/ml Endkonzentration für 10 min inkubieren. Dreimal mit 50 mM PB waschen und in 500 μL PB 50 mM resuspendieren. Dieses kann monatelang in Aliquots bei - 80 °C gelagert werden).
2. Biotinyliertes Myosin-5B exprimieren und reinigen, wie zuvor ^4,17 beschrieben.
3. Polymerisieren und markieren Sie F-Aktin¹³:
   1. F-Aktin-Polymerisation: Mischen Sie 69 μL Reinstwasser, 10 μL Aktin-Polymerisationspuffer 10x (100 mM Tris HCl, 20 mM MgCl₂, 500 mM KCl, 10 mM ATP, 50 mM Guanidincarbonat pH 7,5), 20 μL G-Aktin 10 mg / ml und 1 μL DL-Dithiothreitol (DTT) 1 M. Lassen Sie es länger als 1 Stunde auf Eis.
   2. F-Aktin-Markierung mit Rhodamin (Ex/Em: 546/575 nm): Man nehme 25 μL polymerisiertes F-Aktin und füge 19,5 μL Reinstwasser, 2,5 μL Aktin-Polymerisationspuffer 10x (100 mM Tris HCl, 20 mM MgCl2, 500 mM KCl, 10 mM ATP, 50 mM Guanidincarbonat pH_7,5), 1 μL 1 M DTT und 2 μL 250 μM Rhodaminphalloidin hinzu. Lassen Sie es über Nacht auf Eis. Für Fangversuche kann Rhodamin F-Aktin auf Eis gelagert und innerhalb einer Woche verbraucht werden.
4. Mustermontage
   1. Nehmen Sie die Durchflusskammer (1.3.5-1.3.12) und inkubieren Sie 1 mg/ml biotinyliertes BSA für 5 min. Nach dem Waschen mit AB-Puffer (25 mM MOPS, 25 mM KCl, 4 mM MgCl 2, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, pH_7,2) 1 mg/ml Streptavidin 5 min inkubieren und erneut mit AB-Puffer waschen. Biotinyliertes Myosin-5B-schweres Meromyosin bei 3 nM Konzentration in M5B-Puffer (10 mM MOPS pH 7,3, 0,5 M NaCl, 0,1 mM EGTA, 3 mM NaN₃) mit 2 μM Calmodulin (CaM) für 5 min inkubieren. Mit drei Volumina 1 mg/ml biotinyliertem BSA, ergänzt mit 2 μM CaM in AB, waschen und 3 min inkubieren.
   2. Bereiten Sie während der Inkubation die Reaktionsmischung (RM) vor: 0,005% α-Aktinin-funktionalisierte Kügelchen (Abschnitt 2.1), 1 nM Rhodamin F-Aktin (Abschnitt 2.3) im Bildgebungspuffer (IB: AB-Puffer mit 1,2 μM Glucose-Oxidase, 0,2 μM Katalase, 17 mM Glucose, 20 mM DTT, 2 μM CaM und ATP in der für das Experiment benötigten Konzentration).
   3. Mit RM waschen und die Kammer mit Silikonfett verschließen. Die Probe ist nun bereit, unter dem Mikroskop betrachtet zu werden.

3. Messung

1. Montieren Sie die Hantel.
   1. Suchen Sie nach den schwimmenden α-Aktinin-Kügelchen, indem Sie die Probe mit Langstrecken-Übersetzern bewegen, eine Falle einschalten und eine Perle einfangen.
   2. Sobald die erste Überfüllung besetzt ist, bewegen Sie den Übersetzer, um die gefangene Perle in der Nähe der Deckglasoberfläche zu positionieren, um ein Überfangen mehrerer Perlen zu vermeiden, und fangen Sie eine weitere Perle in der zweiten Falle ein.
   3. Stellen Sie die beiden Fallen auf gleiche Steifigkeiten ein, indem Sie die Stärke der akustischen Wellen der AODs anpassen. Die Steifigkeiten werden in der Regel zwischen 0,03 und 0,14 pN/nm eingestellt. Je kleiner die Steifigkeit, desto geringer das Kraftgeräusch, insbesondere bei geringen Kräften.
   4. Drehen Sie dann den motorisierten Spiegel M (Abbildung 2), um zur Fluoreszenzmikroskopie zu wechseln, und suchen Sie nach einem Aktinfilament, das in Lösung schwimmt, indem Sie die Probe durch Langstreckenübersetzer¹³ verschieben. Bevorzugen Sie lange Filamente (>5 μm), da das prozessive Myosin es verdrängt und einige Mikrometer bewegt, bevor es sich löst.
   5. Bewegen Sie die Probe, damit sich eine der gefangenen Perlen einem Ende des Filaments nähert, bis sie sich aneinander anheften. Passen Sie dann den Perlenabstand an die ungefähre Filamentlänge an und erzeugen Sie eine Strömung in Richtung der ungebundenen zweiten Perle, indem Sie die Bühne in ihre Richtung bewegen. Das Filament wird durch die Strömung gedehnt und bindet sich schließlich^{an sie 13}. Der Perlen-Aktin-Perlen-Komplex wird als "Hantel" bezeichnet.
2. Stellen Sie einen Aktin-Myosin-Kontakt her.
   1. Trennen Sie die beiden Fallen vorsichtig weit auseinander, um das Filament auf etwa 3 pN vorzuspannen, und untersuchen Sie die Steifigkeit der Hantel, indem Sie eine Falle in einer dreieckigen Welle oszillieren lassen, indem Sie die Frequenz eines der beiden AODs ändern und die daraus resultierende Übertragung der Bewegung auf die nachfolgende Perle durch ihr Positionssignal überprüfen.
   2. Bewegen Sie die Bühne, um die Hantel in die Nähe einer Sockel-Siliziumdioxid-Perle zu stellen, und ermöglichen Sie den Kontakt zwischen dem Filament und dem Protein, das an der Perlenoberfläche befestigt ist, indem Sie die Höhe der gefangenen Perlenzentren etwas unterhalb des Kieselsäureperlendurchmessers einstellen. Positionieren Sie dann die Mitte der Kieselsäureperle zwischen den gefangenen Kügelchen.
3. Kraftklemme und nm-Stabilisierungs-Feedback:
   1. Schalten Sie die ultraschnelle Kraftklemme mit 2-3 pN Kraft und 200 nm Oszillation ein und tasten Sie die Sockelperle in diskreten Schritten von ca. 20-30 nm senkrecht zum Aktinfilament ab. Warten Sie, bis an jeder Position Wechselwirkungen auftreten (einige Sekunden), und gehen Sie dann voraus, wenn keine Wechselwirkung beobachtet wird. Wenn die Protein-Filament-Wechselwirkung etabliert ist, suchen Sie nach der Position, an der Wechselwirkungen häufiger sind.
   2. Stellen Sie sicher, dass, wenn sich das prozessive Myosin in Richtung eines Endes des Aktinfilaments (normalerweise das +-Ende) bewegt, sich die gefangene Perle, die am +-Ende befestigt ist, in Richtung der Kieselsäureperle bewegt. Bewegen Sie die Stufe in Richtung des -Endes des Filaments, so dass die Siliziumdioxidperle so nah wie möglich an der gefangenen Perle liegt, die am -Ende des Filaments befestigt ist, wenn Myosin nicht gebunden ist, und starten Sie die Nanometer-Stabilisierungsrückkopplung. Auf diese Weise wird die Wahrscheinlichkeit minimiert, dass die am +Ende des Filaments befestigte eingeschlossene Perle in die Kieselsäureperle prallt.
4. Zeichnen Sie Daten auf.

4. Datenanalyse⁴

HINWEIS: Die beschriebene Analysemethode ermöglicht die Erkennung und Messung von prozessiven Läufen und schnellen Schrittereignissen basierend auf Änderungen der Hantelgeschwindigkeit, wie sie durch Myosin-Stepping verursacht werden. Die Analyse der prozessiven Läufe erfolgt auf der Grundlage eines Datenanalyseverfahrens für nichtprozessive Motoren, das in den Referenzen ^3,4,13 beschrieben ist.

1. Legen Sie einen Schwellenwert für Geschwindigkeitsänderungen fest, um die Erkennung von Stepping-Ereignissen zu ermöglichen. Da in diesem Fall sowohl Vorwärts- als auch Rückwärtsschritte zu erwarten sind, wird das Überschreiten der Schwelle in beide Richtungen akzeptiert.
2. Ordnen Sie jeden Schritt dem entsprechenden Lauf zu: Wenn das Zeitintervall zwischen zwei aufeinanderfolgenden Schritten kürzer als 3 ms ist und die Amplitude der Schritte < 90 nm beträgt, werden die Schritte demselben Lauf zugeordnet, andernfalls werden die Schritte verschiedenen Läufen^{zugeordnet 4}.
3. Korrekte Lauflänge für Hilfskräfte⁴.
   1. Korrigieren Sie die Lauflängen unter Hilfskräften, indem Sie den realen Lauflängenwert RL aus dem gemessenen durchschnittlichen Lauflängenwert <RL_m> aus der folgenden Gleichung berechnen, wobei D der Schwingungsbereich ist:
      
      HINWEIS: Details zur Herleitung dieser Gleichung finden Sie in Referenz⁴.

Ergebnisse

Repräsentative Daten bestehen aus Positionsdatensätzen im Zeitverlauf, wie in Abbildung 4 dargestellt. In der Positionsaufzeichnung sind zwei Arten von Verschiebungen sichtbar. Erstens, wenn der Myosinmotor nicht mit dem Aktinfilament wechselwirkt, bewegen sich die gefangenen Kügelchen mit konstanter Geschwindigkeit gegen die viskose Widerstandskraft der Lösung und zeigen eine lineare Verschiebung, die innerhalb des vom Bediener in einer Dreieckswelle³ eingestellt...

Diskussion

Obwohl Einzelmolekültechniken, wie der Drei-Perlen-Assay, technisch anspruchsvoll sind und einen geringen Durchsatz haben, verbessert UFFCS die Detektion molekularer Wechselwirkungen dank des hohen Signal-Rausch-Verhältnisses der Daten. UFFCS ermöglicht die Untersuchung der Lastabhängigkeit von Motorproteinen mit den Hauptvorteilen, dass die Kraft bei der Bindung des Motors an das Filament sehr schnell angewendet wird, um frühe und sehr schnelle Ereignisse in der Krafterzeugung und schwache Bindungszustände unter k...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aliphatic Amine Latex Beads	ThermoFisher	A37362	1.0-μm diameter, 2% (w/v)
Acetone	Sigma	32201
Actin polymerization buffer	Cytoskeleton	BSA02	10X
AODs (acousto-optic deflectors)	AA Opto Electronic	DTS-XY 250	Laser beam deflectors
ATP	Sigma	A7699
Biotinylated-BSA	ThermoFisher	29130
BSA	Sigma	B4287
Calmodulin from porcine brain (CaM)	Merck Millipore	208783
Catalase from bovine liver	Sigma	C40
Condenser	Olympus	OlympusU-AAC, Aplanat, Achromat	NA 1.4, oil immersion
Creatine phosphate disodium salt tetrahydrate	Sigma	27920
Creatine Phosphokinase from rabbit muscle	Sigma	C3755
DDs	AA Opto Electronic	AA.DDS.XX	Two-channel digital synthesizer
DL-Dithiothreitol (DTT)/td>	Sigma	43819
EGTA	Sigma	E4378
G-actin protein	Cytoskeleton	AKL99
Glucose	Sigma	G7528
Glucose Oxidase from Aspergillus niger	Sigma	G7141
HaloTag succinimidyl ester O2 ligand	Promega	P1691
High vacuum silicone grease heavy	Merck Millipore	107921
KCl	Sigma	P9541
KH2PO4/K2HPO4	Sigma	P5379/ P8281
Labview	National Instruments	version 8.1	Data acquisition
Labview FPGA module	National Instruments	version 8.1	Fast Force-Clamp
Matlab	MathWorks	2016	Data analysis
MgCl2	Fluka	63020
Microscope Objective	Nikon	Plan-Apo 60X	NA 1.2, WD 0.2 mm, water imm.
MOPS	Sigma	M1254
Nitrocellulose	Sigma	N8267	0.45 pore size
Pentyl acetate solution	Sigma	46022
Pure Ethanol	Sigma	2860
QPDs	UDT	DLS-20	D Position Detecto
Rhodamine BSA	Molecular Probes	A23016
Rhodamine Phalloidin	Sigma	P1951
Silica beads	Bangslabs	SS04N	1.21 mm, 10% solids
Sodium azide	Sigma	S2002
Streptavidin protein	Sigma	189730