Dissection des propriétés mécanoenzymatiques des myosines processives avec la spectroscopie ultrarapide à pince de force

Résumé

Présenté ici est un protocole complet pour effectuer des expériences de serrage de force ultrarapide sur des moteurs de myosine-5 processive, qui pourrait être facilement étendu à l’étude d’autres classes de moteurs processifs. Le protocole détaille toutes les étapes nécessaires, de la configuration de l’appareil expérimental à la préparation des échantillons, en passant par l’acquisition et l’analyse des données.

Résumé

La spectroscopie ultrarapide de pince de force (UFFCS) est une technique à molécule unique basée sur des pinces laser qui permet d’étudier la chimiomécanique des myosines conventionnelles et non conventionnelles sous charge avec une résolution temporelle sans précédent. En particulier, la possibilité de sonder les moteurs de myosine sous force constante juste après la formation de la liaison actine-myosine, ainsi que le taux élevé de retour de force (200 kHz), ont montré que l’UFFCS est un outil précieux pour étudier la dépendance de charge de dynamiques rapides telles que la course de travail de la myosine. De plus, UFFCS permet d’étudier comment les interactions processives et non processives myosine-actine sont influencées par l’intensité et la direction de la force appliquée.

En suivant ce protocole, il sera possible d’effectuer des expériences de serrage de force ultrarapides sur des moteurs de myosine-5 processive et sur une variété de myosines non conventionnelles. Par quelques ajustements, le protocole pourrait également être facilement étendu à l’étude d’autres classes de moteurs processifs tels que les kinésines et les dynéines. Le protocole comprend toutes les étapes nécessaires, de la configuration de l’appareil expérimental à la préparation des échantillons, en passant par les procédures d’étalonnage, l’acquisition et l’analyse des données.

Introduction

Au cours des dernières décennies, les pinces optiques ont été un outil précieux pour élucider la mécanochimie des interactions protéiques au niveau de la molécule unique, en raison de la possibilité frappante de manipulation et de mesure simultanées des changements conformationnels et de la cinétique enzymatique ^1,2. En particulier, la capacité d’appliquer et de mesurer des forces dans la gamme de celles exercées par les moteurs moléculaires dans la cellule, ainsi que la capacité de mesurer les changements conformationnels subnanométriques, ont fait des pincettes optiques un outil unique à molécule unique pour démêler les propriétés chimiomécaniques des protéines motrices et leur régulation mécanique.

La spectroscopie ultrarapide de serrage de force (UFFCS) est une technique de spectroscopie de force à molécule unique basée sur des pinces optiques, développée pour étudier la cinétique rapide des moteurs moléculaires sous charge dans une géométrie à trois billes (Figure 1a)^3,4. L’UFFCS réduit le délai d’application de la force à la protéine motrice à la limite physique des pincettes optiques, c’est-à-dire le temps de relaxation mécanique du système, permettant ainsi l’application de la force rapidement après le début d’une poussée de myosine (quelques dizaines de microsecondes)³. Cette capacité a été exploitée pour étudier les premiers événements mécaniques de la myosine musculaire ^{rapide squelettique 3} et cardiaque⁵ afin de révéler la dépendance de charge du coup de puissance, les états de liaison faible et forte, ainsi que l’ordre des événements biochimiques (Pi) et mécaniques (coup de puissance).

La géométrie à trois billes est généralement utilisée pour étudier les moteurs non processifs, une géométrie à une seule bille avec une pince de force a été couramment utilisée pour étudier les myosines non conventionnelles processives telles que la myosine Va⁶. Cependant, il y a plusieurs raisons de préférer un test UFFCS à trois billes également pour les myosines processives. Tout d’abord, l’application rapide de la charge juste après la liaison actine-myosine permet de mesurer les événements précoces dans le développement de la force comme dans les moteurs non processifs. En outre, dans le cas des moteurs processifs, il permet également une mesure précise des longueurs de course du moteur et de leurs durées de fonctionnement à force constante tout au long de leur progression (Figure 1b). De plus, en raison du taux élevé de retour de force, le système peut maintenir la force constante lors de changements rapides de position, tels que la course de travail de myosine, garantissant ainsi une charge constante pendant le pas moteur. La résolution temporelle élevée du système permet la détection des interactions sub-ms, ouvrant la possibilité d’étudier la faible liaison de la myosine à l’actine. Enfin, la géométrie du dosage garantit que la force est appliquée le long du filament d’actine, avec des composantes transversales et verticales négligeables de la force. Ce point est d’autant plus important que la composante de force verticale influence de manière significative la dépendance à la charge de la cinétique du moteur ^7,8. En utilisant cette technique, nous avons pu appliquer une gamme de charges assistives et résistives à la myosine-5B processive et mesurer directement la dépendance de charge de sa processivité pour une large gamme de forces⁴.

Comme le montre la figure 1a, dans ce système, un seul filament d’actine est suspendu entre deux billes de polystyrène piégées dans le foyer d’une pince optique double (l'« haltère »). Une force nette déséquilibrée F= F_{1-F 2} est imposée au filament, grâce à un système de rétroaction rapide, qui fait que le filament se déplace à vitesse constante dans une direction jusqu’à ce qu’il atteigne un point d’inversion défini par l’utilisateur où la force nette est inversée dans la direction opposée. Lorsque la protéine motrice n’interagit pas avec le filament, l’haltère est libre de se déplacer d’avant en arrière en forme d’onde triangulaire (Figure 1b, panneau inférieur) couvrant le cordon du piédestal sur lequel une seule protéine motrice est fixée. Une fois l’interaction établie, la force portée par l’haltère est très rapidement transférée à la protéine motrice et le moteur commence à déplacer le filament en passant sous l’intensité et la direction de la force appliquée par le système de rétroaction au moment de l’interaction, jusqu’à ce que la myosine se détache de l’actine. Étant le déplacement produit par le pas du moteur dépendant de la polarité du filament d’actine piégé, selon la direction de la force appliquée, la charge peut être soit assistée, c’est-à-dire poussée dans la même direction que le déplacement du moteur (poussée dans le panneau supérieur de la figure 1b), soit résistive, c’est-à-dire tirant dans la direction opposée par rapport au déplacement du moteur (traction à la figure 1b panneau supérieur) permettant d’étudier la régulation chimiomécanique de la processivité motrice tant par l’intensité que par la directionnalité de la charge appliquée.

Dans les sections suivantes, toutes les étapes pour mesurer les interactions actine-myosine-5B sous différentes charges avec une configuration de spectroscopie à pince de force ultrarapide sont entièrement décrites, y compris 1) la mise en place de la configuration optique, l’alignement des pièges optiques et les procédures d’étalonnage, 2) la préparation de tous les composants et leur assemblage dans la chambre d’échantillonnage, 3) la procédure de mesure, 4) des données représentatives et une analyse des données pour extraire des paramètres physiques importants, tels que la longueur de la course, la taille du pas et la vitesse de la protéine motrice.

Protocole

1. Configuration optique

REMARQUE: La configuration expérimentale est composée de pincettes optiques doubles avec une stabilité de pointage nanométrique et < fluctuations d’intensité laser de 1%. Dans ces conditions, la stabilité de l’haltère au niveau nanométrique est garantie sous la rigidité typique du piège (0,1 pN/nm) et la tension (1 pN - quelques dizaines de pN). La figure 2 montre un schéma détaillé de la configuration optique.

1. Conception et construction de pinces optiques 9,10,11.
   1. Placez tous les composants de la configuration sur une table optique selon le schéma de la figure 2. Notez que le tableau optique comprend des isolateurs actifs pour minimiser les vibrations mécaniques. De plus, la structure du microscope est montée sur des isolateurs élastomères pour absorber le bruit acoustique et les résonances mécaniques.
   2. Insérez un isolateur optique à proximité de la source laser (« OI » de la figure 2), afin d’éviter les fluctuations d’amplitude aléatoires dues à la rétroaction optique.
   3. Scellez l’ensemble du trajet dans une boîte fermée pour réduire le courant d’air et les turbulences qui pourraient avoir un impact sur la stabilité du pointage laser.
   4. Créez les pincettes optiques doubles en divisant la source laser principale (laser Nd:YAG, longueur d’onde de 1 064 nm sur la figure 2) en deux branches avec des polarisations orthogonales à l’aide de séparateurs de faisceau polarisant (PBS). Les pièges à temps partagé sont à éviter car ils induisent une oscillation de l’haltère sous tension¹².
   5. Utilisez deux déflecteurs acousto-optiques (AOD sur la Figure 2) pilotés par des synthétiseurs numériques directs (DDS) pour permettre des mouvements fins et rapides des deux pièges et une régulation précise de la tension de l’actine en pilotant directement les DDS à travers les sorties numériques de la carte FPGA Gate Array programmable sur le terrain (voir Figure 2).
      REMARQUE: Le temps de réponse global de rétroaction doit être de <10 μs pour corriger rapidement et maintenir une force constante sur les deux pièges pendant les mesures, y compris l’état non lié, l’interaction de la myosine et le mouvement. À cette fin, les détecteurs de position doivent avoir une largeur de bande de >= 100 kHz et les données doivent être acquises à >= fréquence d’échantillonnage de 200 kHz. Pour chaque point de données acquis (temps d’acquisition de 5 μs), les corrections proportionnelles des deux traps sont calculées par le FPGA et envoyées aux deux DDS pilotant les AOD. Le temps de réponse AOD doit être inférieur à 5 μs pour satisfaire au temps de réponse de rétroaction requis.
   6. Pour la détection nm de la position des billes piégées, placez deux détecteurs de photodiodes quadrants (QPD sur la figure 2) dans le plan focal arrière du condensateur. L’alignement précis des QPD dans un plan conjugué au plan focal arrière du condensateur, ainsi que des AOD dans un plan conjugué au plan focal arrière de l’objectif, garantira que les signaux QPD seront indépendants de la fréquence AOD.
   7. Montez l’AOD sur un traducteur linéaire avec lecteur micrométrique et déplacez-le jusqu’à ce que le bord cristallin se rapproche du faisceau laser. Ensuite, remplacez l’objectif par un iris, centré sur le boîtier fileté de l’objectif, et réglez son ouverture pour s’adapter à la taille de l’ouverture arrière de l’objectif.
   8. Déplacez le traducteur vers le faisceau laser jusqu’à ce que la partie du faisceau bloquée par le cristal piézoélectrique soit visible après l’iris, tournez le traducteur légèrement vers l’arrière pour que le faisceau remplisse à nouveau complètement l’ouverture de l’iris.
   9. Répétez les étapes 1.1.7 à 1.1.8 pour le deuxième AOD. Vérifiez le temps de réponse de la boucle de rétroaction en mesurant le décalage par rapport aux QPD tout en déplaçant rapidement une poutre sur un cordon collé à la surface de la lamelle^{de couverture 13}.
      NOTE: Les trois étapes ci-dessus (1.1.7-1-1-9) conduisent à l’alignement minutieux des cristaux AOD. Ces étapes sont importantes pour optimiser la réponse temporelle de la déviation du faisceau et de la rétroaction¹³.
2. Au moyen d’une photodiode, mesurez les fluctuations d’intensité du laser de piégeage à l’entrée du microscope qui doivent être inférieures à 1%. Notez que la largeur de bande de la photodiode doit être supérieure à la fréquence d’imagerie.
3. Vérifiez la stabilité de pointage des deux pièges.
   1. Préparer les billes de silice dans un tampon phosphate (PB) en diluant 20 μL de billes de silice (1,2 μm, 10 % de solides) dans 1 mL d’acétone, soniquer pendant 30 s, vortex brièvement et centrifuger pendant 2 min à 19 000 x g.
   2. Retirer le surnageant, remettre en suspension dans 1 mL d’acétone et répéter le lavage. Resuspendre dans 1 mL de 50 mM PB, laver 2 fois. Enfin, remettre en suspension dans 100 μL de 50 mM PB.
   3. Effectuez l’étalonnage des pinces optiques avec des billes de silice en collant une lame de couverture sur une lame de microscope avec un ruban adhésif double face (environ 60 μm d’épaisseur) pour construire une chambre d’écoulement. Remplissez la chambre avec un BSA (protéine d’albumine sérique bovine) de 1 mg/mL et attendez 3 min.
   4. Écouler une dilution 1:1000 de billes de silice dans PB dans la chambre. Utilisez une seringue remplie de graisse de silicone pour sceller soigneusement la chambre. Pièger un seul cordon dans chaque piège et appliquer la méthode du spectre de puissance¹⁴ pour les étalonner.
   5. Préparer les billes de silice dans de l’acétate de pentyle (à température ambiante) en dissolvant 20 μL de billes de silice (1,2 μm de diamètre, 10 % solide) dans 1-1,5 mL d’acétone, de vortex et de sonicate pendant 30 s.
   6. Centrifuger à 18 500 x g pendant 2 min. Jeter le surnageant et remettre en suspension dans 1 mL d’acétone, puis répéter le lavage. Resuspendre dans 1 mL d’acétate de pentyle et répéter le lavage (centrifugeuse et remise en suspension) dans l’acétate de pentyle 2 fois. Remettez la pastille en suspension dans 100 μL de nitrocellulose à 1 % et 900 μL d’acétate de pentyle. Conserver à 4 °C pendant 2 mois.
   7. Prenez un couvercle en verre de 24 x 24 mm et nettoyez-le soigneusement avec du papier imbibé d’éthanol pur. Ensuite, tout en le tenant avec une pince à épiler propre, rincez-le une deuxième fois en le lavant directement avec de l’éthanol pur. Laissez-le sécher sous un léger flux d’azote. Si nécessaire, répétez cette opération pour éliminer tous les résidus visibles sur la surface du verre.
   8. Prenez le stock de billes de silice, tourbillonnez-le et sonicez-le brièvement pendant ~30 s.
   9. Après avoir nettoyé une deuxième lamelle de couverture (24 x 60 mm), utilisez-la pour étaler 2 μL de solution de billes de silice sur une surface de la lamelle de couverture et attendez qu’elle sèche.
   10. Nettoyez soigneusement une lame de microscope (26 x 76 mm) qui sera utilisée pour créer la chambre d’écoulement.
   11. Découpez deux lignes de ruban adhésif double (~3 mm de large, 60-100 μm d’épaisseur) et fixez-les sur un côté de la lame de microscope, comme illustré à la figure 3.
   12. À l’aide d’une pince à épiler propre, fermer la chambre (volume final d’environ 20 μL) en mettant la couche de recouvrement (1.3.9) en contact avec les lignes de ruban adhésif, la couche nitrocellulose + billes faisant face à l’intérieur de la chambre, comme le montre la figure 3a. Remplissez la chambre d’écoulement avec un tampon phosphate de 50 mM et scellez-la avec de la graisse de silicium.
   13. Imagez une seule bille de silice en microscopie à fond clair à un grossissement de >200x à l’aide d’un dispositif à couplage de charge (CCD) ou d’une caméra complémentaire à semi-conducteur à oxyde métallique (CMOS) de >1,4 mégapixels. Utilisez un logiciel de rétroaction pour déplacer l’étage piézoélectrique (avec une précision nanométrique ou supérieure) afin de compenser les dérives thermiques¹⁰.
   14. Chevauchez le centre du piège gauche avec le centre du cordon (les niveaux de signal x-y du QPD doivent correspondre à ceux de l’étalonnage). Mesurez ensuite le bruit de position et l’écart-type des signaux de position pour ce piège.
   15. Répétez l’étape précédente pour le piège droit¹⁵.
4. Calibrage de la position du piège : MHz à nm
   1. Préparer une chambre d’écoulement avec des billes de silice fixées sur la surface de la lamelle de couverture (1.3.5-1.3.12) et des billes flottantes de polystyrène (utiliser des billes conjuguées à la α-actinine préparées comme dans la section suivante 2.1).
   2. Concentrez une bille de silice sur la surface de la lamelle de couverture légèrement décentrée (~5 μm) du centre du champ de vision (FOV) et obtenez une image du FOV. Déplacez la perle de 10 μm vers le centre de champ de vision à l’aide de l’étage piézoélectrique et obtenez une deuxième image. Calculez le centre de la perle dans les deux images à l’aide d’un algorithme centroïde ou similaire et calculez la distance en pixels entre les deux perles pour obtenir l’étalonnage nm/pixel de la caméra en fond clair.
   3. Piège une seule particule flottante dans un piège. Ensuite, déplacez le piège à l’aide de l’AOD par petites étapes (0,2 MHz) et obtenez une image de la particule et la fréquence correspondante de l’AOD pour chaque étape. Calculez la position de la particule dans le champ de vision en utilisant l’algorithme centroïde comme précédemment et convertissez-la en nm en utilisant l’étalonnage nm/pixel obtenu à l’étape précédente.
   4. Effectuez un ajustement linéaire des données de position en fréquence et calculez la constante d’étalonnage en nm/MHz.
   5. Répéter l’étalonnage pour le deuxième piège
5. Calibrage de la puissance et de la rigidité du piège (MHz vs W), QPD (MHz vs pN/nm)
   1. Préparer une chambre d’écoulement avec des billes de silice fixées sur la surface de la lamelle de couverture (1.3.5-1.3.12) et des billes flottantes de polystyrène (utiliser des billes conjuguées à la α-actinine préparées comme dans la section suivante 2.1) et piéger une seule particule dans un piège. Ensuite, déplacez les deux pièges à travers les AOD par petites étapes (0,2 MHz) et enregistrez un mouvement brownien de la particule dans les deux pièges avec QPD et la fréquence correspondante des AOD.
   2. Calculer une puissance moyenne sur les détecteurs à chaque position et obtenir la rigidité du piège et la constante d’étalonnage QPD bêta en ajustant une fonction lorentzienne à un spectre de puissance du mouvement brownien enregistré¹³.

2. Préparation des échantillons

1. Préparer des billes fluorescentes conjuguées à la α-actinine
   1. Effectuer la conjugaison¹⁶ : Prendre des billes de polystyrène amino-fonctionnalisées (1 μm de diamètre, 2,5 % de solides), les laver deux fois dans de l’eau distillée de 500 μL et les remettre en suspension dans 500 μL de PBS (pH 7,0). Ajouter 1 mM de ligand HaloTag ester de succinimidyl_O2 et incuber à température ambiante pendant 1 h. Laver trois fois avec 500 μL de PBS et remettre en suspension avec 100-200 μM HaloTag α-actinine. Incuber pendant 1 h à 37 °C et laver trois fois dans 500 μL de PBS (utiliser des billes dans les 1,5 semaine ou surgeler dans de l’azote liquide et conserver à −80 °C).
   2. Marquage : Incuber 200 μL de solution de billes avec de la rhodamine-BSA à une concentration finale de 5 μg/mL pendant 10 min. Laver trois fois avec 50 mM PB et remettre en suspension dans 500 μL de PB 50 mM. Celui-ci peut être conservé dans des aliquotes à - 80 °C pendant des mois).
2. Exprimer et purifier la myosine-5B biotinylée comme décrit précédemment ^4,17.
3. Polymériser et étiqueter F-actine¹³ :
   1. Polymérisation F-actine : Mélanger 69 μL d’eau ultrapure, 10 μL de tampon de polymérisation d’actine 10x (100 mM Tris HCl, 20 mM MgCl2, 500 mM KCl, 10 mM ATP, 50 mM de carbonate de guanidine pH_7,5), 20 μL de G-actine 10 mg/mL et 1 μL de DL-Dithiothréitol (DTT) 1 M. Laissez-le sur la glace pendant plus de 1 h.
   2. Marquage F-actine avec rhodamine (Ex/Em: 546/575 nm): Prendre 25 μL de F-actine polymérisée et ajouter 19,5 μL d’eau ultrapure, 2,5 μL de tampon de polymérisation d’actine 10x (100 mM Tris HCl, 20 mM MgCl 2, 500 mM KCl, 10 mM ATP, 50 mM de carbonate de guanidine pH 7,5), 1 μL de 1 M DTT et₂ μL de 250 μM de rhodamine phalloïdine. Laissez-le sur la glace pendant la nuit. Pour les expériences de piégeage, la rhodamine F-actine peut être stockée sur de la glace et utilisée dans un délai d’une semaine.
4. Exemple d’assemblage
   1. Prendre la chambre d’écoulement (1.3.5-1.3.12) et incuber 1 mg/mL de BSA biotinylé pendant 5 min. Après lavage avec un tampon AB (25 mM MOPS, 25 mM KCl, 4mM MgCl 2, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, pH_7,2), incuber 1 mg/mL de streptavidine pendant 5 min et laver à nouveau avec un tampon AB. Incuber la myosine-5B biotinylée de la méromyosine lourde à une concentration de 3 nM dans le tampon M5B (10 mM MOPS pH 7,3, 0,5 M NaCl, 0,1 mM EGTA, 3 mM_NaN3) avec 2 μM de calmoduline (CaM) pendant 5 min. Laver avec trois volumes de 1 mg/mL de BSA biotinylé complété par 2 μM CaM en AB et incuber pendant 3 min.
   2. Pendant l’incubation, préparer le mélange réactionnel (RM): billes fonctionnalisées à la α-actinine à 0,005% (section 2.1), 1 nM de rhodamine F-actine (section 2.3) dans un tampon d’imagerie (IB: tampon AB avec 1,2 μM de glucose-oxydase, 0,2 μM de catalase, 17 mM de glucose, 20 mM de DTT, 2 μM CaM et ATP à la concentration nécessaire à l’expérience).
   3. Laver avec RM et sceller la chambre avec de la graisse de silicone. L’échantillon est maintenant prêt à être observé au microscope.

3. Mesure

1. Assemblez l’haltère.
   1. Recherchez les billes flottantes de α-actinine en déplaçant l’échantillon à l’aide de traducteurs à longue portée, allumez un piège et piègez une perle.
   2. Une fois le premier piège occupé, déplacez le traducteur pour positionner le cordon piégé près de la surface de la glissière de couverture afin d’éviter le piégeage de plusieurs perles et piéger une autre perle dans le deuxième piège.
   3. Ajustez les deux pièges à des rigidités égales en ajustant la puissance des ondes acoustiques AODs. Les rigidités sont généralement fixées entre 0,03 et 0,14 pN/nm. Plus la rigidité est faible, plus le bruit de force est faible, en particulier à faible force.
   4. Retournez ensuite le miroir motorisé M (Figure 2) pour passer à la microscopie à fluorescence, et recherchez un filament d’actine flottant en solution en déplaçant l’échantillon à travers des traducteurs longue portée¹³. Préférez les filaments longs (>5 μm) car la myosine processive va la déplacer et la déplacer sur quelques microns avant de se détacher.
   5. Déplacez l’échantillon pour laisser l’une des billes piégées s’approcher d’une extrémité du filament jusqu’à ce qu’elles se fixent les unes aux autres. Ensuite, ajustez la distance des perles à la longueur approximative du filament et créez un écoulement dans la direction de la deuxième perle non liée en déplaçant la scène dans sa direction. Le filament sera étiré par l’écoulement et il finira par s’y lier¹³. Le complexe perle-actine-perle est appelé « haltère ».
2. Établir un contact actine-myosine.
   1. Séparez doucement les deux pièges loin l’un de l’autre pour pré-tendre le filament jusqu’à environ 3 pN et sonder la rigidité de l’haltère en faisant osciller un piège dans une onde triangulaire en changeant la fréquence de l’un des deux AOD et en vérifiant la transmission conséquente du mouvement à la perle de fuite par son signal de position.
   2. Déplacez la scène pour placer l’haltère à proximité d’une bille de silice sur piédestal et permettre le contact entre le filament et la protéine attachée à la surface de la bille en ajustant la hauteur des centres de billes piégées légèrement en dessous du diamètre de la bille de silice. Placez ensuite le centre de la bille de silice entre les billes piégées.
3. Pince de force et retour de stabilisation nm :
   1. Allumez la pince de force ultrarapide avec une force de 2-3 pN et une oscillation de 200 nm et balayez le cordon du piédestal par pas discrets d’environ 20-30 nm dans la direction perpendiculaire au filament d’actine. Attendez que les interactions se produisent à chaque position (quelques secondes), puis avancez si aucune interaction n’est observée. Au fur et à mesure que l’interaction protéine-filament est établie, recherchez la position où les interactions sont plus fréquentes.
   2. Assurez-vous que lorsque la myosine processive se déplace vers une extrémité du filament d’actine (généralement l’extrémité +), la bille piégée attachée à l’extrémité + se déplace vers la bille de silice. Déplacez l’étape vers l’extrémité du filament de sorte que la bille de silice se trouve aussi près que possible de la bille piégée attachée à l’extrémité du filament lorsque la myosine n’est pas liée et démarrez la rétroaction de stabilisation nanométrique. Ce faisant, la probabilité que la bille piégée attachée à l’extrémité + du filament s’écrase dans la bille de silice est minimisée.
4. Enregistrer les données.

4. Analyse des données⁴

REMARQUE: La méthode d’analyse décrite permet la détection et la mesure des cycles processifs et des événements de pas rapides en fonction des changements de vitesse de l’haltère, causés par le pas de myosine. L’analyse des cycles de procédé est effectuée sur la base d’une méthode d’analyse de données pour les moteurs non transformés décrite dans les références ^3,4,13.

1. Définissez un seuil pour les changements de vitesse afin de permettre la détection d’événements pas à pas. Étant donné que, dans ce cas, des pas en avant et en arrière sont attendus, le franchissement du seuil est accepté dans les deux sens.
2. Assignez chaque pas à l’exécution correspondante : si l’intervalle de temps entre deux pas consécutifs est inférieur à 3 ms et que l’amplitude des pas est < 90 nm, les pas sont affectés à la même exécution, sinon les pas sont affectés à des exécutions différentes⁴.
3. Durée d’exécution correcte pour les forces d’assistance⁴.
   1. Corrigez les longueurs d’exécution sous les forces d’assistance en calculant la valeur réelle de longueur d’exécution RL à partir de la valeur de longueur moyenne mesurée <RL_m> à partir de l’équation suivante, où D est la plage d’oscillation:
      
      REMARQUE : Des détails sur la dérivation de cette équation se trouvent à la référence⁴.

Résultats

Les données représentatives consistent en des enregistrements de position au fil du temps, comme le montre la figure 4. Dans l’enregistrement de position, deux types de déplacement sont visibles. Tout d’abord, lorsque le moteur de myosine n’interagit pas avec le filament d’actine, les billes piégées se déplacent à vitesse constante contre la force de traînée visqueuse de la solution montrant un déplacement linéaire oscillant dans la plage d’oscillation définie par l’o...

Discussion

Bien que les techniques à molécule unique, telles que le test à trois billes, soient techniquement difficiles et à faible débit, UFFCS améliore la détection des interactions moléculaires grâce au rapport signal sur bruit élevé des données. UFFCS permet l’étude de la dépendance à la charge des protéines motrices, avec les principaux avantages d’appliquer la force très rapidement lors de la liaison du moteur au filament pour sonder les événements précoces et très rapides dans la production de force...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aliphatic Amine Latex Beads	ThermoFisher	A37362	1.0-μm diameter, 2% (w/v)
Acetone	Sigma	32201
Actin polymerization buffer	Cytoskeleton	BSA02	10X
AODs (acousto-optic deflectors)	AA Opto Electronic	DTS-XY 250	Laser beam deflectors
ATP	Sigma	A7699
Biotinylated-BSA	ThermoFisher	29130
BSA	Sigma	B4287
Calmodulin from porcine brain (CaM)	Merck Millipore	208783
Catalase from bovine liver	Sigma	C40
Condenser	Olympus	OlympusU-AAC, Aplanat, Achromat	NA 1.4, oil immersion
Creatine phosphate disodium salt tetrahydrate	Sigma	27920
Creatine Phosphokinase from rabbit muscle	Sigma	C3755
DDs	AA Opto Electronic	AA.DDS.XX	Two-channel digital synthesizer
DL-Dithiothreitol (DTT)/td>	Sigma	43819
EGTA	Sigma	E4378
G-actin protein	Cytoskeleton	AKL99
Glucose	Sigma	G7528
Glucose Oxidase from Aspergillus niger	Sigma	G7141
HaloTag succinimidyl ester O2 ligand	Promega	P1691
High vacuum silicone grease heavy	Merck Millipore	107921
KCl	Sigma	P9541
KH2PO4/K2HPO4	Sigma	P5379/ P8281
Labview	National Instruments	version 8.1	Data acquisition
Labview FPGA module	National Instruments	version 8.1	Fast Force-Clamp
Matlab	MathWorks	2016	Data analysis
MgCl2	Fluka	63020
Microscope Objective	Nikon	Plan-Apo 60X	NA 1.2, WD 0.2 mm, water imm.
MOPS	Sigma	M1254
Nitrocellulose	Sigma	N8267	0.45 pore size
Pentyl acetate solution	Sigma	46022
Pure Ethanol	Sigma	2860
QPDs	UDT	DLS-20	D Position Detecto
Rhodamine BSA	Molecular Probes	A23016
Rhodamine Phalloidin	Sigma	P1951
Silica beads	Bangslabs	SS04N	1.21 mm, 10% solids
Sodium azide	Sigma	S2002
Streptavidin protein	Sigma	189730