用于低肿瘤含量组织中肿瘤富集的自动解剖方案

摘要

具有自动组织解剖的数字注释为低肿瘤含量病例中的肿瘤富集提供了一种创新方法，并且适用于石蜡和冷冻组织类型。所描述的工作流程提高了准确性，可重复性和通量，可应用于研究和临床环境。

摘要

低肿瘤含量组织中的肿瘤富集（根据方法而定，肿瘤含量低于20%的组织）需要通过许多下游测定（例如下一代测序）可重复地生成高质量数据。自动组织解剖是一种新方法，通过使用数字图像注释叠加在未染色的载玻片上，减少传统宏观解剖的用户依赖性不精确性以及激光捕获显微切割的时间、成本和专业知识限制，自动化并改善这些常见的低肿瘤含量组织中的肿瘤富集。在这里，数字苏木精和曙红（H&E）注释用于靶向小肿瘤区域，使用直径为250μm² 的刀片在未染色的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）或厚度高达20μm的新鲜冷冻切片中，用于在核酸提取和全外显子组测序（WES）之前自动富集肿瘤。自动解剖可以从单个或多个切片中收获低肿瘤含量组织中的注释区域，以进行核酸提取。它还允许捕获广泛的收获前和收获后收集指标，同时提高准确性，再现性，并通过利用更少的载玻片来提高通量。所描述的方案能够对动物和/或人类FFPE或肿瘤含量低的新鲜冷冻组织进行自动解剖的数字注释，并且还可用于任何感兴趣的区域富集，以提高临床或研究工作流程中下游测序应用的充分性。

引言

下一代测序（NGS）越来越多地用于患者护理和癌症研究，以帮助指导治疗和促进科学发现。组织通常受到限制，常规使用肿瘤含量可变的小标本。因此，肿瘤的充分性和完整性仍然是获得有意义数据的障碍。肿瘤百分比较低的样本可能导致难以区分真变异和测序伪影，并且通常不符合NGS¹的资格。低肿瘤含量病例（低于20%）的肿瘤富集已被证明有助于产生足够的材料，以产生可重复的测序数据并确保低频变异不被遗漏^2，3。但是，限制将根据所使用的平台和计划使用生成的数据而有所不同。

传统上，通过福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）载玻片的手动宏观解剖或激光捕获显微解剖（LCM）进行用于提取的肿瘤区域富集。手动宏观切割或从载玻片中刮除指定组织区域，允许以相对较低的成本去除肿瘤区域以用于下游测定，但准确性低，^{精度低2，4}。对于存在大片肿瘤和/或最小组织损失不会显着影响结果的肿瘤含量较高的病例，最小的技术准确性可能非常有效，但是低肿瘤含量病例或肿瘤更分散的病例需要更高的精确度。因此，LCM是在20世纪90年代发明的，并成为从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）载玻片⁵，⁶，⁷，⁸中精确去除组织的小^的，定义的微观区域的宝贵方法。当样品存在复杂的异质性9时，LCM可用于收集单细胞群^，从而允许收集以前难以分离的细胞群。然而，LCM需要昂贵的机械，需要广泛的技术专长和动手时间^{10，11，12，13，14}。

用于自动组织解剖的仪器的精度介于LCM（~10 μm）和宏观解剖（~1 mm）^之间15。此外，它表现出大等离子切割和LCM之间的成本和技术专业知识要求，旨在从序贯FFPE载玻片中进行快速组织富集，以减轻先前方法的缺点¹⁵。以这种方式自动解剖利用数字注释或台上载玻片参考图像叠加到连续切片的未染色组织载玻片上，以解剖和丰富感兴趣的区域。该仪器使用塑料纺丝刀片铣削尖端，1.5 mL收集管，可与许多不同的流体一起使用进行解剖，以收集感兴趣的区域以进行下游测定，包括核提取和测序。所述纺丝塑料碾磨尖端利用注射器桶内和外贮存器和柱塞来收集缓冲液，然后碾磨并收集组织¹⁶。可变的铣刀头尺寸直径（250 μm，525 μm，725 μm）可以解剖单独的组织区域进行比较，可以合并的多焦点区域或来自单个或多个FFPE载玻片的单个小区域。用于收获的切片厚度可以根据个人实验需求进行调整，用户可以通过在用于收获的最后一个切片之后立即对一个连续切片进行额外的H&E来确保感兴趣的区域没有被耗尽。

自动解剖被确定为在低肿瘤含量病例中富集肿瘤含量的一种方式，我们测试并扩展了自动组织解剖仪器的预期功能，该仪器目前销售用于厚度高达10μm的FFPE临床标本。该研究表明，自动解剖可以应用于FFPE和厚度达20μm的新鲜冷冻人或动物组织切片，用于研究目的。该协议还展示了一种在肿瘤含量低的组织和/或具有嵌套，分散肿瘤的病例中以数字方式注释和自动解剖以肿瘤富集的方法，在这些病例中，有意义的大切剖具有挑战性或不可行，并显示足以用于NGS的核酸的质量和产量。因此，自动解剖可以为肿瘤富集提供中级精度和更高的通量，也可以应用于丰富其他感兴趣的区域，或与其他平台结合使用以回答研究或临床问题。

研究方案

在开始之前，根据机构审查委员会 （IRB） 协议获取适当的组织标本。此处描述的所有方法均已获得基因泰克公司的机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 组织和载玻片制备

1. 选择FFPE或新鲜冷冻组织块，并利用下面的相应处理方法。
2. 将组织块切片切割到带正电的载玻片上，厚度为所需厚度。在条带中连续切片FFPE组织，第一个参考切片以适合H&E染色的厚度（即4μm）切割，然后根据需要和组织可用性以4-20μm的厚度切割1-4个切片。将组织切片收集到带正电的玻璃显微镜载玻片上。
   注意:新鲜的冷冻参比组织切片应立即用苏木精和曙红（H&E）染色，使用常规方案冷冻切片和未染色的冷冻切片保持在-20°C，直到收获需要它们。
3. 让所有FFPE切片在室温下干燥过夜。
4. 将FFPE参考载玻片在60°C下烘烤30分钟，然后使用常规方案用H&E染色。
5. 以20倍或更大的放大倍率扫描整个载玻片成像仪上的H&E染色载玻片。
6. 使用供应商提供的查看平台或开源查看器为感兴趣的肿瘤区域的扫描载玻片图像添加注释。将这些批注导出为低放大倍率屏幕截图，或将其另存为包含与多边形顶点对应的 X-Y 像素坐标的元数据文件。
   注意:前者在技术上不太具有挑战性，但后者在过程自动化方面具有优势。
7. 根据使用的方法创建带注释的感兴趣区域的数字掩码，并导出手动注释。
   注意:如果使用注释的屏幕截图/图像，则可以使用简单的图像处理软件来选择区域并填写整个选择。对每个 ROI 使用 X-Y 坐标需要使用编程语言来读取图像数据和多边形坐标，以创建填充感兴趣区域的低磁图像。用户应与自动解剖仪器供应商合作，根据其各自的软件可用性和需求建立流程。如果扫描、数字载玻片注释和/或数字掩模创建不可用，则可以使用标记执行仔细的载玻片注释，并将其用于代替数字掩码作为参考图像。用于创建数字掩码的伪代码已在 补充文件 1 中提供。

2. 自动组织解剖

1. 使用数字载玻片参考时，将未染色的样品组织载玻片放在载物台的第一至第四载玻片位置。使用载玻片上注释而不是数字选项时，将未染色的样品组织载玻片放在载物台的第二至第四载玻片位置，参考载玻片位于第一个位置。
2. 使用自动组织解剖软件创建铣削作业: 作业选择 > 创建新作业 > 案例 ID > 命名 铣削作业;转到 厚度 > 剖面厚度 使用向上或向下箭头标签;然后转到 "组织制备 > 石蜡化 或 脱蜡"、" 参考图像 > 从文件 > 导入图像 > 文件" ，以从下拉列表中作为数字参考导入（如果适用）。选择" 从舞台 "作为舞台幻灯片参考。字段完成后，通过选择右下角的" 扫描载物台"按钮扫描载物台 ，以捕获第一个到第四个位置的每个样品组织载玻片。
3. 选择要图像捕获的组织区域。
   1. 如果使用舞台参考，请将框从一个角拖动到相反的角，以在组织上创建矩形区域。选择矩形区域下方的圆形气泡以捕获舞台参考图像。如果使用数字参考图像，请将图像叠加在所选矩形区域上。在课程变焦中大幅调整数字参考的大小并对齐，以最好地匹配样品组织上的大小和位置。
   2. 通过选择参考图像右上角的复制选项，将此矩形字段复制到第二至第四张载玻片位置的剩余样品组织载玻片上。根据需要进行大对齐和调整大小。
      注意:使用幻灯片上的参考图像而不是数字蒙版时，请选择舞台上的哪张幻灯片应用作参考。
4. 对齐参考载玻片和样品载玻片
   1. 当参考图像在所有载玻片位置的组织样品载玻片上完全对齐时，选择屏幕右下角的" 扫描载物台 "按钮以进入微调步骤。选择第一个舞台位置和 "变换 "工具图标（右侧工具栏中的第三个图标）可对参照进行精细对齐和缩放调整，以最好地匹配示例幻灯片叠加。使用屏幕底部的 "参考示例 "滑动条在参考图像和示例图像之间切换，以及 "放大 "和 "缩小" 功能来调整和实现每个幻灯片位置的对齐。在第二至第四个样品载玻片位置复制此过程。
5. 选择感兴趣区域的铣削区域
   1. 一旦实现了四个载玻片位置中每个位置的最佳样品叠加，即可在蒙版参考图像的彩色部分使用 拾色器 工具图标（右侧工具栏中的第十个图标向下）绘制铣削路径名称。如果对多个载玻片或区域进行了注释以进行解剖，请选择" 扩展到相似"框，然后选择右下角 的"获取批注 "按钮，将铣削路径绘制到样品载玻片上。
   2. 在第一个滑块位置选取铣削路径。
      注: 在第一个滑块位置选择铣削路径时，该路径将被复制到剩余的滑块位置上，并计算铣削刀尖的使用情况。左上角的铣削刀尖使用情况是根据覆盖的面积和所选的刀尖尺寸计算的。如果计算的吸头超过四个，则可以选择更大的吸头尺寸来捕获带注释的 ROI。可以在屏幕左侧的"铣削尖端"箭头下选择或更改 刀尖 尺寸，并将重新计算刀尖使用情况。
   3. 计算铣削路径时，使用四个或更少的铣削尖端收集带注释的 ROI。选择屏幕右下角的 "设置阶段 "按钮，以提示从放置在舞台上正确指定的收集管中加载铣削尖端。
6. 用3.0 mL最适合组织类型（FFPE或新鲜冷冻）和下游核酸提取试剂盒需求的解剖缓冲液填充储液，然后选择屏幕右下角的解 剖 按钮。使用分子级矿物油或市售核酸提取试剂盒中的适当缓冲液。
   注意:然后开始自动解剖载玻片和选定的感兴趣区域，并由仪器收集样品。单元头将从载物台的背面拾取铣削尖端，并从储液罐中填充解剖液。然后，吸头沿着研磨路径旋转，从载玻片中抽吸样品组织，直到完全或充满。然后将带有解剖液的收集样品分配到位于载物台背面的收集管中。
7. 自动解剖完成后，从载物台上取出收集管和解剖样品载玻片，并分别将其放置在管架和载玻片架中。
   注意:新鲜冷冻收获应按照制造商的说明直接进行核酸提取，解剖后新鲜冷冻切片应立即使用常规方案进行H&E染色。
8. 在60°C下烘烤解剖后的组织载玻片30分钟，然后使用常规方案用H&E染色。
9. 以20倍放大和/或存档在整个载玻片成像仪上扫描解剖后的H&E染色载玻片，以获取未收集并保留在载玻片上的组织的参考。
   注意:有关其他扫描选项，请参阅上面的步骤 1.5。

3. 核酸提取

1. 将纸巾池和颗粒。使用市售试剂盒并按照制造商的说明进行核酸提取。

结果

选取含异种移植物转移性结直肠癌的FFPE和FF小鼠肝脏切片。对切片进行H&E染色（图1A，E，I），并以20倍放大倍率在整个载玻片成像仪上扫描。病理学家使用商业软件生成了数字注释的肿瘤感兴趣区域和掩模，并将其格式化为数字png参考图像（图1B，F，J）。将连续10μm和20μm厚的未染色样品载玻片放置在载物台上，并如上所述进?...

讨论

这里介绍的是一种方案，用于应用数字注释和自动解剖，以从低肿瘤含量FFPE或新鲜冷冻组织中解剖肿瘤区域，以进行肿瘤富集并在WES中使用。将数字注释和面罩创建与自动解剖相结合，可显著减少经典肿瘤富集方法（包括手动大切除和LCM）所需的动手时间和专业知识。该协议展示了一种潜在的重要的中程肿瘤富集选择，该选项不仅允许低肿瘤含量富集，而且在难以从肿瘤相邻的正常组织解剖分布...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent SureSelectXT	Agilent	G9611A
AVENIO Millisect Fill Station	Roche	8106533001
AVENIO Millisect Instrument, Base	Roche	8106568001
AVENIO Millisect Instrument, Head	Roche	8106550001
AVENIO Millisect Milling Tips Small	Roche	8106509001
AVENIO Millisect PC	Roche	8106495001
BioAnalyzer	Agilent	G2939BA
Eppendorf 5427R	Eppendorf	22620700	Micro-centrifuge
Incubation Buffer	Promega	D920D
Leica Autostainer XL	Leica	ST5010	Automated stainer
Molecular Grade Mineral Oil	Sigma	M5904-500ML
Proteinase K	Promega	V302B	Digestion buffer
Qiagen AllPrep DNA/RNA Mini Kit	Qiagen	80284
RLT Plus buffer	Qiagen	80204
Superfrost Plus positively charged microscope slides	Thermo Scientific	6776214