Düşük Tümör İçeriği Dokularında Tümör Zenginleştirme için Otomatik Diseksiyon Protokolü

Özet

Otomatik doku diseksiyonu ile dijital ek açıklama, düşük tümör içerikli vakalarda tümörü zenginleştirmek için yenilikçi bir yaklaşım sağlar ve hem parafin hem de dondurulmuş doku tiplerine uyarlanabilir. Açıklanan iş akışı doğruluğu, tekrarlanabilirliği ve verimi artırır ve hem araştırma hem de klinik ortamlara uygulanabilir.

Özet

Düşük tümör içerikli dokularda tümör zenginleştirme, yönteme bağlı olarak% 20 tümör içeriğinin altında olanlar, yeni nesil dizileme gibi birçok aşağı akış tahlili ile tekrarlanabilir şekilde kaliteli veriler üretmek için gereklidir. Otomatik doku diseksiyonu, lekesiz slaytlar üzerine dijital görüntü ek açıklama bindirmesi kullanarak geleneksel makro-diseksiyonun kullanıcıya bağlı kesinsizliğini ve lazer yakalama mikrodiseksiyonunun zaman, maliyet ve uzmanlık sınırlamalarını azaltarak bu yaygın, düşük tümör içerikli dokularda tümör zenginleştirmesini otomatikleştiren ve geliştiren yeni bir metodolojidir. Burada, dijital hematoksilin ve eozin (H & E) ek açıklamaları, nükleik asit ekstraksiyonu ve tüm ekzom dizilemesi (WES) öncesinde otomatik tümör zenginleştirmesi için boyanmamış formalin sabit parafin gömülü (FFPE) veya kalınlığı 20 μm'ye kadar taze dondurulmuş kesitlerde çapı 250^{μm olan} bir bıçak kullanarak küçük tümör alanlarını hedeflemek için kullanılır. Otomatik diseksiyon, düşük tümör içerikli dokulardaki açıklamalı bölgeleri, nükleik asit ekstraksiyonu için tek veya çoklu bölümlerden toplayabilir. Ayrıca, kapsamlı hasat öncesi ve sonrası toplama ölçümlerinin yakalanmasına olanak tanırken, doğruluğu, tekrarlanabilirliği iyileştirir ve daha az slayt kullanarak verimi artırır. Açıklanan protokol, hayvan ve / veya insan FFPE'si veya düşük tümör içeriğine sahip taze dondurulmuş dokular üzerinde otomatik diseksiyon ile dijital ek açıklama sağlar ve ayrıca klinik veya araştırma iş akışlarında aşağı akış dizileme uygulamaları için yeterliliği artırmak için herhangi bir ilgi alanı zenginleştirme için kullanılabilir.

Giriş

Yeni nesil dizileme (NGS), tedavileri yönlendirmeye ve bilimsel keşfi kolaylaştırmaya yardımcı olmak için hem hasta bakımı hem de kanser araştırmalarında giderek daha fazla kullanılmaktadır. Doku genellikle sınırlıdır ve değişken tümör içeriğine sahip küçük örnekler rutin olarak kullanılır. Bu nedenle, tümör yeterliliği ve bütünlüğü, anlamlı veriler elde etmenin önünde bir engel olmaya devam etmektedir. Daha düşük tümör yüzdelerine sahip örnekler, gerçek varyantları dizileme artefaktlarından ayırt etmede zorluğa neden olabilir ve genellikle NGS 1 için uygun^değildir. Düşük tümör içerikli vakaların tümör zenginleştirilmesinin, %20'nin altındakilerin, tekrarlanabilir dizileme verileri üretmek ve düşük frekanslı varyantların kaçırılmamasını sağlamak için yeterli materyal elde edilmesine yardımcı olduğu gösterilmiştir ^2,3. Bununla birlikte, sınırlar kullanılan platformlara ve üretilen verilerin planlanan kullanımına bağlı olarak değişecektir.

Geleneksel olarak, ekstraksiyon için tümör bölgelerinin zenginleştirilmesi, formalin sabit parafin gömülü (FFPE) slaytların manuel makrodiseksiyonu veya lazer yakalama mikrodiseksiyonu (LCM) ile gerçekleştirilir. Manuel makrodiseksiyon veya slaytlardan belirli doku alanlarının kazınması, tümör bölgelerinin aşağı akış tahlillerinde kullanılmak üzere nispeten düşük maliyetli, ancak düşük doğruluk ve düşük hassasiyetle çıkarılmasına izin verir ^2,4. Minimal teknik doğruluk, büyük tümör alanlarının bulunduğu ve / veya minimal doku kaybının sonuçları önemli ölçüde etkilemediği daha yüksek tümör içerikli vakalarda çok etkili olabilir, ancak düşük tümör içerikli vakalar veya daha dağınık tümörlü vakalar daha fazla hassasiyet gerektirir. LCM bu nedenle 1990'larda icat edildi ve formalin sabit parafin gömülü (FFPE) slaytlar 5,6,7,8'den dokunun küçük, tanımlanmış^, mikroskobik bölgelerini hassas bir şekilde çıkarmak için değerli bir yol haline geldi. LCM, numunenin karmaşık heterojenliği mevcut olduğunda tek hücreli popülasyonları toplamak için kullanılabilir^9, daha önce ayrılması zor hücre popülasyonlarının toplanmasına izin verir. Ancak LCM, kapsamlı teknik uzmanlık ve uygulamalı zaman gerektiren maliyetli makineler gerektirir^{10,11,12,13,14}.

Otomatik doku diseksiyonu için kullanılan cihaz, LCM (~10 μm) ile makrodiseksiyonlar (~1 mm)¹⁵ arasında hassasiyete sahiptir. Ek olarak, makrodiseksiyon ve LCM arasında hem maliyet hem de teknik uzmanlık gereksinimleri sergiler ve önceki yöntemlerin dezavantajlarını hafifletmek için sıralı FFPE slaytlarından hızlı doku zenginleştirme gerçekleştirmek üzere tasarlanmıştır¹⁵. Bu şekilde otomatik diseksiyon, ilgilenilen bölgeleri diseke etmek ve zenginleştirmek için seri olarak kesitlenmiş lekesiz doku slaytları üzerine dijital ek açıklamalar veya sahnede slayt referans görüntüsü kaplamaları kullanır. Cihaz, plastik eğirme bıçağı frezeleme uçları, 1,5 mL toplama boruları kullanır ve nükleik ekstraksiyon ve dizileme dahil olmak üzere aşağı akış analizleri için ilgi çekici bölgeleri toplamak üzere diseksiyon için bir dizi farklı sıvı ile birlikte kullanılabilir. İplik plastik frezeleme ucu, tampon toplamak için iç ve dış şırınga namlu rezervuarları ve bir piston kullanır, ardından doku^16'yı frezeler ve toplar. Değişken frezeleme ucu boyutu çapı (250 μm, 525 μm, 725 μm), karşılaştırma için ayrı doku alanlarının, havuzlanabilen çok odaklı bölgelerin veya tek veya çoklu FFPE kızaklarından ayrı küçük alanların diseksiyonuna izin verebilir. Hasat için kullanılan kesit kalınlıkları, bireysel deney ihtiyaçlarına göre ayarlanabilir ve kullanıcılar, hasat için kullanılan son bölümden hemen sonra bir seri bölüm üzerinde ek bir H&E gerçekleştirerek ilgili bölgelerin tükenmemesini sağlayabilir.

Otomatik diseksiyon, düşük tümör içerikli vakalarda tümör içeriğini zenginleştirmenin bir yolu olarak tanımlandı ve şu anda 10 μm kalınlığa kadar FFPE klinik örneklerinde kullanılmak üzere pazarlanan otomatik bir doku diseksiyon cihazının amaçlanan işlevselliğini test ettik ve genişlettik. Çalışma, otomatik diseksiyonun araştırma amacıyla hem FFPE hem de taze dondurulmuş insan veya hayvan dokusu kesitlerine 20 μm kalınlığa kadar uygulanabileceğini göstermektedir. Protokol ayrıca, düşük tümör içeriğine sahip dokularda ve / veya anlamlı makrodiseksiyonun zor olduğu veya mümkün olmadığı iç içe geçmiş, dağınık tümörlü vakalarda tümör zenginleştirme için diseksiyonu dijital olarak açıklama ekleme ve otomatikleştirme yaklaşımını göstermektedir ve NGS için yeterli nükleik asidin hem kalitesini hem de verimini göstermektedir. Bu nedenle otomatik diseksiyon, tümör zenginleştirme için orta düzeyde hassasiyet ve daha fazla verim sağlayabilir ve ayrıca diğer ilgi alanlarını zenginleştirmek için uygulanabilir veya araştırma veya klinik soruları cevaplamak için diğer platformlarla birleştirilebilir.

Protokol

Başlamadan önce, Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) protokollerine göre uygun doku örnekleri alın. Burada açıklanan tüm yöntemler, Genentech, Inc.'in Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. Doku ve slayt hazırlama

1. FFPE veya taze dondurulmuş doku bloklarını seçin ve aşağıdaki ilgili işleme yöntemini kullanın.
2. Doku bloğu bölümlerini pozitif yüklü cam slaytlar üzerine istenen kalınlıkta kesin. FFPE dokusunu şeritler halinde seri olarak kesitleyin, ilk referans kesit H&E boyama için uygun bir kalınlıkta (yani 4 μm) kesilir, ardından ihtiyaca ve doku mevcudiyetine bağlı olarak 4-20 μm arasında değişen kalınlıkta 1-4 bölüm yapılır. Doku kesitlerini pozitif yüklü cam mikroskop slaytları üzerine toplayın.
   NOT: Taze dondurulmuş referans doku kesitleri, dondurulmuş kesitler için rutin protokoller kullanılarak derhal Hematoksilin ve Eozin (H&E) ile boyanmalı ve lekesiz dondurulmuş kesitler hasat için gerekli olana kadar -20 °C'de tutulmalıdır.
3. Tüm FFPE bölümlerinin gece boyunca oda sıcaklığında kurumasını bekleyin.
4. FFPE referans slaytlarını 60 °C'de 30 dakika pişirin ve ardından rutin protokolleri kullanarak H&E ile lekeleyin.
5. H&E lekeli slaytları tüm slayt görüntüleyicide 20x veya daha yüksek büyütme ile tarayın.
6. Satıcı tarafından sağlanan görüntüleme platformunu veya açık kaynaklı görüntüleyiciyi kullanarak taranan slayt görüntülerine ilgi çekici tümör bölgeleri için açıklama ekleyin. Bu ek açıklamaları düşük büyütmeli bir ekran görüntüsü olarak dışa aktarın veya çokgen köşelerine karşılık gelen X-Y piksel koordinatlarını içeren bir meta veri dosyası olarak kaydedin.
   NOT: İlki ile çalışmak teknik olarak daha az zordur, ancak ikincisi proses otomasyonunda avantajlar sunar.
7. Kullanılan yaklaşım doğrultusunda ilgili ek açıklamalı bölgelerin dijital maskelerini oluşturun ve manuel ek açıklamaları dışa aktarın.
   NOT: Ek açıklamaların ekran görüntüsü/görüntüsü kullanılıyorsa, bir bölge seçmek ve tüm seçimi doldurmak için basit bir görüntü işleme yazılımı kullanılabilir. Her yatırım getirisi için X-Y koordinatlarının kullanılması, ilgi çekici bölgelerle doldurulmuş düşük mag'lı bir görüntü oluşturmak için hem görüntü verilerini hem de çokgen koordinatlarını okumak için bir programlama dilinin kullanılmasını gerektirir. Kullanıcı, bireysel yazılım kullanılabilirliğine ve ihtiyaçlarına göre bir süreç oluşturmak için otomatik diseksiyon cihazı satıcısıyla birlikte çalışmalıdır. Tarama, dijital slayt ek açıklaması ve/veya dijital maske oluşturma kullanılamıyorsa, bir işaretleyici kullanılarak slayt üzerinde dikkatli bir ek açıklama gerçekleştirilebilir ve referans görüntü olarak dijital maske yerine kullanılabilir. Dijital maske oluşturma için sözde kod Ek Dosya 1'de sağlanmıştır.

2. Otomatik doku diseksiyonu

1. Dijital slayt referansını kullanırken lekesiz numune dokusu slaytlarını birinci ila dördüncü slayt konumlarında sahneye yerleştirin. Dijital bir seçenek yerine slayt üzerinde ek açıklama kullanırken, lekesiz numune dokusu slaytlarını ikinci ila dördüncü slayt konumlarında sahneye yerleştirin ve birinci konumda bir referans slayt kullanın.
2. Otomatik doku diseksiyon yazılımını kullanarak frezeleme işi oluşturma: İş Seçimi > Yeni İş > Vaka Kimliği Oluşturma > Frezeleme işini adlandırın; yukarı veya aşağı ok sekmesini kullanarak Kalınlık > Bölüm Kalınlığı'na gidin; daha sonra Doku Hazırlama > Parafinize veya Deparafinize, Referans Görüntü > Dosyadan > Görüntüyü İçe Aktar > Dosyası açılır menüden varsa dijital referans olarak içe aktarmak için gidin. Sahne alanında slayt başvurusu için Sahne Alanından'ı seçin. Alanlar tamamlandığında, her örnek doku slaytını birinci ila dördüncü konumda yakalamak için sağ alt köşedeki Tara Aşaması düğmesini seçerek sahne alanını tarayın.
3. Görüntü yakalama için doku alanını seçin.
   1. Sahne alanında bir referans kullanıyorsanız, doku üzerinde dikdörtgen bir alan oluşturmak için kutuyu bir köşeden diğerine sürükleyin. Sahne alanı referans görüntüsünü yakalamak için dikdörtgen alanın altındaki dairesel kabarcığı seçin. Dijital referans görüntüsü kullanıyorsanız, görüntüyü seçilen dikdörtgen alanın üzerine yerleştirin. Kurs yakınlaştırmasında dijital referansı yeniden boyutlandırın ve örnek doku üzerindeki konuma en iyi şekilde uyacak şekilde hizalayın.
   2. Bu dikdörtgen alanı, referans görüntünün sağ üst köşesindeki kopyala seçeneğini belirleyerek ikinci ila dördüncü slayt konumlarında kalan örnek doku slaytlarına kopyalayın. Gerektiğinde büyük ölçüde hizalayın ve yeniden boyutlandırın.
      NOT: Dijital maske yerine slayt üzerinde referans görüntüsü kullanırken, sahne alanında referans olarak hangi slaydın kullanılması gerektiğini seçin.
4. Referans ve örnek slaytları hizalama
   1. Referans görüntü tüm slayt konumlarındaki doku örneği slaytlarında büyük ölçüde hizalandığında, ince ayar adımına geçmek için ekranın sağ alt köşesindeki Tara Aşaması düğmesini seçin. Örnek slayt kaplamasıyla en iyi şekilde eşleşecek şekilde referansın ince hizalamasını ve yakınlaştırma ayarlarını yapmak için ilk aşama konumunu ve Dönüştürme aracı simgesini (sağ araç çubuğundaki üçüncü simge) seçin. Her slayt konumunun hizalanmasını ayarlamak ve elde etmek için ekranın altındaki Örneğe Referans kaydırma çubuğunu, referans görüntü ile örnek görüntü arasında geçiş yapan Yakınlaştırma ve Uzaklaştırma özelliğiyle birlikte kullanın. Bu işlemi ikinci ila dördüncü örnek slayt konumlarında çoğaltın.
5. İlgilenilen bölgenin frezeleme alanını seçin
   1. Dört slayt konumunun her birinin optimum örnek kaplaması elde edildikten sonra, maskelenmiş referans görüntüsünün renkli kısmına Renk Seçici takım simgesini (sağ araç çubuğundaki onuncu simge) kullanarak frezeleme yolu atamaları çizin. Birden çok slayta veya alana diseksiyon için açıklama eklenmişse Benzer Alana Genişlet kutusunu seçin ve ardından örnek slaytlara frezeleme yolları çizmek için sağ alttaki Ek Açıklamaları Al düğmesini seçin.
   2. İlk kızak konumunda frezeleme yolunu seçin.
      NOT: Frezeleme yolu ilk kızak konumunda seçildiğinde, kalan kızak konumlarına kopyalanır ve frezeleme ucu kullanımı hesaplanır. Sol üst köşedeki frezeleme ucu kullanımı, kaplanan alana ve seçilen uç boyutuna göre hesaplanır. Dörtten fazla uç hesaplanırsa, ek açıklamalı YG'yi yakalamak için daha büyük bir uç boyutu seçilebilir. Uç boyutu, Freze Ucu oku altında ekranın sol tarafında seçilebilir veya değiştirilebilir ve uç kullanımı yeniden hesaplanır.
   3. Frezeleme yolu hesaplandığında, açıklamalı yatırım getirisini dört veya daha az frezeleme ucu ile toplayın. Ekranın sağ alt köşesindeki Kurulum Aşaması düğmesini seçerek frezeleme uçlarının yerleştirilen toplama borularından sahneye doğru şekilde yerleştirilmesini isteyin.
6. Rezervuarı, doku tipine (FFPE veya taze dondurulmuş) ve aşağı akış nükleik asit ekstraksiyon kiti ihtiyaçlarına en uygun 3,0 mL diseksiyon tamponu ile doldurun ve ekranın sağ alt köşesindeki Disseksiyon düğmesini seçin. Moleküler sınıf mineral yağ veya piyasada satılan nükleik asit ekstraksiyon kitlerinden uygun bir tampon kullanın.
   NOT: Slaytların ve seçilen ilgi alanlarının otomatik diseksiyonu başlar ve numuneler cihaz tarafından toplanır. Ünite kafası, sahnenin arkasından frezeleme uçlarını alacak ve rezervuardan diseksiyon sıvısı ile dolduracaktır. Uçlar daha sonra numune dokusunu slaytlardan tam veya dolu olana kadar aspire eden frezeleme yolu boyunca döner. Diseksiyon sıvısı ile toplanan numune daha sonra sahnenin arkasında bulunan toplama tüplerine dağıtılır.
7. Otomatik diseksiyon tamamlandığında, toplama tüplerini ve disseke edilmiş numune slaytlarını sahneden çıkarın ve sırasıyla bir tüp rafına ve sürgü rafına yerleştirin.
   NOT: Taze dondurulmuş hasatlar, üreticinin talimatlarına göre doğrudan nükleik asit ekstraksiyonuna alınmalı ve diseksiyon sonrası taze dondurulmuş bölümler, dondurulmuş bölümler için rutin protokoller kullanılarak derhal H & E boyanmalıdır.
8. Diseke sonrası doku slaytlarını 60 °C'de 30 dakika pişirin ve ardından rutin protokolleri kullanarak H&E ile lekeleyin.
9. Gönderi diseke edilmiş H&E lekeli slaytları 20x büyütme ve/veya arşivleme ile tüm slayt görüntüleyici üzerinde tarayın ve hangi dokunun toplanmadığına ve slaytta kaldığına dair bir referans alın.
   NOT: Alternatif tarama seçenekleri için yukarıdaki adım 1.5'e bakın.

3. Nükleik asit ekstraksiyonu

1. Dokuyu havuzlayın ve toplayın. Nükleik asit ekstraksiyonunu ticari olarak temin edilebilen bir kit kullanarak ve üreticinin talimatlarını izleyerek gerçekleştirin.

Sonuçlar

Ksenogreftlerde metastatik kolorektal kanser içeren FFPE ve FF fare karaciğer kesitleri seçildi. Kesitler H&E boyalıydı (Şekil 1A, E,I) ve 20x büyütmede bütün bir slayt görüntüleyicide tarandı. Bir patolog, ilgilenilen tümör bölgelerine dijital olarak açıklama ekledi ve ticari yazılım kullanılarak bir maske oluşturuldu ve dijital png referans görüntüsü olarak biçimlendirildi (Şekil 1B, F, J). Sahneye...

Tartışmalar

Burada, tümör zenginleştirme ve WES'de kullanım için düşük tümör içerikli FFPE veya taze dondurulmuş dokulardan tümör bölgelerini diseke etmek için dijital ek açıklama ve otomatik diseksiyon uygulaması için bir protokol sunulmaktadır. Dijital ek açıklama ve maske oluşturmayı otomatik diseksiyonla birleştirmek, manuel makrodiseksiyon ve LCM dahil olmak üzere klasik tümör zenginleştirme yöntemlerinde yaygın olan gerekli uygulamalı zamanı ve uzmanlığı önemli ölçüde azaltır. Protokol...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent SureSelectXT	Agilent	G9611A
AVENIO Millisect Fill Station	Roche	8106533001
AVENIO Millisect Instrument, Base	Roche	8106568001
AVENIO Millisect Instrument, Head	Roche	8106550001
AVENIO Millisect Milling Tips Small	Roche	8106509001
AVENIO Millisect PC	Roche	8106495001
BioAnalyzer	Agilent	G2939BA
Eppendorf 5427R	Eppendorf	22620700	Micro-centrifuge
Incubation Buffer	Promega	D920D
Leica Autostainer XL	Leica	ST5010	Automated stainer
Molecular Grade Mineral Oil	Sigma	M5904-500ML
Proteinase K	Promega	V302B	Digestion buffer
Qiagen AllPrep DNA/RNA Mini Kit	Qiagen	80284
RLT Plus buffer	Qiagen	80204
Superfrost Plus positively charged microscope slides	Thermo Scientific	6776214