פרוטוקול דיסקציה אוטומטי להעשרת גידולים ברקמות בעלות תכולת גידול נמוכה

Summary

ביאור דיגיטלי עם דיסקציה אוטומטית של רקמות מספק גישה חדשנית להעשרת הגידול במקרים של תכולת גידול נמוכה וניתן להתאמה הן לסוגי פרפין והן לסוגי רקמות קפואות. זרימת העבודה המתוארת משפרת את הדיוק, יכולת השכפול והתפוקה וניתן ליישם אותה הן על הגדרות המחקר והן על ההגדרות הקליניות.

Abstract

העשרת גידולים ברקמות בעלות תכולת גידול נמוכה, אלה שמתחת לתכולת הגידול של 20% בהתאם לשיטה, נדרשת כדי להפיק נתונים איכותיים באופן משוחזר עם בדיקות רבות במורד הזרם כגון ריצוף הדור הבא. כריתת רקמות אוטומטית היא מתודולוגיה חדשה שהופכת ומשפרת את העשרת הגידולים ברקמות הנפוצות והנמוכות הללו על ידי הפחתת חוסר הדיוק התלוי במשתמש של ניתוח מאקרו מסורתי ומגבלות זמן, עלות ומומחיות של מיקרו-דיסקציה של לכידת לייזר על-ידי שימוש בשכבת-על של ביאור תמונה דיגיטלי על גבי שקופיות לא מוכתמות. כאן, ביאורים דיגיטליים של המטוקסילין ואאוזין (H&E) משמשים כדי להתמקד באזורי גידול קטנים באמצעות להב בקוטר 250 מיקרומטר² בפרפין קבוע פורמלין לא מוכתם משובץ (FFPE) או מקטעים קפואים טריים בעובי של עד 20 מיקרומטר להעשרת גידולים אוטומטית לפני מיצוי חומצות גרעין וריצוף אקסום שלם (WES). כריתה אוטומטית יכולה לקצור אזורים מבוארים ברקמות בעלות תכולת גידול נמוכה מקטעים בודדים או מרובים למיצוי חומצות גרעין. הוא גם מאפשר לכידה של מדדי איסוף נרחבים לפני ואחרי הקציר תוך שיפור הדיוק, יכולת השכפול והגדלת התפוקה תוך ניצול של פחות שקופיות. הפרוטוקול המתואר מאפשר ביאור דיגיטלי עם דיסקציה אוטומטית על FFPE של בעלי חיים ו/או בני אדם או רקמות קפואות טריות עם תכולת גידול נמוכה ויכול לשמש גם לכל אזור העשרת עניין כדי להגביר את ההלימה ליישומי ריצוף במורד הזרם בתהליכי עבודה קליניים או מחקריים.

Introduction

ריצוף הדור הבא (NGS) מנוצל יותר ויותר הן לטיפול בחולים והן לחקר הסרטן כדי לסייע בהנחיית טיפולים ובהקלה על גילוי מדעי. רקמה היא לעתים קרובות מוגבלת ודגימות קטנות עם תוכן גידול משתנה משמשים באופן שגרתי. הלימות הגידול ושלמותו, אם כן, נותרו מחסום להשגת נתונים משמעותיים. דגימות עם אחוזי גידול נמוכים יותר עלולות לגרום לקושי להבחין בין וריאנטים אמיתיים לבין ממצאי ריצוף ולעתים קרובות אינן זכאיות ל- NGS¹. העשרת גידולים של מקרים בעלי תכולת גידול נמוכה, אלה הנמוכים מ-20%, הוכחה כמסייעת להניב מספיק חומר על מנת לייצר נתוני ריצוף הניתנים לשחזור ולהבטיח שגרסאות בתדר נמוך לא יחמיצו ^2,3. עם זאת, המגבלות ישתנו בהתאם לפלטפורמות המשמשות והשימוש המתוכנן בנתונים שנוצרו.

באופן מסורתי, העשרה של אזורי גידול למיצוי מתבצעת על ידי מקרודיסקציה ידנית או מיקרו-דיסקציה של לכידת לייזר (LCM) של שקופיות מוטבעות פרפין קבועות פורמלין (FFPE). מקרו-דיסקציה ידנית, או גירוד אזורי רקמה מוגדרים משקופיות, מאפשרת להסיר אזורי גידול לשימוש בבדיקות במורד הזרם בעלות נמוכה יחסית, אך עם דיוק נמוך ודיוק נמוך ^2,4. דיוק טכני מינימלי יכול להיות יעיל מאוד במקרים של תכולת גידול גבוהה יותר בהם קיימים חלקים גדולים של גידול ו/או אובדן רקמות מינימלי אינו משפיע באופן משמעותי על התוצאות, אך מקרים של תכולת גידול נמוכה או מקרים עם גידול מפוזר יותר דורשים דיוק מוגבר. LCM הומצא אפוא בשנות ה-90 של המאה ה-20 והפך לדרך רבת ערך להסיר במדויק אזורים קטנים, מוגדרים ומיקרוסקופיים של רקמה משקופיות פרפין קבוע פורמלין (FFPE) 5,6,7,8. ניתן להשתמש ב-LCM כדי לאסוף אוכלוסיות של תאים בודדים כאשר ההטרוגניות המורכבת של הדגימה קיימת⁹ ומאפשרת איסוף של אוכלוסיות תאים שבעבר היה קשה להפריד. עם זאת, LCM דורש מכונות יקרות הדורשות מומחיות טכנית נרחבת וזמן מעשי 10,11,12,13,14.

המכשיר המשמש לניתוח אוטומטי של רקמות הוא בעל דיוק בין זה של LCM (~10 מיקרומטר) לבין מקרו-דיסקציות (~1 מ"מ)¹⁵. בנוסף, הוא מציג הן דרישות עלות והן דרישות מומחיות טכניות בין זו של מקרודיסקציה ו- LCM ונועד לבצע העשרת רקמות מהירה משקופיות FFPE רציפות כדי להקל על החסרונות של שיטות קודמות¹⁵. כריתה אוטומטית באופן זה משתמשת בביאורים דיגיטליים או בשכבות-על של תמונות ייחוס שקופיות על הבמה על גבי שקופיות רקמה לא מוכתמות בחתך סדרתי לצורך ניתוח והעשרה של אזורי עניין. המכשיר משתמש בקצות כרסום להב מסתובב מפלסטיק, צינורות איסוף של 1.5 מ"ל וניתן להשתמש בו עם מספר נוזלים שונים לצורך כריתה כדי לאסוף אזורי עניין לבדיקות במורד הזרם הכוללות מיצוי גרעין וריצוף. קצה הטחינה הפלסטי המסתובבת משתמש במאגרי חבית מזרקים פנימיים וחיצוניים ובוכנה לאיסוף חיץ, ואז טוחן ואוסף רקמות¹⁶. קוטר גודל קצה הטחינה המשתנה (250 מיקרומטר, 525 מיקרומטר, 725 מיקרומטר) יכול לאפשר כריתה של אזורי רקמה נפרדים לצורך השוואה, אזורים מולטיפוקליים שניתן לאגד או אזורים קטנים בודדים משקופיות FFPE בודדות או מרובות. ניתן להתאים את עוביי המקטעים המשמשים לקציר על סמך צרכי הניסוי האינדיבידואליים והמשתמשים יכולים להבטיח שאזורי העניין לא התרוקנו על ידי ביצוע H&E נוסף בקטע טורי אחד מיד לאחר הקטע האחרון ששימש לקציר.

כריתה אוטומטית זוהתה כדרך להעשיר את תכולת הגידול במקרים של תכולת גידול נמוכה ובדקנו והרחבנו את הפונקציונליות המיועדת של מכשיר כריתת רקמות אוטומטי, המשווק כיום לשימוש בדגימות קליניות של FFPE בעובי של עד 10 מיקרומטר. העבודה מראה כי ניתן ליישם כריתה אוטומטית הן על FFPE והן על מקטעי רקמות קפואות טריות של בני אדם או בעלי חיים בעובי של עד 20 מיקרומטר למטרות מחקר. הפרוטוקול גם מדגים גישה לביאור דיגיטלי ולאוטומציה של כריתה להעשרת גידולים ברקמות עם תכולת גידול נמוכה ו/או מקרים של גידול מקונן ומפוזר שבו מקרו-דיסקציה משמעותית היא מאתגרת או לא אפשרית ומראה הן איכות והן תפוקה של חומצת גרעין המספיקה ל-NGS. לפיכך, דיסקציה אוטומטית יכולה לספק דיוק ברמה בינונית ותפוקה מוגברת להעשרת גידולים, וניתן ליישם אותה גם כדי להעשיר אזורי עניין אחרים או לשלב אותה עם פלטפורמות אחרות כדי לענות על שאלות מחקריות או קליניות.

Protocol

לפני תחילת העבודה, השג דגימות רקמות מתאימות על פי פרוטוקולי מועצת הביקורת המוסדית (IRB). כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של Genentech, Inc.

1. הכנת רקמות ושקופיות

1. בחר בלוקי FFPE או רקמות קפואות טריות והשתמש בשיטת העיבוד המתאימה להלן.
2. חותכים מקטעי בלוק רקמה לשקופיות זכוכית טעונות חיובית בעובי הרצוי. חתכו באופן סדרתי את רקמת ה-FFPE בסרטים עם קטע הייחוס הראשון שנחתך בעובי המתאים לצביעת H&E (כלומר, 4 מיקרומטר) ואחריו 1-4 מקטעים בעובי הנע בין 4-20 מיקרומטר בהתאם לצורך וזמינות הרקמה. אספו את חלקי הרקמה לשקופיות מיקרוסקופ זכוכית טעונות חיובית.
   הערה: יש להכתים באופן מיידי קטעי רקמות ייחוס קפואות טריות עם המטוקסילין ו- Eosin (H&E) באמצעות פרוטוקולים שגרתיים עבור חלקים קפואים והמקטעים הקפואים הלא מוכתמים המוחזקים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד שהם נחוצים לקציר.
3. אפשרו לכל מקטעי ה-FFPE להתייבש בטמפרטורת החדר למשך הלילה.
4. אופים את שקופיות הייחוס של FFPE בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ולאחר מכן מכתימים עם H&E באמצעות פרוטוקולים שגרתיים.
5. סרוק את השקופיות המוכתמות H&E על תמונת שקופיות שלמה בהגדלה של פי 20 ומעלה.
6. הוסף הערות לתמונות השקופיות הסרוקות עבור אזורי גידול בעלי עניין באמצעות פלטפורמת צפייה שסופקה על ידי ספק או צופה בקוד פתוח. ייצא ביאורים אלה כצילום מסך בהגדלה נמוכה או שמור אותם כקובץ מטה-נתונים המכיל קואורדינטות פיקסל X-Y המתאימות לקודקודים מצולעים.
   הערה: הראשון פחות מאתגר מבחינה טכנית לעבוד איתו, אך האחרון מציע יתרונות באוטומציה של תהליכים.
7. צור מסכות דיגיטליות של אזורי העניין המבוארים בהתאם לגישה שבה נעשה שימוש וייצא את הביאורים הידניים.
   הערה: אם נעשה שימוש בצילום מסך/תמונה של הביאורים, ניתן להשתמש בתוכנת עיבוד תמונה פשוטה כדי לבחור אזור ולהשלים את הבחירה כולה. שימוש בקואורדינטות X-Y עבור כל ROI דורש שימוש בשפת תכנות כדי לקרוא הן את נתוני התמונה והן את קואורדינטות המצולע כדי ליצור תמונה עם מאג נמוך עם אזורים מלאים של עניין. על המשתמש לעבוד עם ספק כלי הנתיחה האוטומטי כדי ליצור תהליך המבוסס על זמינות התוכנה והצרכים האישיים שלו. אם סריקה, ביאור שקופיות דיגיטלי ו/או יצירת מסיכה דיגיטלית אינם זמינים, ניתן לבצע ביאור זהיר בשקופית באמצעות סמן ולהשתמש בו במקום מסיכה דיגיטלית כתמונת ייחוס. פסאודו-קוד ליצירת מסיכה דיגיטלית סופק בקובץ משלים 1.

2. כריתת רקמות אוטומטית

1. מקם את שקופיות רקמת הדגימה הלא מוכתמות על הבמה במיקומי השקופית הראשונה עד הרביעית בעת שימוש בהפניה דיגיטלית לשקופיות. בעת שימוש בביאור בשקופית במקום באפשרות דיגיטלית, מקם את שקופיות הרקמה לדוגמה שאינן מוכתמות על הבמה במיקומי השקופית השנייה עד הרביעית עם שקופית ייחוס במיקום הראשון.
2. צור עבודת כרסום באמצעות תוכנת כריתת הרקמות האוטומטית: בחירת עבודה > יצירת מזהה מקרה > עבודה חדשה > > שם עבודת הטחינה; עבור אל עובי > עובי המקטע באמצעות הכרטיסייה חץ למעלה או למטה; לאחר מכן עבור אל הכנת רקמות > paraffinized או Deparaffinized, הפניה תמונה > מקובץ > ייבוא תמונה > קובץ לייבוא מהתפריט הנפתח כהפניה הדיגיטלית, אם רלוונטי. בחר מהבמה עבור הפניה לשקופית על הבמה. לאחר השלמת השדות, סרוק את השלב על-ידי בחירה בלחצן Scan Stage בפינה השמאלית התחתונה כדי ללכוד כל שקופית רקמת דגימה במיקום הראשון עד הרביעי.
3. בחר את אזור הרקמה ללכידת תמונה.
   1. אם אתם משתמשים בהפניה על הבמה, גררו את התיבה מפינה אחת להפך כדי ליצור אזור מלבני מעל הרקמה. בחר את הבועה העגולה מתחת לאזור המלבני כדי לצלם את תמונת הפניה לבמה. אם אתם משתמשים בתמונת ייחוס דיגיטלית, הוסיפו את שכבת-העל של התמונה באזור המלבני שנבחר. שנה את גודל ההפניה הדיגיטלית ויישר אותה בצורה גסה בזום הקורס כדי להתאים בצורה הטובה ביותר לגודל ולמיקום מעל רקמת הדגימה.
   2. העתק שדה מלבן זה לשקופיות רקמות דגימה שנותרו במיקומי השקופית השנייה עד הרביעית על-ידי בחירת אפשרות ההעתקה בפינה השמאלית העליונה של תמונת ההפניה. יישרו את גודלם ושינו את גודלם באופן גס לפי הצורך.
      הערה: בעת שימוש בתמונת הפניה בשקופית במקום במסכה דיגיטלית, בחר איזו שקופית על הבמה צריכה לשמש כהפניה.
4. יישור השקופיות של ההפניה והדוגמאות
   1. כאשר תמונת ההפניה מיושרת באופן גס בשקופיות דגימת רקמות בכל מיקומי השקופיות, בחר בלחצן Scan Stage בפינה השמאלית התחתונה של המסך כדי לעבור לשלב ההתאמה העדינה. בחר את מיקום השלב הראשון ואת סמל הכלי 'שינוי צורה' (הסמל השלישי למטה בסרגל הכלים הימני) כדי לבצע התאמות יישור וזום עדינות של ההפניה כך שיתאימו בצורה הטובה ביותר לכיסוי השקופית לדוגמה. השתמש בסרגל ההזזה הפניה לדוגמה בתחתית המסך המתחלף בין תמונת ייחוס לתמונה לדוגמה יחד עם התכונה Zoom In ו - Zoom Out כדי להתאים ולהשיג יישור של כל מיקום שקופית. שכפל תהליך זה במיקומי השקופית השנייה עד הרביעית לדוגמה.
5. בחר את אזור הטחינה של אזור העניין
   1. לאחר שהושגה שכבת-על אופטימלית של כל אחד מארבעת מיקומי השקופיות, ציירו את הכינויים של נתיב הטחינה באמצעות סמל הכלי 'בורר הצבעים ' (הסמל העשירי למטה בסרגל הכלים הימני) בחלק הצבעוני של תמונת הייחוס במסכה. בחר בתיבה הרחב לדומה אם שקופיות או אזורים מרובים מבוארים לצורך כריתה ולאחר מכן בחר בלחצן קבל ביאור(ים) בפינה הימנית התחתונה כדי לצייר נתיבי כרסום לשקופיות לדוגמה.
   2. בחר את נתיב הטחינה במיקום השקופית הראשון.
      הערה: כאשר נתיב הטחינה נבחר במיקום השקופית הראשון, הוא יועתק למיקומי השקופיות הנותרים ויחושב השימוש בקצה הטחינה. השימוש בקצה הטחינה בפינה השמאלית העליונה מחושב על סמך השטח המכוסה וגודל הקצה שנבחר. אם מחושבים יותר מארבע עצות, ניתן לבחור גודל טיפ גדול יותר כדי ללכוד את ההחזר על ההשקעה המבואר. ניתן לבחור או לשנות את גודל העצה בצד שמאל של המסך תחת החץ 'קצה כרסום', והשימוש בקצה יחושב מחדש.
   3. כאשר מחושב נתיב הטחינה, אסוף את ההחזר על ההשקעה המבואר עם ארבעה טיפים או פחות לכרסום. בחר בלחצן Setup Stage בפינה השמאלית התחתונה של המסך כדי לבקש טעינה מהירה של קצוות כרסום מצינורות איסוף הממוקמים בייעודם הנכון על הבמה.
6. מלאו את המאגר ב-3.0 מ"ל של מאגר הנתיחה המתאים ביותר לסוג הרקמה (FFPE או קפואה טרייה) וערכת מיצוי חומצות גרעין במורד הזרם, ובחרו בלחצן Dissect בפינה הימנית התחתונה של המסך. השתמש בשמן מינרלי בדרגה מולקולרית או במאגר מתאים מתוך ערכות מיצוי של חומצות גרעין הזמינות באופן מסחרי.
   הערה: ניתוח אוטומטי של שקופיות ואזורי עניין נבחרים מתחיל לאחר מכן ודגימות נאספות על ידי המכשיר. ראש היחידה יאסוף קצוות כרסום מהחלק האחורי של הבמה וימלא בנוזל דיסקציה מהמאגר. לאחר מכן הטיפים מסתובבים לאורך נתיב הטחינה ושואפים לרקמת דגימה משקופיות עד להשלמתן או מלאה. הדגימה שנאספה עם נוזל דיסקציה מחולקת לאחר מכן לצינורות איסוף הממוקמים בחלק האחורי של הבמה.
7. לאחר השלמת הנתיחה האוטומטית, הסר את צינורות האיסוף ואת מגלשות הדגימה המנותקות מהבמה והנח אותן במדף צינורות ובמדף החלקות, בהתאמה.
   הערה: יש לקחת יבולים קפואים טריים ישירות למיצוי חומצות גרעין בהתאם להוראות היצרן ויש להכתים את החלקים הקפואים הטריים שלאחר הנתיחה לאחר הניתוח באופן מיידי באמצעות פרוטוקולים שגרתיים למקטעים קפואים.
8. יש לאפות את שקופיות הרקמה המנותקות בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ולאחר מכן להכתים ב-H&E באמצעות פרוטוקולים שגרתיים.
9. סרוק את הפוסט שנחתך H&E מוכתם בשקופיות על תמונת שקופיות שלמה בהגדלה ו/או ארכיון של פי 20 לקבלת הפניה של הרקמה שלא נאספה ונשארה על השקופית.
   הערה: ראה שלב 1.5 לעיל לקבלת אפשרויות סריקה חלופיות.

3. מיצוי חומצות גרעין

1. בריכה וכדור את הרקמה. בצע את מיצוי חומצות הגרעין באמצעות ערכה זמינה מסחרית ופעל לפי הוראות היצרן.

תוצאות

נבחרו מקטעי כבד של עכברי FFPE ו-FF המכילים סרטן מעי גס גרורתי בנצרי קסנוגרפט. המקטעים הוכתמו ב-H&E (איור 1A,E,I) ונסרקו על תמונת שקופיות שלמה בהגדלה של פי 20. פתולוג ציין באופן דיגיטלי אזורי גידול מעניינים ומסכה נוצרה באמצעות תוכנה מסחרית ועוצבה כתמונת ייחוס דיגיטלית של png (...

Discussion

מוצג כאן פרוטוקול ליישום של ביאור דיגיטלי וכריתה אוטומטית לנתח אזורי גידול מתכולת גידול נמוכה FFPE או רקמות קפואות טריות להעשרת הגידול והשימוש בו ב- WES. שילוב של ביאור דיגיטלי ויצירת מסכה עם דיסקציה אוטומטית מפחית באופן משמעותי את הזמן והמומחיות המעשיים הנדרשים הנפוצים בשיטות קלאסיות של הע...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent SureSelectXT	Agilent	G9611A
AVENIO Millisect Fill Station	Roche	8106533001
AVENIO Millisect Instrument, Base	Roche	8106568001
AVENIO Millisect Instrument, Head	Roche	8106550001
AVENIO Millisect Milling Tips Small	Roche	8106509001
AVENIO Millisect PC	Roche	8106495001
BioAnalyzer	Agilent	G2939BA
Eppendorf 5427R	Eppendorf	22620700	Micro-centrifuge
Incubation Buffer	Promega	D920D
Leica Autostainer XL	Leica	ST5010	Automated stainer
Molecular Grade Mineral Oil	Sigma	M5904-500ML
Proteinase K	Promega	V302B	Digestion buffer
Qiagen AllPrep DNA/RNA Mini Kit	Qiagen	80284
RLT Plus buffer	Qiagen	80204
Superfrost Plus positively charged microscope slides	Thermo Scientific	6776214