Protocollo di dissezione automatizzato per l'arricchimento tumorale nei tessuti a basso contenuto tumorale

Riepilogo

L'annotazione digitale con dissezione tissutale automatizzata fornisce un approccio innovativo all'arricchimento del tumore nei casi a basso contenuto tumorale ed è adattabile sia alla paraffina che ai tipi di tessuto congelato. Il flusso di lavoro descritto migliora l'accuratezza, la riproducibilità e la produttività e potrebbe essere applicato sia alla ricerca che alle impostazioni cliniche.

Abstract

L'arricchimento tumorale nei tessuti a basso contenuto tumorale, quelli al di sotto del 20% del contenuto tumorale a seconda del metodo, è necessario per generare dati di qualità riproducibili con molti saggi a valle come il sequenziamento di prossima generazione. La dissezione tissutale automatizzata è una nuova metodologia che automatizza e migliora l'arricchimento tumorale in questi tessuti comuni a basso contenuto tumorale diminuendo l'imprecisione dipendente dall'utente della macro-dissezione tradizionale e le limitazioni di tempo, costi e competenze della microdissezione di acquisizione laser utilizzando la sovrapposizione di annotazioni di immagini digitali su vetrini non macchiati. Qui, le annotazioni digitali di ematossilina ed eosina (H & E) vengono utilizzate per colpire piccole aree tumorali utilizzando una lama di 250 μm² di diametro in paraffina fissa di formalina non macchiata incorporata (FFPE) o sezioni fresche congelate fino a 20 μm di spessore per l'arricchimento automatico del tumore prima dell'estrazione dell'acido nucleico e del sequenziamento dell'intero esoma (WES). La dissezione automatizzata può raccogliere regioni annotate in tessuti a basso contenuto tumorale da sezioni singole o multiple per l'estrazione di acidi nucleici. Consente inoltre di acquisire ampie metriche di raccolta pre e post-raccolta, migliorando al contempo l'accuratezza, la riproducibilità e l'aumento della produttività con l'utilizzo di un minor numero di diapositive. Il protocollo descritto consente l'annotazione digitale con dissezione automatizzata su FFPE animale e/o umano o tessuti freschi congelati a basso contenuto tumorale e potrebbe anche essere utilizzato per qualsiasi arricchimento della regione di interesse per aumentare l'adeguatezza per le applicazioni di sequenziamento a valle nei flussi di lavoro clinici o di ricerca.

Introduzione

Il sequenziamento di nuova generazione (NGS) è sempre più utilizzato sia per la cura del paziente che nella ricerca sul cancro per aiutare a guidare i trattamenti e facilitare la scoperta scientifica. Il tessuto è spesso limitato e piccoli campioni con contenuto tumorale variabile vengono utilizzati di routine. L'adeguatezza e l'integrità del tumore, quindi, rimangono una barriera per ottenere dati significativi. I campioni con percentuali tumorali più basse possono causare difficoltà nel distinguere le varianti reali dagli artefatti di sequenziamento e spesso non sono idonei per NGS¹. L'arricchimento tumorale dei casi a basso contenuto tumorale, quelli inferiori al 20%, ha dimostrato di aiutare a produrre materiale sufficiente per generare dati di sequenziamento riproducibili e garantire che le varianti a bassa frequenza non vengano perse ^2,3. Tuttavia, i limiti varieranno a seconda delle piattaforme utilizzate e dell'uso pianificato dei dati generati.

Tradizionalmente, l'arricchimento delle regioni tumorali per l'estrazione viene eseguito mediante macrodissezione manuale o microdissezione a cattura laser (LCM) di vetrini incorporati a paraffina fissa di formalina (FFPE). La macrodissezione manuale, o raschiatura di aree di tessuto specifiche dai vetrini, consente di rimuovere le regioni tumorali per l'uso in saggi a valle con un costo relativamente basso, ma con bassa accuratezza e bassa precisione ^2,4. L'accuratezza tecnica minima può essere molto efficace con casi con un contenuto tumorale più elevato in cui sono presenti ampie fasce di tumore e / o una minima perdita di tessuto non influisce in modo significativo sui risultati, ma i casi a basso contenuto di tumore o i casi con tumore più disperso richiedono una maggiore precisione. LCM è stato quindi inventato nel 1990 ed è diventato un modo prezioso per rimuovere con precisione piccole, definite, microscopiche regioni di tessuto dalla formalina paraffina fissa incorporata (FFPE) vetrini 5,6,7,8. LCM può essere utilizzato per raccogliere popolazioni di singole cellule quando esiste un'eterogeneità complessa del campione⁹ che consente la raccolta di popolazioni cellulari precedentemente difficili da separare. Tuttavia, LCM richiede macchinari costosi che richiedono una vasta esperienza tecnica e un tempo pratico 10,11,12,13,14.

Lo strumento utilizzato per la dissezione tissutale automatizzata ha una precisione compresa tra quella di LCM (~10 μm) e macrodissezioni (~1 mm)¹⁵. Inoltre, presenta requisiti di costo e competenza tecnica tra quello della macrodissezione e LCM ed è progettato per eseguire un rapido arricchimento tissutale da vetrini FFPE sequenziali per alleviare gli svantaggi dei metodi precedenti¹⁵. La dissezione automatizzata in questo modo utilizza annotazioni digitali o sovrapposizioni di immagini di riferimento di diapositive sul palco su vetrini di tessuto non macchiati sezionati in serie per sezionare e arricchire le regioni di interesse. Lo strumento utilizza punte di fresatura a lama di filatura in plastica, tubi di raccolta da 1,5 ml e può essere utilizzato con una serie di fluidi diversi per la dissezione per raccogliere regioni di interesse per saggi a valle tra cui l'estrazione nucleica e il sequenziamento. La punta di fresatura in plastica rotante utilizza serbatoi interni ed esterni della canna della siringa e uno stantuffo per raccogliere il tampone, quindi fresa e raccoglie il tessuto¹⁶. Il diametro variabile della punta di fresatura (250 μm, 525 μm, 725 μm) può consentire la dissezione di aree tissutali separate per il confronto, regioni multifocali che possono essere raggruppate o singole piccole aree da diapositive FFPE singole o multiple. Gli spessori delle sezioni utilizzati per la raccolta possono essere regolati in base alle esigenze individuali dell'esperimento e gli utenti possono garantire che le regioni di interesse non siano state esaurite eseguendo un H&E aggiuntivo su una sezione seriale immediatamente dopo l'ultima sezione utilizzata per la raccolta.

La dissezione automatizzata è stata identificata come un modo per arricchire il contenuto tumorale nei casi a basso contenuto tumorale e abbiamo testato e ampliato la funzionalità prevista di uno strumento di dissezione tissutale automatizzato, che è attualmente commercializzato per l'uso su campioni clinici FFPE fino a 10 μm di spessore. Il lavoro mostra che la dissezione automatizzata può essere applicata sia a FFPE che a sezioni di tessuto umano o animale congelato fresco fino a 20 μm di spessore per scopi di ricerca. Il protocollo dimostra anche un approccio per annotare e automatizzare digitalmente la dissezione per l'arricchimento tumorale in tessuti a basso contenuto tumorale e / o casi con tumore nidificato e disperso in cui una macrodissezione significativa è impegnativa o non fattibile e mostra sia la qualità che la resa dell'acido nucleico sufficiente per NGS. La dissezione automatizzata può quindi fornire una precisione di medio livello e una maggiore produttività per l'arricchimento del tumore e potrebbe anche essere applicata per arricchire altre regioni di interesse o combinata con altre piattaforme per rispondere a domande di ricerca o cliniche.

Protocollo

Prima dell'inizio, ottenere campioni di tessuto appropriati secondo i protocolli dell'Institutional Review Board (IRB). Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) di Genentech, Inc.

1. Preparazione di tessuti e vetrini

1. Selezionare FFPE o blocchi di tessuto fresco congelato e utilizzare il metodo di elaborazione corrispondente di seguito.
2. Tagliare le sezioni dei blocchi di tessuto su vetrini caricati positivamente allo spessore desiderato. Sezionare in serie il tessuto FFPE in nastri con la prima sezione di riferimento tagliata ad uno spessore appropriato per la colorazione H&E (cioè 4 μm) seguita da 1-4 sezioni ad uno spessore che va da 4-20 μm in base alla necessità e alla disponibilità tissutale. Raccogliere le sezioni di tessuto su vetrini per microscopio caricati positivamente.
   NOTA: le sezioni di tessuto di riferimento congelate fresche devono essere colorate immediatamente con ematossilina ed eosina (H & E) utilizzando protocolli di routine per le sezioni congelate e le sezioni congelate non macchiate mantenute a -20 ° C fino a quando non sono necessarie per la raccolta.
3. Lasciare asciugare tutte le sezioni FFPE a temperatura ambiente durante la notte.
4. Cuocere i vetrini di riferimento FFPE a 60 °C per 30 minuti e poi colorare con H&E utilizzando protocolli di routine.
5. Scansiona le diapositive colorate H & E su un intero imager di diapositive con ingrandimento 20x o superiore.
6. Annotare le immagini delle diapositive scansionate per le regioni tumorali di interesse utilizzando una piattaforma di visualizzazione fornita dal fornitore o un visualizzatore open source. Esporta queste annotazioni come screenshot a basso ingrandimento o salvale come file di metadati contenente le coordinate dei pixel X-Y corrispondenti ai vertici poligonali.
   NOTA: il primo è meno impegnativo dal punto di vista tecnico, ma il secondo offre vantaggi nell'automazione dei processi.
7. Creare maschere digitali delle regioni di interesse annotate in linea con l'approccio utilizzato ed esportare le annotazioni manuali.
   NOTA: se si utilizza uno screenshot/immagine delle annotazioni, è possibile utilizzare un semplice software di elaborazione delle immagini per selezionare una regione e compilare l'intera selezione. L'utilizzo di coordinate X-Y per ogni ROI richiede l'uso di un linguaggio di programmazione per leggere sia i dati dell'immagine che le coordinate poligonali per creare un'immagine a basso mag con regioni di interesse riempite. L'utente dovrebbe collaborare con il fornitore dello strumento di dissezione automatizzato per stabilire un processo basato sulla disponibilità e sulle esigenze individuali del software. Se la scansione, l'annotazione di diapositive digitali e/o la creazione di maschere digitali non sono disponibili, è possibile eseguire un'attenta annotazione su diapositiva utilizzando un marcatore e utilizzarla al posto di una maschera digitale come immagine di riferimento. Lo pseudocodice per la creazione di maschere digitali è stato fornito nel file supplementare 1.

2. Dissezione tissutale automatizzata

1. Posizionare i vetrini di tessuto campione non macchiato sul palco nella posizione dalla prima alla quarta diapositiva quando si utilizza il riferimento della diapositiva digitale. Quando si utilizza l'annotazione sulla diapositiva anziché un'opzione digitale, posizionare le diapositive di tessuto campione non macchiate sullo stage nella seconda e quarta posizione della diapositiva con una diapositiva di riferimento nella prima posizione.
2. Creare un lavoro di fresatura utilizzando il software di dissezione automatica del tessuto: Selezione del lavoro > Creare nuovo lavoro > ID caso > Nome del lavoro di fresatura; vai a Spessore > spessore sezione utilizzando la scheda freccia su o giù; quindi vai a Preparazione tessuto > Paraffinizzato o Deparaffinizzato, Immagine di riferimento > Da file > Importa immagine > File da importare dal menu a discesa come riferimento digitale, se applicabile. Selezionate Da stage (From Stage) per riferimento alla diapositiva sullo stage. Quando i campi sono completi, eseguire la scansione dello stage selezionando il pulsante Scan Stage nell'angolo in basso a destra per acquisire ogni diapositiva di tessuto campione dalla prima alla quarta posizione.
3. Selezionare l'area del tessuto per l'acquisizione dell'immagine.
   1. Se utilizzate un riferimento sullo stage, trascinate la casella da un angolo all'altro per creare un'area rettangolare sul tessuto. Selezionate la bolla circolare sotto l'area rettangolare per acquisire l'immagine di riferimento del palcoscenico. Se si utilizza un'immagine di riferimento digitale, sovrapporre l'immagine sull'area rettangolare selezionata. Ridimensionare e allineare grossolanamente il riferimento digitale in corso per adattarsi al meglio alle dimensioni e alla posizione sul tessuto campione.
   2. Copiate questo campo rettangolare sulle diapositive di tessuto campione rimanenti nella seconda e quarta posizione della diapositiva selezionando l'opzione di copia nell'angolo superiore destro dell'immagine di riferimento. Allineare e ridimensionare grossolanamente se necessario.
      NOTA: quando si utilizza un'immagine di riferimento sulla diapositiva anziché una maschera digitale, selezionare la diapositiva sullo stage da utilizzare come riferimento.
4. Allineare le diapositive di riferimento e di esempio
   1. Quando l'immagine di riferimento è grossolanamente allineata sulle diapositive del campione di tessuto in tutte le posizioni delle diapositive, selezionare il pulsante Fase di scansione nell'angolo inferiore destro dello schermo per passare alla fase di regolazione fine. Selezionate la posizione del primo stadio e l'icona dello strumento Trasforma (la terza icona in basso nella barra degli strumenti di destra) per regolare l'allineamento e lo zoom del riferimento in modo che corrispondano al meglio alla sovrapposizione della diapositiva di esempio. Utilizzare la barra di scorrimento Riferimento al campione nella parte inferiore dello schermo passando dall'immagine di riferimento all'immagine di esempio insieme alla funzione Zoom avanti e Zoom indietro per regolare e ottenere l'allineamento di ogni posizione della diapositiva. Replicare questo processo nella seconda e quarta posizione della diapositiva del campione.
5. Seleziona l'area di fresatura della regione di interesse
   1. Una volta ottenuta la sovrapposizione ottimale del campione di ciascuna delle quattro posizioni della diapositiva, disegnate le designazioni del tracciato di fresatura utilizzando l'icona dello strumento Selettore colore (la decima icona in basso nella barra degli strumenti di destra) sulla parte colorata dell'immagine di riferimento mascherata. Selezionate la casella Estendi a simili se più diapositive o aree sono annotate per la dissezione, quindi selezionate il pulsante Ottieni annotazioni in basso a destra per disegnare i tracciati di fresatura sulle diapositive campione.
   2. Selezionate il tracciato di fresatura nella prima posizione della diapositiva.
      NOTA: quando il tracciato di fresatura è selezionato nella prima posizione della diapositiva, verrà copiato nelle posizioni rimanenti della slitta e verrà calcolato l'utilizzo della punta di fresatura. L'utilizzo della punta di fresatura nell'angolo in alto a sinistra viene calcolato in base all'area coperta e alla dimensione della punta selezionata. Se vengono calcolati più di quattro suggerimenti, è possibile selezionare una dimensione della punta maggiore per acquisire il ROI annotato. La dimensione della punta può essere selezionata o modificata sul lato sinistro dello schermo sotto la freccia Punta di fresatura e l'utilizzo della punta verrà ricalcolato.
   3. Quando viene calcolato il percorso di fresatura, raccogliete il ROI annotato con quattro o meno punte di fresatura. Selezionare il pulsante Fase di configurazione nella parte inferiore destra dello schermo per richiedere il caricamento delle punte di fresatura dai tubi di raccolta posizionati nella loro corretta designazione sul palco.
6. Riempire il serbatoio con 3,0 ml del tampone di dissezione più appropriato per il tipo di tessuto (FFPE o fresco congelato) e il kit di estrazione dell'acido nucleico a valle necessario e selezionare il pulsante Dissect nell'angolo in basso a destra dello schermo. Utilizzare olio minerale di grado molecolare o un tampone appropriato da kit di estrazione di acidi nucleici disponibili in commercio.
   NOTA: Inizia quindi la dissezione automatica delle diapositive e delle regioni di interesse selezionate e i campioni vengono raccolti dallo strumento. La testa dell'unità raccoglierà le punte di fresatura dal retro del palco e si riempirà di liquido di dissezione dal serbatoio. Le punte ruotano quindi lungo il percorso di fresatura aspirando il tessuto campione dai vetrini fino al completamento o al pieno. Il campione raccolto con liquido di dissezione viene quindi erogato in tubi di raccolta situati nella parte posteriore del palco.
7. Una volta completata la dissezione automatica, rimuovere i tubi di raccolta e i vetrini del campione sezionati dal palco e posizionarli rispettivamente in un rack per tubi e in un rack scorrevole.
   NOTA: i raccolti freschi congelati devono essere portati direttamente nell'estrazione dell'acido nucleico secondo le istruzioni del produttore e le sezioni fresche congelate post-dissezione devono essere immediatamente colorate H & E utilizzando protocolli di routine per le sezioni congelate.
8. Cuocere i vetrini di tessuto post-sezionati a 60 °C per 30 minuti e poi colorare con H&E utilizzando protocolli di routine.
9. Scansiona le diapositive colorate H&E post sezionate su un intero imager di diapositive con ingrandimento 20x e / o archivio per un riferimento di quale tessuto non è stato raccolto e rimane sulla diapositiva.
   NOTA: vedere il passaggio 1.5 precedente per le opzioni di scansione alternative.

3. Estrazione di acidi nucleici

1. Piscina e pellet il tessuto. Eseguire l'estrazione dell'acido nucleico utilizzando un kit disponibile in commercio e seguendo le istruzioni del produttore.

Risultati

Sono state selezionate sezioni epatiche di topo FFPE e FF contenenti carcinoma colorettale metastatico negli xenotrapianti. Le sezioni sono state colorate H & E (Figura 1A, E, I) e scansionate su un intero imager di diapositive con ingrandimento 20x. Un patologo ha annotato digitalmente le regioni tumorali di interesse e una maschera è stata generata utilizzando un software commerciale e formattata come immagine di riferimento png digitale (Figura 1B

Discussione

Qui viene presentato un protocollo per l'applicazione dell'annotazione digitale e della dissezione automatizzata per sezionare regioni tumorali da FFPE a basso contenuto tumorale o tessuti freschi congelati per l'arricchimento tumorale e l'uso in WES. La combinazione di annotazioni digitali e creazione di maschere con la dissezione automatizzata riduce significativamente il tempo pratico richiesto e le competenze comuni ai metodi classici di arricchimento tumorale, tra cui la macrodissezione manuale e LCM. Il protocollo ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent SureSelectXT	Agilent	G9611A
AVENIO Millisect Fill Station	Roche	8106533001
AVENIO Millisect Instrument, Base	Roche	8106568001
AVENIO Millisect Instrument, Head	Roche	8106550001
AVENIO Millisect Milling Tips Small	Roche	8106509001
AVENIO Millisect PC	Roche	8106495001
BioAnalyzer	Agilent	G2939BA
Eppendorf 5427R	Eppendorf	22620700	Micro-centrifuge
Incubation Buffer	Promega	D920D
Leica Autostainer XL	Leica	ST5010	Automated stainer
Molecular Grade Mineral Oil	Sigma	M5904-500ML
Proteinase K	Promega	V302B	Digestion buffer
Qiagen AllPrep DNA/RNA Mini Kit	Qiagen	80284
RLT Plus buffer	Qiagen	80204
Superfrost Plus positively charged microscope slides	Thermo Scientific	6776214