通过受激拉曼散射成像对氘掺入单个细菌进行快速抗菌药敏试验

摘要

该协议通过D 2 O代谢的单细胞刺激拉曼散射成像在_2.5小时内提供快速抗菌药敏试验（AST）测定。该方法适用于尿液或全血环境中的细菌，对于临床上的快速单细胞表型AST具有变革性。

摘要

为了减缓和防止抗微生物药物耐药性感染的传播，迫切需要快速抗菌药敏试验（AST）来定量确定对病原体的抗菌作用。通过基于长期培养的常规方法完成 AST 通常需要数天时间，并且它们不直接适用于临床样本。在这里，我们报告了一种通过氧化氘（D₂O）代谢掺入的受激拉曼散射（SRS）成像实现的快速AST方法。通过SRS成像监测D₂O在生物质中的代谢掺入和暴露于单个细菌水平的抗生素时的代谢活性抑制。暴露于抗生素时细菌的单细胞代谢失活浓度（SC-MIC）可以在总共2.5小时的样品制备和检测后获得。此外，这种快速AST方法直接适用于复杂生物环境中的细菌样品，例如尿液或全血。氘掺入的SRS代谢成像对于临床中的快速单细胞表型AST具有变革性意义。

引言

抗微生物药物耐药性（AMR）是有效治疗传染病的一个日益严重的全球^威胁1。据预测，如果不采取行动对抗抗生素耐药细菌，到2050年，抗微生物药物耐药性每年将造成1000万人死亡，全球GDP损失¹⁰⁰万亿美元¹，²。这强调了对感染性细菌抗生素敏感性检测（AST）的快速和创新诊断方法的迫切需要，以减缓抗生素耐药细菌的出现并降低相关死亡率³。为了确保最佳的临床结果，在24小时内引入有效的治疗至关重要。然而，目前的金标准方法，如盘式扩散法或肉汤稀释法，通常需要至少24小时用于临床样品的预孵育程序，另外需要16-24小时才能获得最小抑制浓度（MIC）结果。总体而言，这些方法过于耗时，无法指导临床上传染病治疗的立即决策，从而导致^抗菌素耐药性的出现和传播4。

基因型AST方法，例如基于聚合酶链反应（PCR）的技术⁵，已被开发用于快速检测。这些技术测量特定的抗性基因序列，以提供快速的AST结果。它们不依赖于耗时的细胞培养;然而，只测试具有耐药性的特定已知基因序列。因此，其应用仅限于各种细菌种类或不同的抗性机制。此外，他们无法为治疗决策提供MIC结果^6，7。此外，正在开发用于快速AST的新型表型方法以克服这些限制⁸，包括微流控器件⁹，10，11，12，^13，光学器件14，15，16，量化核酸拷贝数的表型AST17，18和拉曼光谱方法^19，20，²¹，²²，^23，24.这些方法减少了指导AST结果的时间，然而，它们中的大多数仅适用于细菌分离株，不直接适用于临床标本，并且仍然需要长时间的预孵育。

在这项工作中，我们提出了一种通过SRS成像监测细胞代谢活性来快速确定尿液和全血中细菌敏感性的方法。水（H₂O）参与了活细胞中绝大多数基本的生物分子合成过程。作为水的同位素，通过NADPH中的氧化还原活性氢原子和D₂O中的D原子之间的酶催化H / D交换反应，氘可以掺入电池内的生物质中^25，26。氘代脂肪酸合成反应由氘标记的NADPH介导。D₂O掺入氨基酸（AA）的反应中导致氘代蛋白产生²⁶（图1）。通过这种方式，在单个微生物细胞中新合成的含C-D键的生物分子可以作为一般的代谢活性标志物进行检测。为了读出从头合成的C-D键，拉曼光谱是一种多功能分析工具，可提供生物分子的特异性和定量化学信息，广泛用于确定抗菌药敏性，并将测试时间显着缩短至几个小时²⁷，^28，29，30.然而，由于拉曼散射过程固有的低效率，自发拉曼光谱的检测灵敏度较低。因此，使用自发拉曼光谱获得实时图像结果具有挑战性。相干拉曼散射（CRS），包括相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）和受激拉曼散射（SRS），由于相干光场产生的光场比自发拉曼光谱大几个数量级，因此达到了很高的检测灵敏度，从而在单细胞水平上呈现高速、特异性和定量的化学成像³¹，^32，33，^34，35，³⁶，³⁷，^38，39.

在这里，基于我们最近的工作⁴⁰，我们提出了一种协议，用于通过飞秒SRS C-D成像快速确定代谢活性和抗菌敏感性，在单细胞水平上正常培养基，尿液和全血环境中的细菌掺入D₂O。飞秒SRS成像有助于在2.5小时内监测单细胞代谢失活浓度（SC-MIC）在单个细菌水平上对抗抗生素。SC-MIC结果通过肉汤微量稀释的标准MIC测试进行验证。我们的方法适用于确定细菌尿路感染（UTI）和血流感染（BSI）病原体的抗菌敏感性，与传统方法相比，测定时间大大缩短，这为临床上单细胞水平的快速表型AST提供了机会。

研究方案

人类血液标本的使用符合波士顿大学IRB和美国国立卫生研究院（NIH）的指导方针。具体来说，标本来自银行，并且完全去识别化。波士顿大学机构审查委员会（IRB）办公室不认为这些标本是人类受试者。

1.细菌和抗生素储备溶液的制备

1. 制备浓度为 1 mg/mL 的抗生素（硫酸庆大霉素或阿莫西林）储备溶液，溶解在 1.5 mL 微管中的无菌 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 或二甲基亚砜 （DMSO） 溶剂中。将硫酸庆大霉素溶解在无菌PBS溶液中，将阿莫西林溶解在无菌DMSO溶剂中。此后，按照建议将抗生素溶液储存在2-8°C。
2. 要制备含有阳离子调节的穆勒-辛顿肉汤 （MHB） 培养基的 D 2 O，请将 220 mg MHB 肉汤基料加入 10 mL D 2 O 中，制成 100% 含 D₂O 的培养基。通过使用200nm孔径的过滤器过滤对溶液进行灭菌。
   注意:在后续步骤中，始终使用此协议来制备和灭菌培养基溶液。
3. 为了制备用于SRS成像的细菌样品，将2mL不含氘的正常MHB培养基加入无菌圆底培养管中，然后在37°C下预热。
4. 使用无菌环从胰蛋白酶大豆琼脂平板上的新鲜培养物中选择一个细菌（大肠杆菌 BW 25113 或 铜绿假单胞 菌 ATCC 47085）菌落。然后将其悬浮在预热的培养基中并轻轻涡旋以制备细菌悬浮液。
5. 将细菌在37°C的摇床中以每分钟200转（rpm）的速度孵育，直到达到对数阶段。

2. 在抗生素存在下进行D₂O掺入处理（图2a）

1. 通过使用波长为600nm的光度计测量光密度（OD）来检查细菌浓度。
2. 使用不含氘的正常MHB培养基稀释细菌溶液，以达到8 x 10⁵ CFU/mL的最终细胞浓度。轻轻涡旋以混合细菌细胞。
3. 在七个 1.5 mL 微管中制备 300 μL 等分试样的细菌溶液，在一个 1.5 mL 微管中制备 600 μL 等分试样的细菌溶液。
4. 将 4.8 μL 抗生素（庆大霉素或阿莫西林）储备溶液 （1 mg/mL） 加入含有 600 μL 细菌溶液的微管中，使最终抗生素浓度达到 8 μg/mL。
5. 从 8 μg/mL 含抗生素的细菌溶液中取出 300 μL 溶液，并加入另外 300 μL 细菌溶液中，制成含有两倍稀释的抗生素 - （4 μg/mL） 细菌溶液。
6. 重复测试抗生素庆大霉素或阿莫西林的两倍连续稀释，直到达到最低浓度（0.25μg/ mL）的微管，并从管中丢弃300μL。庆大霉素和阿莫西林的系列浓度范围为 0.25 μg/mL - 8 μg/mL。
   1. 留下一根没有抗生素的管子作为空白对照。这将是在没有抗生素治疗但使用 D₂O 处理的情况下检查细菌代谢活性的阳性对照。
   2. 留下一根没有抗生素的试管，也没有D₂O用于阴性对照。
7. 将细菌等分试样与含有MHB培养基的某些抗生素（庆大霉素或阿莫西林）孵育1小时。
8. 在孵育期间，用100%D 2 O含有培养基制备抗生素的连续稀释液，其浓度梯度与步骤_2.6中制备的抗生素相同。庆大霉素和阿莫西林的系列浓度范围为 0.25 μg/mL - 8 μg/mL。
9. 抗生素处理 1 小时后，分别将 700 μL 连续稀释的抗生素和 100% D 2 O 含 MHB 培养基加入到 300 μL 相同抗生素浓度的抗生素预处理细菌中（在步骤_2.6中制备）。
   1. 例如，将 700 μL 100% D₂O 含 MHB 培养基（含有 8 μg/mL 抗生素）添加到 300 μL 8 μg/mL 抗生素预处理细菌中。以同样的方式，转移到下一个浓度的相应管中，并通过上下移液几次进行均质化。
   2. 将 700 μL 不含抗生素的 100% D 2 O 含 MHB 培养基加入 300 μL 无抗生素细菌（在步骤 2.6.1 中制备）中作为空白对照。
   3. 在37°C下以200rpm在孵育振荡器中再孵育30分钟。
      注意:在此步骤中，测试介质中D₂O的最终浓度为70%。
10. 首先将1mL抗生素和D₂O处理的细菌样品在4°C下以6200× g 离心5分钟，然后用纯净水洗涤两次。最后，将样品固定在10%福尔马林溶液中，并将其储存在4°C。

3.尿液环境中细菌的制备（图2b）

1. 要在对数阶段制备 大肠杆菌 BW 25113，请按照1.4和1.5中的步骤操作。
2. 通过使用波长为600nm的光度计测量OD来检查细菌浓度。
3. 为了模拟临床UTI样品¹⁴，¹⁸，⁴¹，将大肠杆菌溶液加标到10 mL去识别尿液中^，以达到10⁶ CFU/mL的最终细胞浓度。
4. 使用 5 μm 过滤器过滤加 标的大肠杆菌 尿液，然后将 300 μL 等分试样中的细菌溶液分成七个 1.5 mL 微管，将 600 μL 等分试样的细菌溶液分成一个 1.5 mL 微管。
5. 在抗生素存在下进行D 2 O掺入处理和样品收集，如前面步骤2.4至2.10中所述。

4.血液环境中细菌的制备（图2c）

1. 要在对数阶段制备 铜绿假单胞 菌ATCC 47085，请按照1.4和1.5中的步骤操作。
2. 为了模拟临床血流感染样品⁴²，^43，在1 mL去识别的人血液中加标铜绿假单胞菌以达到10⁷ CFU/mL的浓度。
3. 加入 9 mL 无菌纯净水以裂解血液。
4. 使用5μm过滤器过滤铜 绿假单胞菌 加标的血液。然后在4°C下以6200× g 离心5分钟，将细菌收获至1mL体积。 将 9 mL 预热的正常 MHB 加入细菌溶液中并轻轻涡旋。细菌的最终浓度为 10⁶ CFU/mL
5. 将 300 μL 等分试样中的 铜绿假单胞菌 加标血液溶液分成七个 1.5 mL 微管，将 600 μL 等分试样的细菌溶液分成一个 1.5 mL 微管。
6. 在抗生素存在下进行D 2 O掺入处理和样品收集，如前面步骤2.4至2.10中所述。

5. 单个细菌中 D₂O 代谢掺入的 SRS 成像

1. 用纯净水洗涤1mL固定细菌溶液，然后在4°C下以6200× g 离心5分钟。 除去上清液。将细菌溶液富集至约 20 μL。
2. 将细菌溶液沉积在聚-L-赖氨酸涂层盖玻片上。夹层并密封样品以进行SRS成像。
3. 使用SRS显微镜以2168cm-1的^C-D 振动频率对细菌进行成像。
   1. 使用计算机上的控制软件输入泵浦波长并将其调整为 852 nm。
   2. 使用功率计测量激光功率。通过调整激光输出前面的半波板，将样品处泵浦激光器的功率设置为 ~8 mW，将样品处斯托克斯激光的功率设置为 ~40 mW。
      注意:在SRS显微镜中，具有80 MHz重复率的可调飞秒激光器提供泵浦（680至1300 nm）和斯托克斯（1045 nm）激发激光器。
4. 通过调整反射镜的螺钉，在空间上对齐泵浦和斯托克斯光束，并将两个光束引导到配备2D振镜系统的正置显微镜中进行激光扫描。
   1. 使用60倍水浸物镜将泵浦和斯托克斯激光器聚焦在样品上。
   2. 使用油冷凝器从样品中沿正向收集信号。
   3. 使用带通滤光片滤除斯托克斯激光器，然后再将其引导到光电二极管中。
   4. 通过锁相放大器提取受激拉曼信号，并通过光电二极管检测信号。
5. 在软件的控制面板中将每个SRS图像设置为包含200 x 200像素和30 μs的像素停留时间。一幅图像的总采集时间为~1.2秒。将 步长 设置为 150 nm，因此图像尺寸约为 30 x 30 μm²。为每个样本至少成像三个视图字段。

6. 图像处理和数据分析（图3）

1. 要获得平均 C-D 信号强度，请使用 ImageJ 软件打开并处理 SRS 图像。
2. 首先，通过单击图像将SRS图像转换为具有反转颜色的8位类型图像 |类型 |8 位，然后 编辑| ImageJ 软件中的反转按钮。
3. 然后，通过单击"处理|"过滤具有高斯模糊的图像 过滤器|高斯 模糊按钮并将 西格玛（半径） 设置为 1。
4. 使用图像阈值调整来选择细菌区域。点击 图片|调整|阈值， 以确保所选细菌大小与原始SRS图像中的细菌大小匹配。通过调整尺寸阈值来确定颗粒来消除小颗粒。单击 应用。
5. 应用 分析|颗粒分析 按钮用于标记和确定细菌区域。
6. 通过单击ROI管理器中的"全部显示"按钮到原始未处理的SRS图像，标记相同的细菌区域，通过单击ROI管理器中的"测量"按钮来确定每个数据点的平均强度。
7. 在原始SRS图像中圈出背景区域并测量背景的平均强度。通过扣除背景信号强度获得每种细菌的平均C-D强度。

7. 通过SC-MIC定量抗菌药敏性

注意:根据不同浓度的^{药物暴露时}细菌的代谢活性和代谢抑制条件的SRS C-D强度的统计分析，确定SC-MIC的临界值0.60确定SC-MIC。抗生素敏感组和抗生素耐药组的C-D强度呈正态分布。

1. 绘制接收器工作特性（ROC）曲线，并评估0.60处的截止阈值。基于该临界值，可以定义SC-MIC作为抗生素疗效的指标，以确定代谢无活性和代谢活性组。
2. 为了定量分析SRS成像数据，绘制用连续稀释的抗生素浓度处理的每个细菌组的C-D信号强度直方图。彩色数据点代表不同的单个细菌。
3. 将抗生素治疗组的C-D强度标准化为未进行抗生素治疗的对照组的平均强度。通过使用0.60的临界值量化C-D区域的SRS信号强度与不同浓度的抗生素，确定不同细菌和抗生素组合的SC-MIC结果。
4. 验证SC-MIC读数并将其与使用常规肉汤微量稀释测定法测定的MIC进行比较。
5. 根据临床和实验室标准协会（CLSI），基于每种测试细菌菌株的SRS代谢成像结果的敏感性类别被解释为"敏感"，"耐药"或"中间"。

结果

孵育时间对氘掺入的影响是通过C-D（2070至2250 cm-1）和C-H（2，800至3，100 ^cm-1）区域的自发拉曼显微光谱法测量的（图4a）。在含有70%D 2 O的培养基中培养的铜绿假单胞菌的延时单细胞拉曼光谱显示CD/CH强度在孵育时间从0分钟增加到180分钟（图4b）单个微生物细胞中C-D丰度的增加表明D₂O被掺入细胞内的氘代生物分子中...

讨论

快速AST可以通过在样品到SC-MIC结果的2.5小时内使用单细胞SRS代谢成像评估细菌代谢活动对抗生素治疗的反应来获得。通过使用C-D键的SRS成像监测用于生物分子合成的D₂O的代谢掺入，可以检测细菌代谢活性和抗菌敏感性的反应。由于水在活细胞中无处不在，SRS代谢成像为快速AST提供了一种通用方法。快速AST方法适用于检测复杂生物环境中的细菌，例如尿液或全血在单个细菌水平上。SC-MIC可?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acousto-optic modulation	Gooch&Housego	R15180-1.06-LTD	Modulating stokes laser beam
Amoxicillin	Sigma Aldrich	A8523-5G
Bandpass filter	Chroma	HQ825/150m	Block the stokes laser beam before the photodiode
Calcium chloride	Sigma Aldrich	C1016-100G	Cation adjustment
Cation-adjusted Mueller-Hinton Broth	Fisher Scientific	B12322	Antimicrobial susceptibility testing of microorganisms by broth dilution methods
Centrifuge	Thermo Scientific	75002542
Cover Glasses	VWR	16004-318
Culture tube with snap cap	Fisher brand	149569B
Daptomycin	Acros	A0386346
Deuterium oxide		151882	Organic solvent to dissolve antibiotics
Deuterium oxide-d6	Sigma Aldrich	156914	Organic solvent as a standard to calibrate SRS imaging system
Escherichia coli BW 25113	The Coli Genetic Stock Center	7636
Eppendorf polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL	Fisher brand	05-408-129
Gentamicin sulfate	Sigma Aldrich	G4918
Hydrophilic Polyvinylidene Fluoride filters	Millipore-Sigma	SLSV025NB	pore size 5 µm
ImageJ software	NIH	Version: 2.0.0-rc-69/1.52t	Image processing and analysis
Incubating orbital shaker set at 37 °C	VWR	97009-890
Inoculation loop	Sigma	BR452201-1000EA
InSight DeepSee femtosecond pulsed laser	Spectra-Physics	Model: insight X3	Tunable laser source and fixed laser source at 1045 nm for SRS imaging
Lock-in amplifier	Zurich Instrument	HF2LI	Demodulate the SRS signals
Oil condenser	Olympus	U-AAC	NA 1.4
Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 (PAO1)	American Type Culture Collection	ATCC 47085
Photodiode	Hamamatsu	S3994-01	Detector
Polypropylene conical tube 15 mL	Falcon	14-959-53A
Polypropylene filters	Thermo Scientific	726-2520	pore size 0.2 µm
Sterile petri dishes	Corning	07-202-031
Syringe 10 mL	Fisher brand	14955459
UV/Vis Spectrophotometer	Beckman Coulter	Model: DU 530	Measuring optical density at wavelength of 600 nm
Vortex mixer	VWR	97043-562
Water objective	Olympus	UPLANAPO/IR	60×, NA 1.2