JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, D 2O metabolizmasının tek hücreli uyarılmış Raman saçılma görüntülemesi ile 2.5 saat içinde hızlı antimikrobiyal duyarlılık testi (AST) testi sunar. Bu yöntem, klinikte hızlı tek hücreli fenotipik AST için dönüştürücü olan idrar veya tam kan ortamındaki bakteriler için geçerlidir.

Özet

Antimikrobiyal dirençli enfeksiyonların yayılmasını yavaşlatmak ve önlemek için, patojenler üzerindeki antimikrobiyal etkileri nicel olarak belirlemek için hızlı antimikrobiyal duyarlılık testine (AST) acil ihtiyaç duyulmaktadır. AST'nin uzun süreli kültüre dayanan geleneksel yöntemlerle tamamlanması genellikle günler alır ve doğrudan klinik örnekler için çalışmazlar. Burada, döteryum oksit (D2O) metabolik katılımının uyarılmış Raman saçılması (SRS) görüntülemesi ile sağlanan hızlı bir AST yöntemi sunulmuştur. D2O'nun biyokütleye metabolik katılımı ve tek bakteri düzeyinde antibiyotiklere maruz kalındığında metabolik aktivite inhibisyonu SRS görüntüleme ile izlenir. Antibiyotiklere maruz kaldıktan sonra bakterilerin tek hücreli metabolizma inaktivasyon konsantrasyonu (SC-MIC), toplam 2.5 saatlik numune hazırlama ve tespitinden sonra elde edilebilir. Ayrıca, bu hızlı AST yöntemi, idrar veya tam kan gibi karmaşık biyolojik ortamlardaki bakteri örneklerine doğrudan uygulanabilir. Döteryum katılımının SRS metabolik görüntülemesi, klinikte hızlı tek hücreli fenotipik AST için dönüştürücüdür.

Giriş

Antimikrobiyal direnç (AMR), bulaşıcı hastalığın etkili tedavisi için büyüyen küresel bir tehdittir1. AMR'nin, antibiyotiğe dirençli bakterilerle mücadele için herhangi bir eylemde bulunulmaması durumunda 2050 yılına kadar yılda 10 milyon ölüme ve 100 trilyon dolarlık küresel GSYİH kaybına neden olacağı tahmin edilmektedir 1,2. Bu, antibiyotiğe dirençli bakterilerin ortaya çıkışını yavaşlatmak ve ilgili ölüm oranını azaltmak için enfeksiyöz bakterilerin antibiyotik duyarlılık testi (AST) için hızlı ve yenilikçi tanı yöntemlerine olan acil ihtiyacı vurgulamaktadır3. Mümkün olan en iyi klinik sonucu sağlamak için, 24 saat içinde etkili tedavinin uygulanması çok önemlidir. Bununla birlikte, disk difüzyonu veya et suyu seyreltme yöntemi gibi mevcut altın standart yöntem, klinik numuneler için ön inkübasyon prosedürü için genellikle en az 24 saat ve minimum inhibitör konsantrasyon (MIC) sonuçlarını elde etmek için ek 16-24 saat gerektirir. Genel olarak, bu yöntemler klinikte bulaşıcı hastalık tedavisi için acil bir karara rehberlik etmek için çok zaman alıcıdır ve bu da antimikrobiyal direncin ortaya çıkmasına ve yayılmasına yol açar4.

Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tabanlı teknikler5 gibi genotipik AST yöntemleri, hızlı tespit için geliştirilmiştir. Bu tür teknikler, hızlı AST sonuçları sağlamak için spesifik direnç genetik dizilerini ölçer. Zaman alıcı hücre kültürüne güvenmezler; Bununla birlikte, sadece direnci olan bilinen spesifik genetik diziler test edilir. Bu nedenle, uygulaması çeşitli bakteri türleri veya farklı direnç mekanizmaları ile sınırlıdır. Ayrıca, tedavi kararları için MIC sonuçları veremezler 6,7. Ayrıca, bu sınırlamaların üstesinden gelmek için yeni fenotipik yöntemler geliştirilmektedir8, mikroakışkan cihazlar 9,10,11,12,13, optik cihazlar14,15,16, nükleik asitlerin kopya numarası 17,18'i ölçen fenotipik AST ve Raman spektroskopik yöntemler 19, 20,21,22,23,24. Bu yöntemler AST sonuçlarını yönlendirmek için gereken süreyi kısaltır, ancak çoğu doğrudan klinik numunelere değil, yalnızca bakteriyel izolatlara uygulanabilir ve yine de uzun süreli ön inkübasyon gerektirir.

Bu çalışmada, SRS görüntüleme ile hücresel metabolik aktivitenin izlenmesi yoluyla idrar ve tam kandaki bakterilerin duyarlılığının hızlı bir şekilde belirlenmesi için bir yöntem sunuyoruz. Su (H2O), canlı hücrelerdeki temel biyomoleküler sentez süreçlerinin büyük çoğunluğunda yer alır. Bir su izotopologu olarak, NADPH'deki redoks-aktif hidrojen atomu ile D2O'daki D atomu arasındaki enzim katalizörlü H / D değişim reaksiyonu yoluyla, döteryum bir hücre25,26 içindeki biyokütleye dahil edilebilir. Deuterated yağ asidi sentez reaksiyonu, NADPH etiketli döteryum tarafından aracılık edilir. D2O'nun amino asitlerin (AA'lar) reaksiyonlarına dahil edilmesi, deuterated protein üretimi26 ile sonuçlanır (Şekil 1). Bu şekilde, tek mikrobiyal hücrelerde yeni sentezlenen C-D bağı içeren biyomoleküller, tespit edilecek genel bir metabolik aktivite belirteci olarak kullanılabilir. De novo sentezlenmiş C-D bağlarını okumak için, biyomoleküllerin spesifik ve kantitatif kimyasal bilgilerini sağlayan çok yönlü bir analitik araç olan Raman spektroskopisi, antimikrobiyal duyarlılığı belirlemek ve test süresini birkaç saate düşürmek için yaygın olarak kullanılmaktadır27,28,29,30 . Bununla birlikte, Raman saçılma işleminin doğal düşük verimliliği nedeniyle, spontan Raman spektroskopisi düşük algılama hassasiyetine sahiptir. Bu nedenle, spontan Raman spektroskopisi kullanarak gerçek zamanlı görüntü sonuçları elde etmek zordur. Tutarlı anti-Stokes Raman saçılması (CARS) ve uyarılmış Raman saçılması (SRS) dahil olmak üzere tutarlı Raman saçılması (CRS), spontan Raman spektroskopisininkinden daha büyük büyüklük sıraları üretmek için tutarlı ışık alanı nedeniyle yüksek algılama hassasiyetine ulaşmıştır, böylece tek hücre seviyesinde yüksek hızlı, spesifik ve kantitatif kimyasal görüntüleme 31,32,33,34,35 ,36,37,38,39.

Burada, en son çalışmamız40'a dayanarak, bakterilerin normal ortamda, idrarda ve tam kan ortamında tek hücre düzeyinde dahil edilmesinin femtosaniye SRS C-D görüntülemesi ilemetabolik aktivitenin ve antimikrobiyal duyarlılığın hızlı bir şekilde belirlenmesi için bir protokol sunuyoruz. Femtosaniye SRS görüntüleme, 2.5 saat içinde tek bakteri seviyesinde antibiyotiklere karşı tek hücre metabolizması inaktivasyon konsantrasyonunun (SC-MIC) izlenmesini kolaylaştırır. SC-MIC sonuçları, et suyu mikrodilüsyonu yoluyla standart MIC testi ile doğrulanır. Yöntemimiz, bakteri üriner sistem enfeksiyonu (İYE) ve kan dolaşımı enfeksiyonu (BSI) patojenlerinin antimikrobiyal duyarlılığını, geleneksel yönteme göre çok daha kısa bir tahlil süresi ile belirlemek için uygulanabilir olup, klinikte tek hücre düzeyinde hızlı fenotipik AST için fırsat yaratmaktadır.

Protokol

İnsan kan örneklerinin kullanımı, Boston Üniversitesi IRB ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) yönergelerine uygundur. Spesifik olarak, örnekler bir bankadan alınmıştır ve tamamen tanımlanmamıştır. Bu örnekler, Boston Üniversitesi'ndeki kurumsal inceleme kurulu (IRB) ofisi tarafından insan denekler olarak kabul edilmez.

1. Bakteri ve antibiyotik stok çözeltisinin hazırlanması

  1. Antibiyotik (gentamisin sülfat veya amoksisilin) stok çözeltisini, sterile1x fosfat tamponlu salin (PBS) veya 1.5 mL mikro tüplerde dimetil sülfoksit (DMSO) çözücü içinde çözünmüş 1 mg / mL konsantrasyonda hazırlayın. Gentamisin sülfatı steril PBS çözeltisinde ve amoksisilin steril DMSO çözücüde çözün. Bundan sonra, antibiyotik çözeltisini önerildiği gibi 2-8 ° C'de saklayın.
  2. Katyon ayarlı Mueller-Hinton Et Suyu (MHB) ortamı içeren D2 O yapmak için,% 100 D 2 O içeren ortam yapmak için 10 mL D2O'ya220mg MHB et suyu baz ekleyin. 200 nm gözenek boyutundaki filtrelerle filtreleyerek çözeltiyi sterilize edin.
    NOT: Bu protokolü her zaman sonraki adımlarda ortam çözeltileri yapmak ve sterilize etmek için kullanın.
  3. SRS görüntülemeye bakteri örnekleri hazırlamak için, steril bir yuvarlak tabanlı kültür tüpüne döteryum içermeyen 2 mL normal MHB ortamı ekleyin ve ardından 37 ° C'de önceden ısıtın.
  4. Triptik soya agar plakası üzerindeki taze kültürden bir bakteri (Escherichia coli BW 25113 veya Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085) kolonisi seçmek için steril bir döngü kullanın. Daha sonra önceden ısıtılmış kültür ortamında askıya alın ve bakteri süspansiyonunu hazırlamak için yavaşça vorteks.
  5. Logaritmik faza ulaşana kadar bakterileri 37 ° C'de bir çalkalayıcıda dakikada 200 devirde (rpm) inkübe edin.

2. D2O antibiyotik varlığında birleştirme tedavisi (Şekil 2a)

  1. Optik yoğunluğu (OD) 600 nm dalga boyunda bir fotometre ile ölçerek bakteri konsantrasyonunu kontrol edin.
  2. Bakteriyel çözeltiyi, döteryum içermeyen normal MHB ortamını kullanarak, 8 x 105 CFU / mL'lik bir nihai hücre konsantrasyonuna ulaşmak için seyreltin. Bakteri hücrelerini karıştırmak için yavaşça vorteks.
  3. Yedi adet 1.5 mL mikro tüpte bakteri çözeltisinin 300 μL alikotunu ve bir 1.5 mL mikro tüpte bakteriyel çözeltinin 600 μL alikotunu hazırlayın.
  4. Son antibiyotik konsantrasyonunu 8 μg / mL'ye çıkarmak için 600 μL bakteri çözeltisi içeren mikro tüpe 4.8 μL antibiyotik (gentamisin veya amoksisilin) stok çözeltisi (1 mg / mL) ekleyin.
  5. 8 μg / mL antibiyotik içeren bakteri çözeltisinden 300 μL çözelti alın ve iki kat seyreltilmiş antibiyotik (4 μg / mL) içeren bakteri çözeltisi yapmak için başka bir 300 μL bakteri çözeltisine ekleyin.
  6. Test antibiyotiklerinin, gentamisinin veya amoksisilinin iki kat seri seyreltilmesini, en düşük konsantrasyona (0.25 μg / mL) sahip mikro tüpe ulaşılana kadar tekrarlayın ve tüpten 300 μL'yi atın. Hem gentamisin hem de amoksisilin için, seri konsantrasyonlar 0.25 μg / mL - 8 μg / mL arasında değişmektedir.
    1. Boş kontrol için bir tüpü antibiyotiksiz bırakın. Bu, antibiyotik tedavisi olmadan ancak D2O tedavisi ile bakteriyel metabolik aktiviteyi incelemek için pozitif kontrol olacaktır.
    2. Negatif kontrol için bir tüpü antibiyotik veD2O olmadan bırakın.
  7. Bakteriyel alikotu 1 saat boyunca MHB ortamı içeren belirli antibiyotik (gentamisin veya amoksisilin) ile inkübe edin.
  8. Kuluçka sırasında, adım 2.6'da hazırlanan antibiyotiklerin aynı konsantrasyon gradyanı ile% 100D2O içeren ortam ile antibiyotiklerin seri seyreltilmesini hazırlayın. Hem gentamisin hem de amoksisilin için, seri konsantrasyonlar 0.25 μg / mL - 8 μg / mL arasında değişmektedir.
  9. 1 saatlik antibiyotik tedavisinden sonra, sırasıyla aynı antibiyotik konsantrasyonunda (adım 2.6'da hazırlanan) 300 μL antibiyotik ön işlemden geçirilmiş bakterilere 700 μL seri seyreltilmiş antibiyotik ve% 100 D2O içeren MHB ortamı ekleyin.
    1. Örneğin, 8 μg / mL antibiyotik ön işlemden geçirilmiş bakterilerin 300 μL'sine 700 μL% 100 D2O içeren MHB ortamı (8 μg / mL antibiyotik içeren) ekleyin. Aynı şekilde, bir sonraki konsantrasyonun karşılık gelen tüplerine aktarın ve birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek, homojenize edin.
    2. Boş bir kontrol olarak 700 μL antibiyotiksiz% 100 D 2O içeren MHB ortamına 300 μL antibiyotiksiz bakteri (adım 2.6.1'de hazırlanmıştır) ekleyin.
    3. 37 ° C'de 200 rpm'de bir inkübasyon çalkalayıcısında 30 dakika daha inkübe edin.
      NOT: Bu adımda, test için ortamdaki son D2O konsantrasyonu% 70'tir.
  10. İlk önce 1 mL antibiyotik ve D2 O ile muamele edilmiş bakteri örneğini6200 x g'de 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüj edin ve ardından iki kez arıtılmış suyla yıkayın. Son olarak, numuneleri% 10 formalin çözeltisine sabitleyin ve 4 ° C'de saklayın.

3. İdrar ortamında bakteri hazırlanması (Şekil 2b)

  1. E. coli BW 25113'ü logaritmik fazda hazırlamak için, 1.4 ve 1.5'teki adımları izleyin.
  2. OD'yi 600 nm dalga boyunda bir fotometre ile ölçerek bakteri konsantrasyonunu kontrol edin.
  3. Klinik İYE örneklerini14,18,41 taklit etmek için, E. coli çözeltisini 10 mL tanımlanmamış idrara yükselterek 106 CFU / mL'lik bir nihai hücre konsantrasyonuna ulaşın.
  4. E. coli çivili idrarını 5 μm'lik bir filtre kullanarak filtreleyin ve ardından bakteri çözeltisini 300 μL alikotlarda yedi adet 1.5 mL mikro tüpe ve bakteri çözeltisinin 600 μL alikotunu bir 1.5 mL mikro tüpte bölün.
  5. D2 Obirleştirme tedavisini, 2.4'ten 2.10'a kadar önceki adımlarda açıklandığı gibi antibiyotik varlığında ve örnek toplama işleminde gerçekleştirin.

4. Kan ortamında bakterilerin hazırlanması (Şekil 2c)

  1. Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085'i logaritmik fazda hazırlamak için 1.4 ve 1.5'teki adımları izleyin.
  2. Klinik kan dolaşımı enfeksiyonlarını taklit etmek için42,43 örnek, 107 CFU / mL'lik bir konsantrasyona ulaşmak için 1 mL'lik tanımlanmamış insan kanındaki spike P. aeruginosa.
  3. Kanı lize etmek için 9 mL steril arıtılmış su ekleyin.
  4. P. aeruginosa çivili kanını 5 μm filtre kullanarak filtreleyin. Daha sonra bakterileri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 6200 x g'de santrifüjleme ile 1 mL hacme kadar hasat edin.  Bakteri çözeltisine 9 mL önceden ısıtılmış normal MHB ekleyin ve hafifçe vorteks yapın. Bakterilerin son konsantrasyonu 106 CFU / mL'dir
  5. P. aeruginosa çivili kan çözeltisini 300 μL alikotta yedi adet 1.5 mL mikro tüpe ve bakteri çözeltisinin 600 μL alikotunu bir 1.5 mL mikro tüpte bölün.
  6. D2 Obirleştirme tedavisini, 2.4'ten 2.10'a kadar önceki adımlarda açıklandığı gibi antibiyotik varlığında ve örnek toplama işleminde gerçekleştirin.

5. Tek bir bakterideD2O metabolik birleşmesinin SRS görüntülemesi

  1. 1 mL sabit bakteri çözeltisini arıtılmış suyla yıkayın ve ardından 4 ° C'de 5 dakika boyunca 6200 x g'de santrifüj yapın. Süper natantı çıkarın. Bakteriyel çözeltiyi yaklaşık 20 μL'ye zenginleştirin.
  2. Bakteriyel çözeltiyi poli-L-lizin kaplı bir kapak camı üzerine koyun. SRS görüntüleme için numuneyi sandviç haline getirin ve kapatın.
  3. SRS mikroskobu kullanılarak 2168 cm-1'de C-D titreşim frekansındaki bakterileri görüntüleyin.
    1. Bir bilgisayardaki kontrol yazılımını kullanarak pompa dalga boyunu 852 nm'ye girin ve ayarlayın.
    2. Bir güç ölçer kullanarak lazer gücünü ölçün. Lazer çıkışının önündeki yarım dalga plakasını ayarlayarak numunedeki pompa lazerinin gücünü ~8 mW'a ve numunedeki Stokes lazerinin gücünü ~40 mW'a ayarlayın.
      NOT: SRS mikroskobunda, 80 MHz tekrarlama hızına sahip ayarlanabilir bir femtosaniye lazer, pompa (680 ila 1300 nm) ve Stokes (1045 nm) uyarma lazerlerini sağlar.
  4. Yansıma aynalarının vidalarını ayarlayarak, pompayı ve Stokes ışınlarını uzamsal olarak hizalayın ve iki kirişi lazer tarama için 2D galvo ayna sistemi ile donatılmış dik bir mikroskopa yönlendirin.
    1. Pompayı ve Stokes lazerlerini numuneye odaklamak için 60x suya daldırma hedefi kullanın.
    2. Numuneden gelen sinyalleri ileri yönde toplamak için bir yağ kondenseri kullanın.
    3. Stokes lazerini bir fotodiyota yönlendirmeden önce filtrelemek için bir bandpass filtresi kullanın.
    4. Uyarılan Raman sinyalini kilitli bir amplifikatör ile çıkarın ve sinyalleri fotodiyot ile tespit edin.
  5. Her SRS görüntüsünü, yazılımın kontrol panelinde 200 x 200 piksel ve piksel bekleme süresini 30 μs içerecek şekilde ayarlayın. Bir görüntü için toplam edinme süresi ~ 1,2 sn'dir. Adım boyutunu 150 nm olarak ayarlayın, böylece görüntü boyutu yaklaşık 30 x 30 μm2'dir. Her örnek için en az üç görüntüleme alanı görüntüleyin.

6. Görüntü işleme ve veri analizi ( Şekil 3)

  1. Ortalama C-D sinyal yoğunluğunu elde etmek için SRS görüntülerini ImageJ yazılımıyla açın ve işleyin.
  2. İlk olarak, Görüntü |'ni tıklatarak SRS görüntülerini ters renkli 8 bit türünde görüntülere dönüştürün Tip | 8 bit ve ardından | Düzenle ImageJ yazılımındaki düğmeleri tersine çevirin.
  3. Ardından, İşlem | tıklatarak Gauss bulanıklığına sahip görüntüleri filtreleyin Filtreler | Gauss bulanıklaştırma düğmelerini kullanın ve Sigma'yı (Yarıçap) 1 olarak ayarlayın.
  4. Bakteri alanını seçmek için görüntü eşiği ayarını kullanın. Resim |'e tıklayın | ayarlama Seçilen bakteri boyutlarının orijinal SRS görüntülerindekilerle eşleştiğinden emin olmak için eşik. Parçacıkları belirlemek için boyut eşiğini ayarlayarak küçük parçacıkları ortadan kaldırın. Apply'ı (Uygula) tıklayın.
  5. Analyze |'ı Uygula Bakterilerin alanını etiketlemek ve belirlemek için Partikül Analizi düğmeleri.
  6. YG yöneticisindeki Tümünü Göster düğmesini özgün işlenmemiş SRS görüntüsüne tıklatarak, aynı bakteri alanını etiketleyin, YG yöneticisindeki Ölç düğmesini tıklatarak her veri noktasının ortalama yoğunluğunu belirleyin.
  7. Orijinal SRS görüntüsündeki arka plan alanını daire içine alın ve arka planın ortalama yoğunluğunu ölçün. Her bakterinin ortalama C-D yoğunlukları, arka plan sinyal yoğunluğu düşülerek elde edilir.

7. SC-MIC ile antimikrobiyal duyarlılığın kantitasyonu

NOT: SC-MIC'yi belirlemek için 0,60'taki kesme değeri, çeşitli konsantrasyonlarda ilaca maruz kalma40 üzerine bakteriler için metabolizma-aktif ve metabolizma-inhibe edilmiş koşulların SRS C-D yoğunluklarının istatistiksel analizine göre belirlenir. Antibiyotiğe duyarlı ve antibiyotiğe dirençli gruplar için C-D yoğunlukları normal dağılımla donatıldı.

  1. Alıcı çalışma karakteristiği (ROC) eğrisini çizin ve kesme eşiğini 0,60'ta değerlendirin. Bu kesme değerine dayanarak, antibiyotiklerin etkinliğinin bir göstergesi olarak SC-MIC, metabolik olarak inaktif ve metabolik olarak aktif grubu belirlemek için tanımlanabilir.
  2. SRS görüntüleme verilerini kantitatif olarak analiz etmek için, seri olarak seyreltilmiş antibiyotik konsantrasyonu ile tedavi edilen her bakteri grubu için C-D sinyal yoğunluklarının histogramlarını çizin. Renkli veri noktaları farklı bireysel bakterileri temsil eder.
  3. Antibiyotik tedavisi uygulanan grubun C-D yoğunluklarını, antibiyotik tedavisi olmadan kontrol grubunun ortalama yoğunluğuna normalleştirin. C-D bölgesindeki SRS sinyal yoğunluklarını 0.60'taki kesme değerini kullanarak çeşitli antibiyotik konsantrasyonlarına karşı ölçerek farklı bakteri ve antibiyotik kombinasyonlarının SC-MIC sonuçlarını belirleyin.
  4. SC-MIC okumasını, geleneksel et suyu mikrodilüsyon testi kullanılarak belirlenen MIC ile doğrulayın ve karşılaştırın.
  5. Klinik ve Laboratuvar Standartları Enstitüsü'ne (CLSI) göre, test edilen her bakteri suşu için SRS metabolik görüntüleme sonuçlarına dayanan duyarlılık kategorisi "duyarlı", "dirençli" veya "orta" olarak yorumlanmaktadır.

Sonuçlar

Kuluçka süresinin döteryum infüzyonu üzerindeki etkisi, C-D (2070 ila 2250 cm-1) ve C-H (2.800 ila 3.100 cm-1) bölgesindeki spontan Raman mikrospektroskopisi ile ölçülür (Şekil 4a). % 70 D2O içeren orta maddede kültürlenen P. aeruginosa'nın hızlandırılmış tek hücreli Raman spektrumu, kuluçka süresi boyunca CD / CH yoğunluğunu 0'dan 180 dakikaya çıkardığını göstermektedir. (Şekil 4b) Tek m...

Tartışmalar

Hızlı AST, tek hücreli SRS metabolik görüntüleme kullanılarak antibiyotik tedavisine bakteriyel metabolik aktivitenin yanıtının numuneden SC-MIC sonuçlarına 2,5 saat içinde değerlendirilmesiyle elde edilebilir. Bakteriyel metabolik aktivitenin ve antimikrobiyal duyarlılığın yanıtı, C-D bağlarının SRS görüntülemesi kullanılarak biyomolekül sentezi için D2O'nun metabolik katılımının izlenmesiyle tespit edilebilir. Su, canlı hücrelerde her yerde kullanıldığından, SRS metabol...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma J.-X.C ve M.S.'ye NIH R01AI141439 ve J.-X.C.'ye R35GM136223 tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Acousto-optic modulationGooch&HousegoR15180-1.06-LTDModulating stokes laser beam
AmoxicillinSigma AldrichA8523-5G
Bandpass filterChromaHQ825/150mBlock the stokes laser beam before the photodiode
Calcium chlorideSigma AldrichC1016-100GCation adjustment
Cation-adjusted Mueller-Hinton BrothFisher ScientificB12322Antimicrobial susceptibility testing of microorganisms by broth dilution methods
CentrifugeThermo Scientific75002542
Cover GlassesVWR16004-318
Culture tube with snap capFisher brand149569B
DaptomycinAcrosA0386346
Deuterium oxide151882Organic solvent to dissolve antibiotics
Deuterium oxide-d6Sigma Aldrich156914Organic solvent as a standard to calibrate SRS imaging system
Escherichia coli BW 25113The Coli Genetic Stock Center7636
Eppendorf polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mLFisher brand05-408-129
Gentamicin sulfateSigma AldrichG4918
Hydrophilic Polyvinylidene Fluoride filtersMillipore-SigmaSLSV025NBpore size 5 µm
ImageJ softwareNIHVersion: 2.0.0-rc-69/1.52tImage processing and analysis
Incubating orbital shaker set at 37 °CVWR97009-890
Inoculation loopSigmaBR452201-1000EA
InSight DeepSee femtosecond pulsed laserSpectra-PhysicsModel: insight X3Tunable laser source and fixed laser source at 1045 nm for SRS imaging
Lock-in amplifierZurich InstrumentHF2LIDemodulate the SRS signals
Oil condenserOlympusU-AACNA 1.4
Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 (PAO1)American Type Culture CollectionATCC 47085
PhotodiodeHamamatsuS3994-01Detector
Polypropylene conical tube 15 mLFalcon14-959-53A
Polypropylene filtersThermo Scientific726-2520pore size 0.2 µm
Sterile petri dishesCorning07-202-031
Syringe 10 mLFisher brand14955459
UV/Vis SpectrophotometerBeckman CoulterModel: DU 530Measuring optical density at wavelength of 600 nm
Vortex mixerVWR97043-562
Water objectiveOlympusUPLANAPO/IR60×, NA 1.2

Referanslar

  1. O'Neill, J. Tackling drug-resistant infections globally: final report and recommendations. The review on Antimicrobial Resistance. , (2016).
  2. Sugden, R., Kelly, R., Davies, S. Combatting antimicrobial resistance globally. Nature Microbiology. 1 (10), 16187 (2016).
  3. Kumar, A., et al. Duration of hypotension before initiation of effective antimicrobial therapy is the critical determinant of survival in human septic shock. Critical Care Medicine. 34 (6), 1589-1596 (2006).
  4. Reller, L. B., Weinstein, M., Jorgensen, J. H., Ferraro, M. J. Antimicrobial susceptibility testing: a review of general principles and contemporary practices. Clinical Infectious Diseases. 49 (11), 1749-1755 (2009).
  5. Frickmann, H., Masanta, W. O., Zautner, A. E. Emerging rapid resistance testing methods for clinical microbiology laboratories and their potential impact on patient management. BioMed Research International. 2014, 375681 (2014).
  6. Avesar, J., et al. Rapid phenotypic antimicrobial susceptibility testing using nanoliter arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (29), 5787-5795 (2017).
  7. Schoepp, N. G., et al. Digital quantification of DNA replication and chromosome segregation enables determination of antimicrobial susceptibility after only 15 minutes of antibiotic exposure. Angewandte Chemie International Edition. 55 (33), 9557-9561 (2016).
  8. van Belkum, A., et al. Innovative and rapid antimicrobial susceptibility testing systems. Nature Reviews Microbiology. 18 (5), 299-311 (2020).
  9. Hou, Z., An, Y., Hjort, K., Sandegren, L., Wu, Z. Time lapse investigation of antibiotic susceptibility using a microfluidic linear gradient 3D culture device. Lab on a Chip. 14 (17), 3409-3418 (2014).
  10. Choi, J., et al. Rapid antibiotic susceptibility testing by tracking single cell growth in a microfluidic agarose channel system. Lab on a Chip. 13 (2), 280-287 (2013).
  11. Lu, Y., et al. Single cell antimicrobial susceptibility testing by confined microchannels and electrokinetic loading. Analytical Chemistry. 85 (8), 3971-3976 (2013).
  12. Kim, S. C., Cestellosblanco, S., Inoue, K., Zare, R. N. Miniaturized antimicrobial susceptibility test by combining concentration gradient generation and rapid cell culturing. Antibiotics. 4 (4), 455-466 (2015).
  13. Choi, J., et al. A rapid antimicrobial susceptibility test based on single-cell morphological analysis. Science Translational Medicine. 6 (267), (2014).
  14. Baltekin, &. #. 2. 1. 4. ;., Boucharin, A., Tano, E., Andersson, D. I., Elf, J. Antibiotic susceptibility testing in less than 30 min using direct single-cell imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (34), 9170-9175 (2017).
  15. Fredborg, M., et al. Real-time optical antimicrobial susceptibility testing. Journal of Clinical Microbiology. 51 (7), 2047-2053 (2013).
  16. Choi, J., et al. A rapid antimicrobial susceptibility test based on single-cell morphological analysis. Science Translational Medicine. 6 (267), (2014).
  17. Barczak, A. K., Hung, D. T. RNA signatures allow rapid identification of pathogens and antibiotic susceptibilities. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (16), 6217-6222 (2012).
  18. Schoepp, N. G., et al. Rapid pathogen-specific phenotypic antibiotic susceptibility testing using digital LAMP quantification in clinical samples. Science Translational Medicine. 9 (410), (2017).
  19. Novelli-Rousseau, A., et al. Culture-free antibiotic-susceptibility determination from single-bacterium Raman spectra. Scientific Reports. 8 (1), 1-12 (2018).
  20. Schröder, U. -. C., et al. Detection of vancomycin resistances in enterococci within 3 1/2 hours. Scientific Reports. 5, 8217 (2015).
  21. Liu, C. -. Y., et al. Rapid bacterial antibiotic susceptibility test based on simple surface-enhanced Raman spectroscopic biomarkers. Scientific Reports. 6 (1), 1-15 (2016).
  22. Chang, K. -. W., et al. Antibiotic susceptibility test with surface-enhanced raman scattering in a microfluidic system. Analytical Chemistry. 91 (17), 10988-10995 (2019).
  23. Galvan, D. D., Yu, Q. surface-enhanced raman scattering for rapid detection and characterization of antibiotic-resistant bacteria. Advanced Healthcare Materials. 7 (13), 1701335 (2018).
  24. Kirchhoff, J., et al. Simple ciprofloxacin resistance test and determination of minimal inhibitory concentration within 2 h using raman spectroscopy. Analytical Chemistry. 90 (3), 1811-1818 (2018).
  25. Zhang, Z., Chen, L., Liu, L., Su, X., Rabinowitz, J. D. Chemical basis for deuterium labeling of fat and NADPH. Journal of the American Chemical Society. 139 (41), 14368-14371 (2017).
  26. Shi, L., et al. Optical imaging of metabolic dynamics in animals. Nature Communications. 9 (1), 2995 (2018).
  27. Berry, D., et al. Tracking heavy water (D2O) incorporation for identifying and sorting active microbial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (2), 194-203 (2015).
  28. Tao, Y., et al. Metabolic-activity-based assessment of antimicrobial effects by D2O-labeled single-cell raman microspectroscopy. Analytical Chemistry. 89 (7), 4108-4115 (2017).
  29. Yang, K., et al. Rapid antibiotic susceptibility testing of pathogenic bacteria using heavy water-labeled single-cell raman spectroscopy in clinical samples. Analytical Chemistry. 91 (9), 6296-6303 (2019).
  30. Song, Y., et al. Raman-Deuterium Isotope Probing for in-situ identification of antimicrobial resistant bacteria in Thames River. Scientific reports. 7 (1), 16648 (2017).
  31. Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  32. Cheng, J. -. X., Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 350 (6264), (2015).
  33. Zhang, C., Zhang, D., Cheng, J. -. X. Coherent Raman scattering microscopy in biology and medicine. Annual Review of Biomedical Engineering. 17, 415-445 (2015).
  34. Yue, S., Cheng, J. -. X. Deciphering single cell metabolism by coherent Raman scattering microscopy. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 46-57 (2016).
  35. Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
  36. Ji, M., et al. Rapid, Label-free detection of brain tumors with stimulated Raman scattering microscopy. Science Translational Medicine. 5 (201), (2013).
  37. He, R., Liu, Z., Xu, Y., Huang, W., Ma, H., Ji, M. Stimulated Raman scattering microscopy and spectroscopy with a rapid scanning optical delay line. Optics Letters. 42 (4), 659-662 (2017).
  38. Suzuki, Y., et al. Label-free chemical imaging flow cytometry by high-speed multicolor stimulated Raman scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (32), 15842-15848 (2019).
  39. Camp, C. H., et al. High-Speed Coherent Raman Fingerprint Imaging of Biological Tissues. Nature Photonics. 8, 627-634 (2014).
  40. Zhang, M., et al. Rapid determination of antimicrobial susceptibility by stimulated raman scattering imaging of D2O metabolic incorporation in a single bacterium. Advanced Science. 7 (19), 2001452 (2020).
  41. Michael, I., et al. A fidget spinner for the point-of-care diagnosis of urinary tract infection. Nature Biomedical Engineering. 4 (6), 591-600 (2020).
  42. Bhattacharyya, R. P., et al. Simultaneous detection of genotype and phenotype enables rapid and accurate antibiotic susceptibility determination. Nature Medicine. 25 (12), 1858-1864 (2019).
  43. Stupar, P., et al. Nanomechanical sensor applied to blood culture pellets: a fast approach to determine the antibiotic susceptibility against agents of bloodstream infections. Clinical Microbiology and Infection. 23 (6), 400-405 (2017).
  44. Barber, A. E., Norton, J. P., Spivak, A. M., Mulvey, M. A. Urinary Tract Infections: Current and Emerging Management Strategies. Clinical Infectious Diseases. 57 (5), 719-724 (2013).
  45. Cohen, J., et al. Sepsis: a roadmap for future research. The Lancet Infectious Diseases. 15 (5), 581-614 (2015).
  46. Choi, J., et al. rapid antimicrobial susceptibility test from positive blood cultures based on microscopic imaging analysis. Scientific Reports. 7 (1), 1148 (2017).
  47. Gherardi, G., et al. Comparative evaluation of the Vitek-2 Compact and Phoenix systems for rapid identification and antibiotic susceptibility testing directly from blood cultures of Gram-negative and Gram-positive isolates. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 72 (1), 20-31 (2012).
  48. Machen, A., Drake, T., Wang, Y. F. Same day identification and full panel antimicrobial susceptibility testing of bacteria from positive blood culture bottles made possible by a combined lysis-filtration method with MALDI-TOF VITEK mass spectrometry and the VITEK2 system. Plos One. 9, 87870 (2014).
  49. Simon, L., et al. Direct identification of 80 percent of bacteria from blood culture bottles by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry using a 10-minute extraction protocol. Journal of Clinical Microbiology. 57 (2), 01278 (2019).
  50. Leekha, S., Terrell, C. L., Edson, R. S. General principles of antimicrobial therapy. Mayo Clinic Proceedings. 86 (2), 156-167 (2011).
  51. Johnson, L., et al. Emergence of fluoroquinolone resistance in outpatient urinary Escherichia coli isolates. The American Journal of Medicine. 121 (10), 876-884 (2008).
  52. Van Belkum, A., et al. Developmental roadmap for antimicrobial susceptibility testing systems. Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 51-62 (2019).
  53. Dubourg, G., Lamy, B., Ruimy, R. Rapid phenotypic methods to improve the diagnosis of bacterial bloodstream infections: meeting the challenge to reduce the time to result. Clinical Microbiology and Infection. 24 (9), 935-943 (2018).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyolojiSay 180

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır