Test rapidi di sensibilità antimicrobica mediante imaging Raman scattering stimolato dell'incorporazione del deuterio in un singolo batterio

Riepilogo

Questo protocollo presenta test rapidi di suscettibilità antimicrobica (AST) entro 2,5 ore mediante imaging Raman scattering stimolato da singole cellule del metabolismo di D₂O. Questo metodo si applica ai batteri nelle urine o nell'ambiente del sangue intero, che è trasformativo per l'AST fenotipico a singola cellula rapida nella clinica.

Abstract

Per rallentare e prevenire la diffusione di infezioni resistenti agli antimicrobici, è urgente determinare quantitativamente gli effetti antimicrobici sugli agenti patogeni. In genere ci vogliono giorni per completare l'AST con metodi convenzionali basati sulla cultura a lungo termine e non funzionano direttamente per i campioni clinici. Qui, riportiamo un rapido metodo AST abilitato dall'imaging di scattering Raman stimolato (SRS) dell'incorporazione metabolica dell'ossido di deuterio (D₂O). L'incorporazione metabolica di D₂O nella biomassa e l'inibizione dell'attività metabolica in seguito all'esposizione agli antibiotici a livello di singolo batterio sono monitorate mediante imaging SRS. La concentrazione di inattivazione del metabolismo a singola cellula (SC-MIC) dei batteri dopo l'esposizione agli antibiotici può essere ottenuta dopo un totale di 2,5 ore di preparazione e rilevamento del campione. Inoltre, questo rapido metodo AST è direttamente applicabile a campioni batterici in ambienti biologici complessi, come l'urina o il sangue intero. L'imaging metabolico SRS dell'incorporazione del deuterio è trasformativo per l'AST fenotipico a singola cellula rapida nella clinica.

Introduzione

La resistenza antimicrobica (AMR) è una crescente minaccia globale per il trattamento efficace delle malattie infettive¹. Si prevede che la resistenza antimicrobica causerà ulteriori 10 milioni di morti all'anno e una perdita di PIL globale di 100 trilioni di dollari entro il 2050 se non verrà intrapresa alcuna azione per combattere i batteri resistenti agli antibiotici ^1,2. Ciò sottolinea l'urgente necessità di metodi diagnostici rapidi e innovativi per i test di sensibilità agli antibiotici (AST) dei batteri infettivi per rallentare la comparsa di batteri resistenti agli antibiotici e ridurre il relativo tasso di mortalità³. Per garantire il miglior risultato clinico possibile, è fondamentale introdurre una terapia efficace entro 24 ore. Tuttavia, l'attuale metodo gold standard, come la diffusione del disco o il metodo di diluizione del brodo, di solito richiede almeno 24 ore per la procedura di preincubazione per i campioni clinici e ulteriori 16-24 ore per ottenere i risultati della concentrazione inibitoria minima (MIC). Nel complesso, questi metodi richiedono troppo tempo per guidare una decisione immediata per il trattamento delle malattie infettive nella clinica, che porta alla comparsa e alla diffusione della resistenza antimicrobica⁴.

I metodi genotipici AST, come le tecniche basate sulla reazione a catena della polimerasi (PCR)⁵, sono stati sviluppati per una rapida rilevazione. Tali tecniche misurano le sequenze genetiche specifiche di resistenza al fine di fornire risultati rapidi AST. Non si basano su colture cellulari dispendiose in termini di tempo; Tuttavia, vengono testate solo specifiche sequenze genetiche note con resistenza. Pertanto, la sua applicazione è limitata a varie specie batteriche o diversi meccanismi di resistenza. Inoltre, non possono fornire risultati MIC per le decisioni terapeutiche ^6,7. Inoltre, sono in fase di sviluppo nuovi metodi fenotipici per l'AST rapida per superare queste limitazioni⁸, compresi i dispositivi microfluidici 9,10,11,12,13, i dispositivi ottici^14,15,16, l'AST fenotipico che quantifica il numero di copia degli acidi nucleici^17,18 e i metodi spettroscopici Raman ^19, 20,21,22,23,24. Questi metodi riducono il tempo per guidare i risultati AST, tuttavia, la maggior parte di essi sono applicabili solo agli isolati batterici, non direttamente ai campioni clinici, e richiedono ancora una preincubazione a lungo termine.

In questo lavoro, presentiamo un metodo per determinare rapidamente la suscettibilità dei batteri nelle urine e nel sangue intero attraverso il monitoraggio dell'attività metabolica cellulare mediante imaging SRS. L'acqua (H₂O) partecipa alla stragrande maggioranza dei processi essenziali di sintesi biomolecolare nelle cellule viventi. Come isotopologo dell'acqua, attraverso la reazione di scambio H/D catalizzata da enzimi tra l'atomo di idrogeno redox-attivo in NADPH e l'atomo D in D₂O, il deuterio può essere incorporato nella biomassa all'interno di una cellula^25,26. Una reazione di sintesi degli acidi grassi deuterati è mediata dal deuterio marcato NADPH. L'incorporazione di D₂O nelle reazioni degli amminoacidi (AA) provoca la produzione di proteine deuterate²⁶ (Figura 1). In questo modo, le biomolecole contenenti legami C-D appena sintetizzate in singole cellule microbiche possono essere impiegate come marcatore di attività metabolica generale da rilevare. Per leggere i legami C-D sintetizzati de novo, la spettroscopia Raman, uno strumento analitico versatile che fornisce informazioni chimiche specifiche e quantitative delle biomolecole, è ampiamente utilizzata per determinare la suscettibilità antimicrobica e ridurre significativamente il tempo di test a poche ore^27,28,29,30 . Tuttavia, a causa della bassa efficienza intrinseca del processo di scattering Raman, la spettroscopia Raman spontanea è di bassa sensibilità di rivelazione. Pertanto, è difficile ottenere risultati di immagini in tempo reale utilizzando la spettroscopia Raman spontanea. Lo scattering Raman coerente (CRS), incluso lo scattering Raman coerente anti-Stokes (CARS) e lo scattering Raman stimolato (SRS), ha raggiunto un'elevata sensibilità di rivelazione a causa del campo luminoso coerente per generare ordini di grandezza più grandi di quello della spettroscopia Raman spontanea, rendendo così l'imaging chimico ad alta velocità, specifico e quantitativo a livello di singola cellula 31,32,33,34,35 ,^36,37,38,39.

Qui, sulla base del nostro lavoro più recente⁴⁰, presentiamo un protocollo per la determinazione rapida dell'attività metabolica e della suscettibilità antimicrobica mediante imaging SRS C-D a femtosecondi dell'incorporazione di D₂O di batteri nel mezzo normale, nelle urine e nell'ambiente del sangue intero a livello di singola cellula. L'imaging SRS a femtosecondi facilita il monitoraggio della concentrazione di inattivazione del metabolismo a singola cellula (SC-MIC) contro gli antibiotici a livello di singolo batterio entro 2,5 ore. I risultati SC-MIC sono convalidati dal test MIC standard tramite microdiluizione del brodo. Il nostro metodo è applicabile per determinare la suscettibilità antimicrobica dei batteri infezione del tratto urinario (UTI) e dell'infezione del flusso sanguigno (BSI) patogeni con un tempo di analisi molto ridotto rispetto al metodo convenzionale, che apre l'opportunità di una rapida AST fenotipica nella clinica a livello di singola cellula.

Protocollo

L'uso di campioni di sangue umano è conforme alle linee guida dell'IRB della Boston University e del National Institutes of Health (NIH). Nello specifico, gli esemplari provengono da una banca e sono completamente deidentificati. Questi esemplari non sono considerati soggetti umani dall'ufficio dell'Institutional Review Board (IRB) della Boston University.

1. Preparazione di batteri e antibiotici soluzione madre

1. Preparare la soluzione madre di antibiotici (gentamicina solfato o amoxicillina) ad una concentrazione di 1 mg/ml disciolta in soluzione salina sterile1x tamponata fosfato (PBS) o dimetilsolfossido (DMSO) in microprovette da 1,5 ml. Sciogliere gentamicina solfato in soluzione sterile di PBS e amoxicillina in solvente DMSO sterile. Successivamente, conservare la soluzione antibiotica a 2-8 °C come suggerito.
2. Per_{produrre supporti di}brodo Mueller-Hinton (MHB) contenenti cationi aggiustati, aggiungere 220 mg di base di brodo MHB a 10 ml di D 2 O per ottenere il 100% di terreno contenente D₂O. Sterilizzare la soluzione filtrando con filtri di dimensione dei pori di 200 nm.
   NOTA: utilizzare sempre questo protocollo per la produzione e la sterilizzazione di soluzioni medie in ulteriori passaggi.
3. Per preparare campioni batterici per l'imaging SRS, aggiungere 2 ml di normale mezzo MHB, che non contiene deuterio, a una provetta di coltura sterile a fondo rotondo, quindi preriscaldarla a 37 °C.
4. Utilizzare un'ansa sterile per selezionare una colonia batterica (Escherichia coli BW 25113 o Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085) dalla coltura fresca su una piastra di agar di soia triptica. Quindi sospenderlo nei terreni di coltura preriscaldati e vortice delicatamente per preparare la sospensione batterica.
5. Incubare i batteri a 37 °C in uno shaker a 200 giri al minuto (rpm) fino a raggiungere la fase logaritmica.

2. D₂Trattamento di incorporazione in presenza di antibiotici (Figura 2a)

1. Controllare la concentrazione batterica misurando la densità ottica (OD) con un fotometro ad una lunghezza d'onda di 600 nm.
2. Diluire la soluzione batterica utilizzando il normale mezzo MHB, che non contiene deuterio, per raggiungere una concentrazione cellulare finale di 8 x 10⁵ CFU/ml. Vortice delicatamente per mescolare le cellule batteriche.
3. Preparare 300 μL di aliquote della soluzione batterica in sette micro provette da 1,5 mL e 600 μL di aliquote della soluzione batterica in una micro provetta da 1,5 ml.
4. Aggiungere 4,8 μL di soluzione madre di antibiotico (gentamicina o amoxicillina) (1 mg/ml) nel microtubo contenente 600 μL della soluzione batterica, per ottenere la concentrazione finale di antibiotico a 8 μg/ml.
5. Prelevare 300 μL di soluzione dagli 8 μg/ml di soluzione batterica contenente antibiotici e aggiungerli ad altri 300 μL di soluzione batterica, per ottenere una soluzione antibiotica diluita due volte (4 μg/ml) contenente batteri.
6. Ripetere la doppia diluizione seriale degli antibiotici in esame, gentamicina o amoxicillina, fino a raggiungere il microtubo con la concentrazione più bassa (0,25 μg/ml) ed eliminare 300 μL dalla provetta. Sia per la gentamicina che per l'amoxicillina, le concentrazioni seriali vanno da 0,25 μg/ml a 8 μg/ml.
   1. Lasciare un tubo senza antibiotici per il controllo in bianco. Questo sarà il controllo positivo per ispezionare l'attività metabolica batterica senza trattamento antibiotico ma con trattamento D₂O.
   2. Lasciare un tubo senza antibiotici e senza D₂O per il controllo negativo.
7. Incubare l'aliquota batterica con l'antibiotico specifico (gentamicina o amoxicillina) contenente terreno MHB per 1 ora.
8. Durante l'incubazione, preparare una diluizione seriale di antibiotici con terreno contenente D 2 O al 100% con lo stesso gradiente di concentrazione degli antibiotici preparato nella fase_2.6. Sia per la gentamicina che per l'amoxicillina, le concentrazioni seriali vanno da 0,25 μg/ml a 8 μg/ml.
9. Dopo 1 ora di trattamento antibiotico, aggiungere 700 μL di antibiotico diluito in serie e terreno MHB contenente 100% D 2 O ai 300 μL di batteri pretrattati con antibiotico nella stessa concentrazione di antibiotico (preparati nella fase_2.6), rispettivamente.
   1. Ad esempio, aggiungere 700 μL di mezzo MHB contenente 100% D₂O (contenente 8 μg/ml di antibiotico) ai 300 μL di 8 μg/mL di batteri pretrattati con antibiotici. Allo stesso modo, trasferire ai tubi corrispondenti della concentrazione successiva e omogeneizzare pipettando su e giù più volte.
   2. Aggiungere 700 μL di terreno MHB 100% D 2 Oprivo di antibiotici a 300 μL di batteri privi di antibiotici (preparati nella fase 2.6.1) come controllo in bianco.
   3. Incubare a 37 °C in uno shaker di incubazione a 200 giri/min per altri 30 minuti.
      NOTA: In questa fase, la concentrazione finale di D₂O nel mezzo per la prova è del 70%.
10. Centrifugare prima 1 mL di campione di antibiotico e D₂O trattato a 6200 x g per 5 minuti a 4 °C, quindi lavare due volte con acqua purificata. Infine, fissare i campioni in una soluzione di formalina al 10% e conservarli a 4 °C.

3. Preparazione dei batteri nell'ambiente urinario (Figura 2b)

1. Per preparare E. coli BW 25113 nella fase logaritmica, seguire i passaggi 1.4 e 1.5.
2. Controllare la concentrazione batterica misurando l'OD con un fotometro ad una lunghezza d'onda di 600 nm.
3. Per imitare i campioni clinici di UTI 14,18,41^, aggiungere la soluzione di E. coli in 10 ml di urina deidentificata per raggiungere una concentrazione cellulare finale di ^{10 6} CFU / ml.
4. Filtrare l'urina con picco di E. coli utilizzando un filtro da 5 μm, quindi dividere la soluzione batterica in 300 μL di aliquote in sette micro provette da 1,5 ml e 600 μL di aliquote della soluzione batterica in un micro tubo da 1,5 ml.
5. Eseguire il trattamentodi incorporazione di D 2 O in presenza di antibiotici e raccolta del campione come descritto nelle fasi precedenti da 2.4 a 2.10.

4. Preparazione dei batteri nell'ambiente sanguigno (Figura 2c)

1. Per preparare Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 nella fase logaritmica, seguire i passaggi 1.4 e 1.5.
2. Per imitare i campioni clinici di infezioni del flusso sanguigno^42,43, spike P. aeruginosa in 1 mL di sangue umano non identificato per raggiungere una concentrazione di 10⁷ CFU / ml.
3. Aggiungere 9 ml di acqua purificata sterile per lisare il sangue.
4. Filtrare il sangue a spillo di P. aeruginosa utilizzando un filtro da 5 μm. Quindi raccogliere i batteri a 1 mL di volume mediante centrifugazione a 6200 x g per 5 minuti a 4 °C.  Aggiungere 9 ml di MHB normale preriscaldato nella soluzione batterica e vortice delicatamente. La concentrazione finale di batteri è 10⁶ CFU/mL
5. Dividere la soluzione di sangue a spillo di P. aeruginosa in 300 μL di aliquote in sette micro provette da 1,5 ml e 600 μL di aliquote della soluzione batterica in una micro provetta da 1,5 ml.
6. Eseguire il trattamentodi incorporazione di D 2 O in presenza di antibiotici e raccolta del campione come descritto nelle fasi precedenti da 2.4 a 2.10.

5. Imaging SRS dell'incorporazione metabolica di D₂O in un singolo batterio

1. Lavare 1 mL di soluzione batterica fissa con acqua purificata e quindi centrifugare a 6200 x g per 5 minuti a 4 °C. Rimuovere il surnatante. Arricchire la soluzione batterica a circa 20 μL.
2. Depositare la soluzione batterica su un vetro di copertura rivestito di poli-L-lisina. Inserire e sigillare il campione per l'imaging SRS.
3. Immagine dei batteri alla frequenza vibrazionale C-D a 2168 ^cm-1 utilizzando un microscopio SRS.
   1. Immettere e regolare la lunghezza d'onda della pompa a 852 nm utilizzando il software di controllo su un computer.
   2. Misurare la potenza del laser utilizzando un misuratore di potenza. Impostare la potenza del laser a pompa sul campione su ~ 8 mW e la potenza del laser Stokes sul campione su ~ 40 mW regolando la piastra a mezza onda davanti all'uscita laser.
      NOTA: Nel microscopio SRS, un laser a femtosecondi sintonizzabile con una frequenza di ripetizione di 80 MHz fornisce i laser di eccitazione della pompa (da 680 a 1300 nm) e di Stokes (1045 nm).
4. Regolando le viti degli specchi riflettenti, allineare spazialmente la pompa e i raggi Stokes e dirigere i due raggi in un microscopio verticale dotato di sistema di specchi galvo 2D per la scansione laser.
   1. Utilizzare un obiettivo di immersione in acqua 60x per focalizzare la pompa e i laser Stokes sul campione.
   2. Utilizzare un condensatore dell'olio per raccogliere i segnali dal campione nella direzione in avanti.
   3. Utilizzare un filtro passa-banda per filtrare il laser Stokes prima di indirizzarlo in un fotodiodo.
   4. Estrarre il segnale Raman stimolato da un amplificatore lock-in e rilevare i segnali dal fotodiodo.
5. Impostare ogni immagine SRS in modo che contenga 200 x 200 pixel e il tempo di permanenza dei pixel per 30 μs nel pannello di controllo del software. Il tempo totale di acquisizione per un'immagine è ~ 1,2 s. Impostare la dimensione Step su 150 nm, quindi la dimensione dell'immagine è di circa 30 x 30 μm². Immagine di almeno tre campi di vista per ogni campione.

6. Elaborazione delle immagini e analisi dei dati (Figura 3)

1. Per ottenere l'intensità media del segnale C-D, aprire ed elaborare immagini SRS con il software ImageJ.
2. Innanzitutto, converti le immagini SRS in immagini di tipo a 8 bit con colore invertito facendo clic su Immagine | Tipo | 8 bit, quindi modificare | Invertire i pulsanti nel software ImageJ.
3. Quindi, filtrare le immagini con sfocatura gaussiana facendo clic su Elabora | Filtri | Pulsanti di sfocatura gaussiana e impostare Sigma (raggio) su 1.
4. Utilizzare la regolazione della soglia dell'immagine per selezionare l'area batterica. Clicca sull'immagine | Regolare | Soglia per garantire che le dimensioni batteriche selezionate corrispondano a quelle delle immagini SRS originali. Eliminare le particelle piccole regolando la soglia di dimensione per determinare le particelle. Fare clic su Applica.
5. Applica Analizza | Pulsanti di analisi delle particelle per etichettare e determinare l'area dei batteri.
6. Facendo clic sul pulsante Mostra tutto nel gestore ROI all'immagine SRS originale non elaborata, etichettare la stessa area di batteri, determinare l'intensità media di ciascun punto dati facendo clic sul pulsante Misura nel gestore ROI.
7. Cerchiare l'area di sfondo nell'immagine SRS originale e misurare l'intensità media dello sfondo. L'intensità media C-D di ciascun batterio si ottiene deducendo l'intensità del segnale di fondo.

7. Quantificazione della suscettibilità antimicrobica tramite SC-MIC

NOTA: Il valore limite a 0,60 per determinare l'SC-MIC è stabilito in base all'analisi statistica delle intensità SRS C-D delle condizioni attive e inibite dal metabolismo per i batteri su varie concentrazioni di esposizione al farmaco⁴⁰. Le intensità C-D per i gruppi sensibili agli antibiotici e resistenti agli antibiotici sono state adattate con una distribuzione normale.

1. Tracciare la curva delle caratteristiche operative del ricevitore (ROC) e valutare la soglia di cut-off a 0,60. Sulla base di questo valore di cut-off, l'SC-MIC come indicatore dell'efficacia degli antibiotici può essere definito per determinare il gruppo metabolicamente inattivo e metabolicamente attivo.
2. Per analizzare quantitativamente i dati di imaging SRS, tracciare gli istogrammi delle intensità del segnale C-D per ciascun gruppo di batteri trattati con la concentrazione di antibiotici diluita in serie. I punti dati colorati rappresentano diversi singoli batteri.
3. Normalizzare le intensità C-D del gruppo trattato con antibiotici all'intensità media del gruppo di controllo senza trattamento antibiotico. Determinare i risultati SC-MIC di diversi batteri e combinazioni di antibiotici quantificando le intensità del segnale SRS nella regione C-D rispetto a varie concentrazioni di antibiotici utilizzando il valore di cut-off a 0,60.
4. Convalidare e confrontare la lettura SC-MIC con la MIC determinata utilizzando il test di microdiluizione del brodo convenzionale.
5. Secondo il Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), la categoria di suscettibilità basata sui risultati dell'imaging metabolico SRS per ciascun ceppo batterico testato è interpretata come "suscettibile", "resistente" o "intermedio".

Risultati

L'effetto del tempo di incubazione sull'incorporazione del deuterio è misurato mediante microspettroscopia Raman spontanea nella regione C-D (da 2070 a 2250 cm-1) e C-H (da 2.800 a 3.100 ^cm-1) (Figura 4a). Gli spettri Raman a singola cellula time-lapse di P. aeruginosa coltivati in terreno contenente il 70% di D 2 O mostrano un aumento dell'intensità CD/CH nel tempo di incubazione da 0 a 180 min. (Figura 4b) La crescente abbondan...

Discussione

L'AST rapida può essere ottenuta valutando la risposta dell'attività metabolica batterica al trattamento antibiotico utilizzando l'imaging metabolico SRS a singola cellula entro 2,5 ore dal campione ai risultati SC-MIC. La risposta dell'attività metabolica batterica e della suscettibilità antimicrobica può essere rilevata monitorando l'incorporazione metabolica di D₂O per la sintesi di biomolecole utilizzando l'imaging SRS dei legami C-D. Poiché l'acqua è utilizzata ovunque nelle cellule viventi, l'imag...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acousto-optic modulation	Gooch&Housego	R15180-1.06-LTD	Modulating stokes laser beam
Amoxicillin	Sigma Aldrich	A8523-5G
Bandpass filter	Chroma	HQ825/150m	Block the stokes laser beam before the photodiode
Calcium chloride	Sigma Aldrich	C1016-100G	Cation adjustment
Cation-adjusted Mueller-Hinton Broth	Fisher Scientific	B12322	Antimicrobial susceptibility testing of microorganisms by broth dilution methods
Centrifuge	Thermo Scientific	75002542
Cover Glasses	VWR	16004-318
Culture tube with snap cap	Fisher brand	149569B
Daptomycin	Acros	A0386346
Deuterium oxide		151882	Organic solvent to dissolve antibiotics
Deuterium oxide-d6	Sigma Aldrich	156914	Organic solvent as a standard to calibrate SRS imaging system
Escherichia coli BW 25113	The Coli Genetic Stock Center	7636
Eppendorf polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL	Fisher brand	05-408-129
Gentamicin sulfate	Sigma Aldrich	G4918
Hydrophilic Polyvinylidene Fluoride filters	Millipore-Sigma	SLSV025NB	pore size 5 µm
ImageJ software	NIH	Version: 2.0.0-rc-69/1.52t	Image processing and analysis
Incubating orbital shaker set at 37 °C	VWR	97009-890
Inoculation loop	Sigma	BR452201-1000EA
InSight DeepSee femtosecond pulsed laser	Spectra-Physics	Model: insight X3	Tunable laser source and fixed laser source at 1045 nm for SRS imaging
Lock-in amplifier	Zurich Instrument	HF2LI	Demodulate the SRS signals
Oil condenser	Olympus	U-AAC	NA 1.4
Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 (PAO1)	American Type Culture Collection	ATCC 47085
Photodiode	Hamamatsu	S3994-01	Detector
Polypropylene conical tube 15 mL	Falcon	14-959-53A
Polypropylene filters	Thermo Scientific	726-2520	pore size 0.2 µm
Sterile petri dishes	Corning	07-202-031
Syringe 10 mL	Fisher brand	14955459
UV/Vis Spectrophotometer	Beckman Coulter	Model: DU 530	Measuring optical density at wavelength of 600 nm
Vortex mixer	VWR	97043-562
Water objective	Olympus	UPLANAPO/IR	60×, NA 1.2