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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt einen schnellen Test auf antimikrobielle Empfindlichkeit (AST) innerhalb von 2,5 h durch einzelzellstimulierte Raman-Streubildgebung desD2O-Metabolismusdar. Diese Methode gilt für Bakterien im Urin oder Vollblut, was für eine schnelle einzellige phänotypische AST in der Klinik transformativ ist.

Zusammenfassung

Um die Ausbreitung antimikrobiell resistenter Infektionen zu verlangsamen und zu verhindern, ist es dringend erforderlich, die antimikrobiellen Wirkungen auf Krankheitserreger quantitativ zu bestimmen. Es dauert in der Regel Tage, um die AST mit herkömmlichen Methoden abzuschließen, die auf der Langzeitkultur basieren, und sie funktionieren nicht direkt für klinische Proben. Hier berichten wir über eine schnelle AST-Methode, die durch stimulierte Raman-Streuung (SRS) -Bildgebung der Deuteriumoxid (D2O) metabolischen Inkorporation ermöglicht wird. Der metabolische Einbau vonD2Oin Biomasse und die Hemmung der Stoffwechselaktivität bei Exposition gegenüber Antibiotika auf Einzelbakterienebene werden durch SRS-Bildgebung überwacht. Die Einzelzellstoffwechsel-Inaktivierungskonzentration (SC-MIC) von Bakterien bei Exposition gegenüber Antibiotika kann nach insgesamt 2,5 Stunden Probenvorbereitung und -nachweis ermittelt werden. Darüber hinaus ist diese schnelle AST-Methode direkt auf Bakterienproben in komplexen biologischen Umgebungen wie Urin oder Vollblut anwendbar. Die SRS-metabolische Bildgebung der Deuteriuminkorporation ist transformativ für eine schnelle einzellige phänotypische AST in der Klinik.

Einleitung

Antimikrobielle Resistenz (AMR) ist eine wachsende globale Bedrohung für die wirksame Behandlung von Infektionskrankheiten1. Es wird prognostiziert, dass AMR bis 2050 zusätzliche 10 Millionen Todesfälle pro Jahr und einen globalen BIP-Verlust von 100 Billionen US-Dollar verursachen wird, wenn keine Maßnahmen zur Bekämpfung antibiotikaresistenter Bakterien ergriffen werden 1,2. Dies unterstreicht die dringende Notwendigkeit schneller und innovativer Diagnosemethoden für Antibiotika-Empfindlichkeitstests (AST) von infektiösen Bakterien, um das Auftreten antibiotikaresistenter Bakterien zu verlangsamen und die damit verbundene Sterblichkeitsrate zu senken3. Um das bestmögliche klinische Ergebnis zu gewährleisten, ist es entscheidend, innerhalb von 24 Stunden eine wirksame Therapie einzuleiten. Die aktuelle Goldstandardmethode, wie die Scheibendiffusions- oder Brüheverdünnungsmethode, erfordert jedoch in der Regel mindestens 24 Stunden für das Vorinkubationsverfahren für klinische Proben und zusätzliche 16-24 Stunden, um die Ergebnisse der minimalen Hemmkonzentration (MIC) zu erhalten. Insgesamt sind diese Methoden zu zeitaufwendig, um eine sofortige Entscheidung für die Behandlung von Infektionskrankheiten in der Klinik zu treffen, was zur Entstehung und Ausbreitung von Antibiotikaresistenzen führt4.

Genotypische AST-Methoden, wie Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-basierte Techniken5, wurden für den schnellen Nachweis entwickelt. Solche Techniken messen die spezifischen Resistenz-Gensequenzen, um schnelle AST-Ergebnisse zu liefern. Sie sind nicht auf zeitaufwändige Zellkulturen angewiesen; Es werden jedoch nur bestimmte bekannte genetische Sequenzen mit Resistenz getestet. Daher ist seine Anwendung auf verschiedene Bakterienarten oder unterschiedliche Resistenzmechanismen beschränkt. Sie können auch keine MIC-Ergebnisse für Therapieentscheidungen liefern 6,7. Darüber hinaus werden neuartige phänotypische Methoden für schnelle AST entwickelt, um diese Einschränkungen zu überwinden8, einschließlich mikrofluidischer Geräte 9,10,11,12,13, optischer Geräte14,15,16, phänotypischer AST zur Quantifizierung der Nukleinsäure-Kopienzahl17,18 und Raman-spektroskopischer Methoden 19. 20,21,22,23,24. Diese Methoden verkürzen die Zeit, um AST-Ergebnisse zu steuern, aber die meisten von ihnen sind nur auf Bakterienisolate anwendbar, nicht direkt auf klinische Proben, und erfordern immer noch eine lange Vorinkubation.

In dieser Arbeit stellen wir eine Methode zur schnellen Bestimmung der Empfindlichkeit von Bakterien im Urin und Vollblut durch Überwachung der zellulären Stoffwechselaktivität mittels SRS-Bildgebung vor. Wasser (H2O) ist an der überwiegenden Mehrheit der wesentlichen biomolekularen Syntheseprozesse in lebenden Zellen beteiligt. Als Isotopologe von Wasser kann Deuterium durch enzymkatalysierte H/D-Austauschreaktion zwischen dem redoxaktiven Wasserstoffatom in NADPH und demD-Atom in D2Oin Biomasse innerhalb einer Zelle25,26 eingebaut werden. Eine deuterierte Fettsäuresynthesereaktion wird durch das mit Deuterium markierte NADPH vermittelt. DerD2O-Einbauin Reaktionen von Aminosäuren (AAs) führt zur deuterierten Proteinproduktion26 (Abbildung 1). Auf diese Weise können die neu synthetisierten C-D-Bindungs-haltigen Biomoleküle in einzelnen mikrobiellen Zellen als allgemeiner metabolischer Aktivitätsmarker verwendet werden, um nachgewiesen zu werden. Um de novo synthetisierte C-D-Bindungen auszulesen, wird die Raman-Spektroskopie, ein vielseitiges Analysewerkzeug, das spezifische und quantitative chemische Informationen über Biomoleküle liefert, häufig verwendet, um die antimikrobielle Empfindlichkeit zu bestimmen und die Testzeit auf wenige Stunden deutlich zu reduzieren27,28,29,30 . Aufgrund der inhärenten geringen Effizienz des Raman-Streuprozesses ist die spontane Raman-Spektroskopie jedoch von geringer Detektionsempfindlichkeit. Daher ist es schwierig, Echtzeit-Bildergebnisse mittels spontaner Raman-Spektroskopie zu erhalten. Die kohärente Raman-Streuung (CRS), einschließlich der kohärenten Anti-Stokes-Raman-Streuung (CARS) und der stimulierten Raman-Streuung (SRS), hat aufgrund des kohärenten Lichtfeldes eine hohe Detektionsempfindlichkeit erreicht, die um Größenordnungen größer ist als die spontane Raman-Spektroskopie, wodurch eine schnelle, spezifische und quantitative chemische Bildgebung auf Einzelzellebene ermöglichtwird 31,32,33,34,35 ,36,37,38,39.

Hier, basierend auf unserer jüngsten Arbeit40, präsentieren wir ein Protokoll zur schnellen Bestimmung der metabolischen Aktivität und antimikrobiellen Suszeptibilität durch Femtosekunden-SRS-C-D-Bildgebung vonD2O-Einbauvon Bakterien in das normale Medium, Urin und Vollblutumgebung auf Einzelzellebene. Die Femtosekunden-SRS-Bildgebung ermöglicht die Überwachung der Inaktivierungskonzentration des Einzelzellstoffwechsels (SC-MIC) gegen Antibiotika auf Einzelbakteriumebene innerhalb von 2,5 h. Die SC-MIC-Ergebnisse werden durch Standard-MIC-Test mittels Brühe-Mikrodilution validiert. Unsere Methode ist anwendbar zur Bestimmung der antimikrobiellen Anfälligkeit von bakteriellen Harnwegsinfektionen (UTI) und Blutbahninfektionen (BSI) Erregern mit einer viel kürzeren Assay-Zeit im Vergleich zur konventionellen Methode, was die Möglichkeit für eine schnelle phänotypische AST in der Klinik auf Einzelzellebene eröffnet.

Protokoll

Die Verwendung von menschlichen Blutproben erfolgt in Übereinstimmung mit den Richtlinien des IRB der Boston University und der National Institutes of Health (NIH). Konkret stammen die Exemplare aus einer Bank und sind vollständig deidentifiziert. Diese Exemplare werden vom Büro des Institutional Review Board (IRB) an der Boston University nicht als menschliche Subjekte betrachtet.

1. Herstellung von Bakterien- und Antibiotika-Stammlösung

  1. Die Antibiotika-Stammlösung (Gentamicinsulfat oder Amoxicillin) wird in einer Konzentration von 1 mg/ml hergestellt, gelöst in steriler 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) oder Dimethylsulfoxid (DMSO) Lösungsmittel in 1,5 ml Mikroröhrchen. Gentamicinsulfat wird in steriler PBS-Lösung und Amoxicillin in sterilem DMSO-Lösungsmittel gelöst. Danach lagern Sie die Antibiotikalösung wie empfohlen bei 2-8 °C.
  2. Um D2O-haltige kationsangepasste Mueller-Hinton Bouillon (MHB)-Medien herzustellen, fügen Sie 220 mg MHB-Brühebase zu 10 mlD2Ohinzu, um 100%D2O-haltigesMedium herzustellen. Sterilisieren Sie die Lösung durch Filtern von 200 nm Porengröße.
    HINWEIS: Verwenden Sie dieses Protokoll immer für die Herstellung und Sterilisation von Mediumlösungen in weiteren Schritten.
  3. Um Bakterienproben für die SRS-Bildgebung vorzubereiten, geben Sie 2 ml normales MHB-Medium, das kein Deuterium enthält, in ein steriles Kulturröhrchen mit rundem Boden und erwärmen es dann bei 37 °C vor.
  4. Verwenden Sie eine sterile Schleife, um eine Bakterienkolonie (Escherichia coli BW 25113 oder Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085) aus der frischen Kultur auf einer tryptischen Soja-Agar-Platte auszuwählen. Dann suspendieren Sie es in den vorgewärmten Kulturmedien und wirbeln Sie vorsichtig, um die Bakteriensuspension vorzubereiten.
  5. Bakterien bei 37 °C in einem Shaker mit 200 Umdrehungen pro Minute (U/min) inkubieren, bis sie die logarithmische Phase erreichen.

2. D2O-Inkorporationsbehandlung in Gegenwart von Antibiotika (Abbildung 2a)

  1. Überprüfen Sie die Bakterienkonzentration, indem Sie die optische Dichte (OD) mit einem Photometer bei einer Wellenlänge von 600 nm messen.
  2. Verdünnen Sie die Bakterienlösung mit dem normalen MHB-Medium, das kein Deuterium enthält, um eine endgültige Zellkonzentration von 8 x 105 KBE/ml zu erreichen. Vortex sanft, um die Bakterienzellen zu mischen.
  3. Bereiten Sie 300 μL Aliquots der Bakterienlösung in sieben 1,5 ml Mikroröhrchen und 600 μL Aliquots der Bakterienlösung in einem 1,5 ml Mikroröhrchen vor.
  4. Fügen Sie 4,8 μl Antibiotikum (Gentamicin oder Amoxicillin) Stammlösung (1 mg / ml) in das Mikroröhrchen mit 600 μL der Bakterienlösung hinzu, um die endgültige Antibiotikakonzentration auf 8 μg / ml zu erhöhen.
  5. Nehmen Sie 300 μL Lösung aus den 8 μg/ml antibiotikahaltiger Bakterienlösung und fügen Sie weitere 300 μL Bakterienlösung hinzu, um eine zweifach verdünnte antibiotische (4 μg / ml) enthaltende Bakterienlösung herzustellen.
  6. Wiederholen Sie die zweifache serielle Verdünnung der Testantibiotika, Gentamicin oder Amoxicillin, bis das Mikroröhrchen mit der niedrigsten Konzentration (0,25 μg / ml) erreicht ist, und verwerfen Sie 300 μL aus dem Röhrchen. Sowohl für Gentamicin als auch für Amoxicillin liegen die seriellen Konzentrationen zwischen 0,25 μg / ml - 8 μg / ml.
    1. Lassen Sie ein Röhrchen ohne Antibiotika zur Blankokontrolle. Dies wird die Positivkontrolle sein, um die bakterielle Stoffwechselaktivität ohne Antibiotikabehandlung, aber mitD2O-Behandlungzu überprüfen.
    2. Lassen Sie ein Röhrchen ohne Antibiotika und ohneD2Ofür die Negativkontrolle.
  7. Inkubieren Sie das bakterielle Aliquot mit dem bestimmten Antibiotikum (Gentamicin oder Amoxicillin), das MHB-Medium enthält, für 1 h.
  8. Während der Inkubation wird eine serielle Verdünnung von Antibiotika mit 100%D2O-enthaltendemMedium mit dem gleichen Konzentrationsgradienten der in Schritt 2.6 hergestellten Antibiotika hergestellt. Sowohl für Gentamicin als auch für Amoxicillin liegen die seriellen Konzentrationen zwischen 0,25 μg / ml - 8 μg / ml.
  9. Nach 1 h Antibiotikabehandlung werden 700 μL seriell verdünntes Antibiotikum und 100% D2O-enthaltendesMHB-Medium zu den 300 μL antibiotikavorbehandelten Bakterien in der gleichen Antibiotikakonzentration (hergestellt in Schritt 2.6) gegeben.
    1. Zum Beispiel fügen Sie 700 μL 100%D2O-haltigesMHB-Medium (mit 8 μg / ml Antibiotikum) zu den 300 μL 8 μg / ml Antibiotika-vorbehandelten Bakterien hinzu. Auf die gleiche Weise auf die entsprechenden Röhrchen der nächsten Konzentration übertragen und homogenisieren, indem Sie mehrmals auf und ab pipettieren.
    2. 700 μL antibiotikafreies 100% D2O-enthaltendesMHB-Medium zu 300 μL antibiotikafreien Bakterien (hergestellt in Schritt 2.6.1) als Blindkontrolle zugeben.
    3. Bei 37 °C in einem Inkubationsschüttler bei 200 U/min für weitere 30 min inkubieren.
      ANMERKUNG: In diesem Schritt beträgt die Endkonzentration vonD2Oim Prüfmedium 70%.
  10. Zentrifugieren Sie zuerst die 1 ml Antibiotikum und D 2O-behandelte Bakterienprobe bei 6200 x g für 5 min bei 4 °C und waschen Sie sie dann zweimal mit gereinigtem Wasser. Zum Schluss werden die Proben in 10%iger Formalinlösung fixiert und bei 4 °C gelagert.

3. Vorbereitung von Bakterien im Urin (Abbildung 2b)

  1. Um E. coli BW 25113 in der logarithmischen Phase herzustellen, folgen Sie den Schritten unter 1.4 und 1.5.
  2. Überprüfen Sie die Bakterienkonzentration, indem Sie den OD mit einem Photometer bei einer Wellenlänge von 600 nm messen.
  3. Um die klinischen UTI-Proben 14,18,41 nachzuahmen, spießen Sie die E. coli-Lösung in 10 ml deidentifizierten Urin, um eine endgültige Zellkonzentration von 10 6 KBE/ml zu erreichen.
  4. Filtern Sie den mit E. coli versetzten Urin mit einem 5-μm-Filter und teilen Sie dann die Bakterienlösung in 300 μL Aliquots in sieben 1,5-ml-Mikroröhrchen und 600 μL-Aliquots der Bakterienlösung in einem 1,5-ml-Mikroröhrchen.
  5. Führen Sie eineD2O-Inkorporationsbehandlung in Gegenwart von Antibiotika und Probenentnahme durch, wie in den vorherigen Schritten von 2.4 bis 2.10 beschrieben.

4. Vorbereitung von Bakterien in der Blutumgebung (Abbildung 2c)

  1. Um Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 in der logarithmischen Phase vorzubereiten, folgen Sie den Schritten unter 1.4 und 1.5.
  2. Um die klinischen Blutbahninfektionsproben42,43 nachzuahmen, Spike P. aeruginosa in 1 ml deidentifizierten menschlichen Blutes, um eine Konzentration von 107 KBE/ml zu erreichen.
  3. Fügen Sie 9 ml steriles gereinigtes Wasser hinzu, um das Blut zu lysieren.
  4. Filtern Sie das Stachelblut von P. aeruginosa mit einem 5-μm-Filter. Dann ernten Sie Bakterien auf 1 ml Volumen durch Zentrifugation bei 6200 x g für 5 min bei 4 °C.  Geben Sie 9 ml vorgewärmtes normales MHB in die Bakterienlösung und wirbeln Sie vorsichtig. Die Endkonzentration der Bakterien beträgt 106 KBE/ml
  5. Die mit P. aeruginosa versetzte Blutlösung in 300 μL Aliquots in sieben 1,5 ml Mikroröhrchen und 600 μL Aliquots der Bakterienlösung in einem 1,5 ml Mikroröhrchen teilen.
  6. Führen Sie eineD2O-Inkorporationsbehandlung in Gegenwart von Antibiotika und Probenentnahme durch, wie in den vorherigen Schritten von 2.4 bis 2.10 beschrieben.

5. SRS-Bildgebungdes D2O-Stoffwechseleinbaus in ein einzelnes Bakterium

  1. 1 ml fixierte Bakterienlösung mit gereinigtem Wasser waschen und dann bei 6200 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand. Die Bakterienlösung auf ca. 20 μL anreichern.
  2. Die Bakterienlösung wird auf einem mit Poly-L-Lysin beschichteten Deckglas abgeschieden. Sandwich und versiegeln Sie die Probe für die SRS-Bildgebung.
  3. Bilden Sie Bakterien bei der C-D-Schwingungsfrequenz bei 2168 cm-1 mit einem SRS-Mikroskop ab.
    1. Geben Sie die Pumpwellenlänge ein und stimmen Sie sie mit der Steuerungssoftware auf einem Computer auf 852 nm ab.
    2. Messen Sie die Laserleistung mit einem Leistungsmesser. Stellen Sie die Leistung des Pumplasers an der Probe auf ~8 mW und die Leistung des Stokes-Lasers an der Probe auf ~40 mW ein, indem Sie die Halbwellenplatte vor dem Laserausgang einstellen.
      HINWEIS: Im SRS-Mikroskop liefert ein durchstimmbarer Femtosekundenlaser mit einer Wiederholrate von 80 MHz die Anregungslaser Pump (680 bis 1300 nm) und Stokes (1045 nm).
  4. Durch Einstellen der Schrauben der Reflexionsspiegel können Sie die Pump- und Stokes-Strahlen räumlich ausrichten und die beiden Strahlen in ein aufrechtes Mikroskop lenken, das mit einem 2D-Galvo-Spiegelsystem für Laserscanning ausgestattet ist.
    1. Verwenden Sie ein 60-faches Wasserimmersionsobjektiv, um die Pumpe und die Stokes-Laser auf die Probe zu fokussieren.
    2. Verwenden Sie einen Ölkondensator, um die Signale von der Probe in Vorwärtsrichtung zu sammeln.
    3. Verwenden Sie einen Bandpassfilter, um den Stokes-Laser herauszufiltern, bevor Sie ihn in eine Fotodiode lenken.
    4. Extrahieren Sie das stimulierte Raman-Signal durch einen Lock-in-Verstärker und erkennen Sie die Signale durch die Fotodiode.
  5. Stellen Sie jedes SRS-Bild auf 200 x 200 Pixel und die Pixelverweilzeit auf 30 μs im Bedienfeld der Software ein. Die Gesamtaufnahmezeit für ein Bild beträgt ~1,2 s. Stellen Sie die Schrittweite auf 150 nm ein, so dass die Bildgröße etwa 30 x 30 μm2 beträgt. Erstellen Sie mindestens drei Sichtfelder für jedes Beispiel.

6. Bildverarbeitung und Datenanalyse ( Abbildung 3)

  1. Um die durchschnittliche C-D-Signalintensität zu erhalten, öffnen und verarbeiten Sie SRS-Bilder mit der ImageJ-Software.
  2. Konvertieren Sie zunächst SRS-Bilder in 8-Bit-Bilder mit umgekehrter Farbe, indem Sie auf Bild | Typ | 8-Bit, und dann Edit | Invertieren Sie Schaltflächen in der ImageJ-Software.
  3. Filtern Sie dann die Bilder mit Gaußscher Unschärfe, indem Sie auf Verarbeitung klicken | Filter | Gaußsche Unschärfe-Schaltflächen und setzen Sie Sigma (Radius) auf 1.
  4. Verwenden Sie die Einstellung des Bildschwellenwerts, um den Bakterienbereich auszuwählen. Klicken Sie auf Bild | Anpassen | Schwellenwert , um sicherzustellen, dass die ausgewählten Bakteriengrößen mit denen in den ursprünglichen SRS-Bildern übereinstimmen. Beseitigen Sie kleine Partikel, indem Sie den Größenschwellenwert anpassen, um die Partikel zu bestimmen. Klicken Sie auf Übernehmen.
  5. Anwenden Analyze | Partikelanalyse-Tasten zur Beschriftung und Bestimmung des Bereichs von Bakterien.
  6. Durch Klicken auf die Schaltfläche Alle anzeigen im ROI-Manager für das ursprüngliche unverarbeitete SRS-Bild, beschriften Sie denselben Bakterienbereich und bestimmen Sie die durchschnittliche Intensität jedes Datenpunkts, indem Sie im ROI-Manager auf die Schaltfläche Messen klicken.
  7. Kreisen Sie den Hintergrundbereich im ursprünglichen SRS-Bild ein und messen Sie die durchschnittliche Intensität des Hintergrunds. Die durchschnittlichen C-D-Intensitäten jedes Bakteriums werden durch Abzug der Hintergrundsignalintensität ermittelt.

7. Quantifizierung der antimikrobiellen Suszeptibilität mittels SC-MIC

ANMERKUNG: Der Cut-off-Wert bei 0,60 zur Bestimmung des SC-MIC wird gemäß der statistischen Analyse der SRS C-D-Intensitäten der metabolismusaktiven und metabolismusgehemmten Bedingungen für Bakterien bei verschiedenen Konzentrationen der Arzneimittelexposition40 festgelegt. Die C-D-Intensitäten für die antibiotikaempfindlichen und antibiotikaresistenten Gruppen wurden mit Normalverteilung ausgestattet.

  1. Zeichnen Sie die ROC-Kurve (Receiver Operating Characterality) und bewerten Sie den Cut-off-Schwellenwert bei 0,60. Basierend auf diesem Cut-off-Wert kann der SC-MIC als Indikator für die Wirksamkeit von Antibiotika definiert werden, um die metabolisch inaktive und metabolisch aktive Gruppe zu bestimmen.
  2. Um die SRS-Bildgebungsdaten quantitativ zu analysieren, zeichnen Sie die Histogramme der C-D-Signalintensitäten für jede Bakteriengruppe, die mit der seriell verdünnten Antibiotikakonzentration behandelt wurde. Die farbigen Datenpunkte stehen für unterschiedliche einzelne Bakterien.
  3. Normalisieren Sie die C-D-Intensitäten der mit Antibiotika behandelten Gruppe auf die mittlere Intensität der Kontrollgruppe ohne Antibiotikabehandlung. Bestimmen Sie die SC-MIC-Ergebnisse verschiedener Bakterien und Antibiotikakombinationen durch Quantifizierung der SRS-Signalintensitäten im C-D-Bereich im Vergleich zu verschiedenen Antibiotikakonzentrationen unter Verwendung des Cut-off-Werts bei 0,60.
  4. Validierung und Vergleich der SC-MIC-Anzeige mit dem MIC, der mit herkömmlichem Brühe-Mikrodilutionstest bestimmt wurde.
  5. Nach Angaben des Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) wird die Suszeptibilitätskategorie, die auf den Ergebnissen der SRS-metabolischen Bildgebung für jeden getesteten Bakterienstamm basiert, als "anfällig", "resistent" oder "intermediär" interpretiert.

Ergebnisse

Der Effekt der Inkubationszeit auf den Deuteriumeinbau wird durch spontane Raman-Mikrospektroskopie im Bereich C-D (2070 bis 2250 cm-1) und C-H (2.800 bis 3.100 cm-1) gemessen (Abbildung 4a). Die Einzelzell-Raman-Spektren von P. aeruginosa, die in 70%D2O-haltigemMedium kultiviert wurden, zeigen eine zunehmende CD/CH-Intensität über die Inkubationszeit von 0 bis 180 min. (Abbildung 4b) Die zunehmende C-D-Häufigkeit in ...

Diskussion

Eine schnelle AST kann durch die Beurteilung der Reaktion der bakteriellen Stoffwechselaktivität auf die Antibiotikabehandlung unter Verwendung von Einzelzell-SRS-Stoffwechselbildgebung innerhalb von 2,5 Stunden von der Probe bis zu SC-MIC-Ergebnissen erreicht werden. Die Reaktion der bakteriellen Stoffwechselaktivität und der antimikrobiellen Empfindlichkeit kann durch Überwachung des metabolischen Einbaus vonD2Ofür die Biomolekülsynthese unter Verwendung der SRS-Bildgebung von C-D-Bindungen nachgewiesen...

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeiten wurden von NIH R01AI141439 bis J.-X.C und M.S und R35GM136223 bis J.-X.C.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Acousto-optic modulationGooch&HousegoR15180-1.06-LTDModulating stokes laser beam
AmoxicillinSigma AldrichA8523-5G
Bandpass filterChromaHQ825/150mBlock the stokes laser beam before the photodiode
Calcium chlorideSigma AldrichC1016-100GCation adjustment
Cation-adjusted Mueller-Hinton BrothFisher ScientificB12322Antimicrobial susceptibility testing of microorganisms by broth dilution methods
CentrifugeThermo Scientific75002542
Cover GlassesVWR16004-318
Culture tube with snap capFisher brand149569B
DaptomycinAcrosA0386346
Deuterium oxide151882Organic solvent to dissolve antibiotics
Deuterium oxide-d6Sigma Aldrich156914Organic solvent as a standard to calibrate SRS imaging system
Escherichia coli BW 25113The Coli Genetic Stock Center7636
Eppendorf polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mLFisher brand05-408-129
Gentamicin sulfateSigma AldrichG4918
Hydrophilic Polyvinylidene Fluoride filtersMillipore-SigmaSLSV025NBpore size 5 µm
ImageJ softwareNIHVersion: 2.0.0-rc-69/1.52tImage processing and analysis
Incubating orbital shaker set at 37 °CVWR97009-890
Inoculation loopSigmaBR452201-1000EA
InSight DeepSee femtosecond pulsed laserSpectra-PhysicsModel: insight X3Tunable laser source and fixed laser source at 1045 nm for SRS imaging
Lock-in amplifierZurich InstrumentHF2LIDemodulate the SRS signals
Oil condenserOlympusU-AACNA 1.4
Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 (PAO1)American Type Culture CollectionATCC 47085
PhotodiodeHamamatsuS3994-01Detector
Polypropylene conical tube 15 mLFalcon14-959-53A
Polypropylene filtersThermo Scientific726-2520pore size 0.2 µm
Sterile petri dishesCorning07-202-031
Syringe 10 mLFisher brand14955459
UV/Vis SpectrophotometerBeckman CoulterModel: DU 530Measuring optical density at wavelength of 600 nm
Vortex mixerVWR97043-562
Water objectiveOlympusUPLANAPO/IR60×, NA 1.2

Referenzen

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