JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол представляет собой экспресс-тестирование чувствительности к противомикробным препаратам (АСТ) в течение 2,5 ч с помощью одноклеточной стимулированной комбинационной рассеянной визуализации метаболизмаD2O. Этот метод применяется к бактериям в моче или цельной кровяной среде, что является преобразующим для быстрого одноклеточного фенотипического АСТ в клинике.

Аннотация

Чтобы замедлить и предотвратить распространение устойчивых к противомикробным препаратам инфекций, срочно необходимо быстрое тестирование чувствительности к противомикробным препаратам (АСТ) для количественного определения антимикробного воздействия на патогены. Обычно требуется несколько дней, чтобы завершить АСТ обычными методами, основанными на долгосрочной культуре, и они не работают непосредственно для клинических образцов. Здесь мы сообщаем о быстром методе АСТ, обеспечиваемом стимулированной рамановской рассеянием (SRS) визуализации метаболического включения оксида дейтерия (D2O). Метаболическое включениеD2Oв биомассу и ингибирование метаболической активности при воздействии антибиотиков на уровне одной бактерии контролируются с помощью визуализации SRS. Концентрация инактивации одноклеточного метаболизма (SC-MIC) бактерий при воздействии антибиотиков может быть получена в общей сложности через 2,5 ч пробоподготовки и обнаружения. Кроме того, этот быстрый метод АСТ непосредственно применим к бактериальным образцам в сложных биологических средах, таких как моча или цельная кровь. Метаболическая визуализация SRS дейтерия является преобразующей для быстрого одноклеточного фенотипического АСТ в клинике.

Введение

Устойчивость к противомикробным препаратам (УПП) представляет собой растущую глобальную угрозу для эффективного лечения инфекционных заболеваний1. Прогнозируется, что УПП приведет к дополнительным 10 миллионам смертей в год и потере мирового ВВП в размере 100 триллионов долларов к 2050 году, если не будут приняты меры по борьбе с устойчивыми к антибиотикам бактериями 1,2. Это подчеркивает настоятельную необходимость в быстрых и инновационных методах диагностики для тестирования чувствительности к антибиотикам (АСТ) инфекционных бактерий, чтобы замедлить появление устойчивых к антибиотикам бактерий и снизить связанный с этим уровень смертности3. Чтобы обеспечить наилучший возможный клинический результат, крайне важно ввести эффективную терапию в течение 24 ч. Однако современный метод золотого стандарта, такой как диффузия диска или метод разбавления бульона, обычно требует не менее 24 ч для процедуры предварительной инкубации для клинических образцов и дополнительных 16-24 ч для получения результатов минимальной ингибирующей концентрации (MIC). В целом, эти методы отнимают слишком много времени, чтобы направлять немедленное решение о лечении инфекционных заболеваний в клинике, что приводит к появлению и распространению устойчивости к противомикробным препаратам4.

Генотипические методы АСТ, такие как методы полимеразной цепной реакции (ПЦР)5, были разработаны для быстрого обнаружения. Такие методы измеряют специфические генетические последовательности резистентности, чтобы обеспечить быстрые результаты АСТ. Они не полагаются на трудоемкую клеточную культуру; однако тестируются только конкретные известные генетические последовательности с резистентностью. Поэтому его применение ограничивается различными видами бактерий или различными механизмами резистентности. Кроме того, они не могут предоставить результаты MIC для решенийтерапии 6,7. Кроме того, для преодоления этих ограничений разрабатываются новые фенотипические методы быстрого АСТ8, в том числе микрофлюидные устройства 9,10,11,12,13, оптические приборы 14,15,16, фенотипические АСТ, количественно оценивающие число копий нуклеиновых кислот 17,18, и рамановские спектроскопические методы19, 20,21,22,23,24. Эти методы сокращают время для получения результатов АСТ, однако большинство из них применимы только к бактериальным изолятам, а не непосредственно к клиническим образцам, и по-прежнему требуют длительной преинкубации.

В данной работе представлен метод быстрого определения восприимчивости бактерий в моче и цельной крови посредством мониторинга клеточной метаболической активности методом SRS-визуализации. Вода (H2O) принимает участие в подавляющем большинстве основных процессов биомолекулярного синтеза в живых клетках. В качестве изотополога воды, посредством катализируемой ферментами реакции обмена H/D между окислительно-восстановительным активным атомом водорода в NADPH и атомом D вD2O, дейтерий может быть включен в биомассу внутри ячейки25,26. Реакция синтеза дейтерированных жирных кислот опосредована дейтерием, меченым NADPH. ВключениеD2O в реакции аминокислот (АА) приводит к получению дейтерированного белка26 (фиг.1). Таким образом, вновь синтезированные биомолекулы, содержащие связь C-D, в отдельных микробных клетках могут быть использованы в качестве общего маркера метаболической активности для обнаружения. Для считывания de novo синтезированных C-D связей рамановская спектроскопия, универсальный аналитический инструмент, предоставляющий специфическую и количественную химическую информацию биомолекул, широко используется для определения чувствительности к противомикробным препаратам и значительно сокращает время тестирования до нескольких часов 27,28,29,30 . Однако из-за присущей ему низкой эффективности процесса рамановского рассеяния спонтанная рамановская спектроскопия обладает низкой чувствительностью обнаружения. Поэтому трудно получить результаты изображения в режиме реального времени с помощью спонтанной рамановской спектроскопии. Когерентное рамановское рассеяние (CRS), включая когерентное анти-Стоксовское рамановское рассеяние (CARS) и стимулированное рамановское рассеяние (SRS), достигло высокой чувствительности обнаружения из-за когерентного светового поля, генерирующего порядки величины больше, чем у спонтанной рамановской спектроскопии, тем самым обеспечивая высокоскоростную, специфическую и количественную химическую визуализацию на уровне одной клетки 31,32,33,34,35 ,36,37,38,39.

Здесь, основываясь на нашей последней работе40, мы представляем протокол для быстрого определения метаболической активности и чувствительности к противомикробным препаратам путем фемтосекундной визуализации SRS C-D включения D2O бактерий в нормальную среду, мочу и цельную среду крови на уровне одной клетки. Фемтосекундная визуализация SRS облегчает мониторинг концентрации инактивации внутриклеточного метаболизма (SC-MIC) против антибиотиков на уровне одной бактерии в течение 2,5 ч. Результаты SC-MIC подтверждаются стандартным тестом MIC путем микроразбавления бульона. Наш метод применим для определения антимикробной восприимчивости бактерий к инфекции мочевыводящих путей (ИМП) и инфекции кровотока (БСИ) возбудителей с значительно уменьшенным временем анализа по сравнению с обычным методом, что открывает возможность быстрого фенотипического АСТ в клинике на одноклеточном уровне.

протокол

Использование образцов крови человека соответствует руководящим принципам IRB Бостонского университета и Национальных институтов здравоохранения (NIH). В частности, образцы взяты из банка и полностью деидентифицированы. Эти образцы не считаются человеческими субъектами офисом институционального наблюдательного совета (IRB) в Бостонском университете.

1. Приготовление раствора бактерий и антибиотиков

  1. Готовят раствор антибиотиков (гентамицина сульфата или амоксициллина) в концентрации 1 мг/мл, растворенный в стерильном 1x фосфат-буферном физиологическом растворе (PBS) или диметилсульфоксиде (DMSO) в микропробирках объемом 1,5 мл. Растворить гентамицина сульфат в стерильном растворе PBS и амоксициллин в стерильном растворителе DMSO. После этого храните раствор антибиотиков при температуре 2-8 °C, как предлагается.
  2. Чтобы получить D2O, содержащую катионную среду бульона Мюллера-Хинтона (MHB), добавьте 220 мг основания отвара MHB к 10 млD2O, чтобы получить 100%D2O-содержащую среду. Стерилизуют раствор путем фильтрации фильтрами с размером пор 200 нм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда используйте этот протокол для изготовления и стерилизации растворов среды на последующих этапах.
  3. Чтобы подготовить бактериальные образцы для визуализации SRS, добавьте 2 мл нормальной среды MHB, которая не содержит дейтерия, в стерильную культуральную трубку с круглым дном, а затем предварительно прогрейте ее при 37 °C.
  4. Используйте стерильную петлю, чтобы выбрать одну бактериальную (Escherichia coli BW 25113 или Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085) колонию из свежей культуры на триптической соевой агаровой пластине. Затем суспендируйте его в предварительной культуральной среде и осторожно вихрь, чтобы приготовить суспензию бактерий.
  5. Инкубируйте бактерии при 37 °C в шейкере со скоростью 200 оборотов в минуту (об/мин) до тех пор, пока они не достигнут логарифмической фазы.

2. D2O инкорпорированное лечение в присутствии антибиотиков (рисунок 2а)

  1. Проверьте концентрацию бактерий, измерив оптическую плотность (OD) с помощью фотометра на длине волны 600 нм.
  2. Разбавьте бактериальный раствор, используя нормальную среду MHB, которая не содержит дейтерия, чтобы достичь конечной концентрации клеток 8 х 105 КОЕ/мл. Вихрь осторожно, чтобы смешать бактериальные клетки.
  3. Готовят 300 мкл аликвот бактериального раствора в семи микропробирках по 1,5 мл и 600 мкл аликвот бактериального раствора в одной микропробирке объемом 1,5 мл.
  4. Добавьте 4,8 мкл исходного раствора антибиотика (гентамицина или амоксициллина) (1 мг/мл) в микропробирку, содержащую 600 мкл бактериального раствора, чтобы получить конечную концентрацию антибиотика до 8 мкг/мл.
  5. Возьмите 300 мкл раствора из 8 мкг/мл раствора бактерий, содержащего антибиотики, и добавьте еще 300 мкл бактериального раствора, чтобы получить двукратно разбавленный раствор антибиотика (4 мкг/мл), содержащий бактерии.
  6. Повторяют двукратное последовательное разведение исследуемых антибиотиков, гентамицина или амоксициллина, до тех пор, пока не будет достигнута микропробирка с самой низкой концентрацией (0,25 мкг/мл), и выбросьте из пробирки 300 мкл. Как для гентамицина, так и для амоксициллина серийные концентрации варьируются от 0,25 мкг/мл до 8 мкг/мл.
    1. Оставьте один тюбик без антибиотиков для пустого контроля. Это будет положительный контроль для проверки метаболической активности бактерий без лечения антибиотиками, но с лечениемD2O.
    2. Оставьте один пробирок без антибиотиков и безD2O для отрицательного контроля.
  7. Инкубируют бактериальную аликвоту определенным антибиотиком (гентамицином или амоксициллином), содержащим MHB-среду, в течение 1 ч.
  8. Во время инкубации готовят серийное разведение антибиотиков со 100%D2O, содержащей среду с таким же градиентом концентрации антибиотиков, приготовленных на стадии 2.6. Как для гентамицина, так и для амоксициллина серийные концентрации варьируются от 0,25 мкг/мл до 8 мкг/мл.
  9. После 1 ч лечения антибиотиками добавляют 700 мкл последовательно разбавленного антибиотика и 100%D2O-содержащей MHB среды к 300 мкл бактерий, предварительно обработанных антибиотиками, в той же концентрации антибиотика (полученной на стадии 2.6), соответственно.
    1. Например, добавляют 700 мкл 100%D2O-содержащей MHB среды (содержащей 8 мкг/мл антибиотика) к 300 мкл 8 мкг/мл бактерий, предварительно обработанных антибиотиками. Таким же образом перекладывают в соответствующие трубки следующую концентрацию, и гомогенизируют путем пипетки вверх и вниз несколько раз.
    2. Добавьте 700 мкл безантибиотиков 100%D2O-содержащей MHB среды к 300 мкл бактерий без антибиотиков (приготовленных на стадии 2.6.1) в качестве пустого контроля.
    3. Инкубировать при 37 °C в инкубационном шейкере при 200 об/мин в течение дополнительных 30 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На данном этапе конечная концентрацияD2Oв среде для испытания составляет 70%.
  10. Сначала центрифугируют 1 мл антибиотика иD2O-обработанного бактериальным образцом при 6200 х г в течение 5 мин при 4 °C, а затем дважды промывают очищенной водой. Наконец, зафиксируйте образцы в 10% растворе формалина и храните их при 4 °C.

3. Подготовка бактерий в мочевой среде (Рисунок 2б)

  1. Чтобы приготовить E. coli BW 25113 на логарифмической фазе, выполните действия, описанные в пунктах 1.4 и 1.5.
  2. Проверьте концентрацию бактерий, измерив OD фотометром на длине волны 600 нм.
  3. Чтобы имитировать клинические образцы ИМП 14,18,41, увеличьте раствор E. coli в 10 мл деидентифицированной мочи, чтобы достичь конечной концентрации клеток 10 6 КОЕ/мл.
  4. Отфильтруйте шипованную мочу E. coli с помощью фильтра 5 мкм, а затем разделите бактериальный раствор на 300 мкл аликвот на семь микропробирок 1,5 мл и 600 мкл аликвот бактериального раствора в одной микропробирке 1,5 мл.
  5. Проводят инкорпорациюD2Oв присутствии антибиотиков и забор образцов, как описано в предыдущих шагах от 2.4 до 2.10.

4. Подготовка бактерий в среде крови (рисунок 2с)

  1. Чтобы приготовить Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 на логарифмической фазе, выполните действия 1.4 и 1.5.
  2. Для имитации клинических инфекций кровотока образцы 42,43, всплеск P. aeruginosa в 1 мл деидентифицированной крови человека достигает концентрации 10 7 КОЕ/мл.
  3. Добавьте 9 мл стерильной очищенной воды для лизирования крови.
  4. Фильтруйте P. aeruginosa с шипованной кровью с помощью фильтра 5 мкм. Затем собирают бактерии до объема 1 мл путем центрифугирования при 6200 х г в течение 5 мин при 4 °C.  Добавьте 9 мл предварительно подогретого нормального MHB в раствор бактерий и осторожно вихрь. Конечная концентрация бактерий составляет 106 КОЕ/мл
  5. Разделите шипованный раствор крови P. aeruginosa на 300 мкл аликвот на семь микропробирок по 1,5 мл и 600 мкл аликвот бактериального раствора в одной микропробирке объемом 1,5 мл.
  6. Проводят инкорпорациюD2Oв присутствии антибиотиков и забор образцов, как описано в предыдущих шагах от 2.4 до 2.10.

5. SRS-визуализация метаболического включенияD2O в одну бактерию

  1. Промыть 1 мл неподвижного раствора бактерий очищенной водой, а затем центрифугу при 6200 х г в течение 5 мин при 4 °C. Удалите супернатант. Обогатите бактериальный раствор примерно до 20 мкл.
  2. Нанесите бактериальный раствор на покрытие с поли-L-лизином. Сэндвич и запечатывание образца для визуализации SRS.
  3. Визуализируйте бактерии на вибрационной частоте C-D при 2168 см-1 с помощью микроскопа SRS.
    1. Введите и настройте длину волны насоса до 852 нм с помощью управляющего программного обеспечения на компьютере.
    2. Измерьте мощность лазера с помощью измерителя мощности. Установите мощность накачки лазера в образце на ~8 мВт, а мощность лазера Стокса на образце на ~40 мВт, отрегулировав полуволновую пластину перед выходом лазера.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В микроскопе SRS перестраиваемый фемтосекундный лазер с частотой повторения 80 МГц обеспечивает возбуждение накачки (от 680 до 1300 нм) и Стокса (1045 нм).
  4. Регулируя винты зеркал отражения, пространственно выровняйте накачку и лучи Стокса и направьте два луча в вертикальный микроскоп, оснащенный зеркальной системой 2D galvo для лазерного сканирования.
    1. Используйте 60-кратный объектив погружения в воду, чтобы сфокусировать насос и лазеры Стокса на образце.
    2. Используйте масляный конденсатор для сбора сигналов от образца в прямом направлении.
    3. Используйте полосовой фильтр, чтобы отфильтровать лазер Стокса, прежде чем направить его в фотодиод.
    4. Извлеките стимулированный рамановский сигнал с помощью блокирующего усилителя и определите сигналы с помощью фотодиода.
  5. Установите каждое изображение SRS на содержание 200 x 200 пикселей и время ожидания пикселя для 30 мкс на панели управления программного обеспечения. Общее время получения одного изображения составляет ~1,2 с. Установите размер шага на 150 нм, чтобы размер изображения составлял около 30 x 30мкм2. Изображение не менее трех полей представлений для каждого образца.

6. Обработка изображений и анализ данных (рисунок 3)

  1. Чтобы получить среднюю интенсивность сигнала C-D, открывайте и обрабатывайте изображения SRS с помощью программного обеспечения ImageJ.
  2. Сначала преобразуйте изображения SRS в изображения 8-битного типа с перевернутым цветом, щелкнув Изображение | Тип | 8-разрядный, а затем Изменить | Инвертируйте кнопки в программном обеспечении ImageJ.
  3. Затем отфильтруйте изображения с помощью размытия Гаусса, щелкнув Обработать | фильтры | Гауссовские кнопки размытия и установите для параметра Sigma (Радиус) значение 1.
  4. Используйте настройку порога изображения, чтобы выбрать бактериальную область. Нажмите | изображений Отрегулируйте | Пороговое значение для обеспечения того, чтобы выбранные размеры бактерий соответствовали размерам на исходных изображениях SRS. Устраните мелкие частицы, отрегулировав порог размера для определения частиц. Нажмите кнопку Применить.
  5. Применение | анализа Кнопки анализа частиц для маркировки и определения площади бактерий.
  6. Нажав кнопку «Показать все» в менеджере ROI на исходное необработанное изображение SRS, пометьте ту же область бактерий, определите среднюю интенсивность каждой точки данных, нажав кнопку «Измерить» в диспетчере ROI.
  7. Обведите область фона на исходном изображении SRS и измерьте среднюю интенсивность фона. Среднюю интенсивность C-D каждой бактерии получают путем вычета интенсивности фонового сигнала.

7. Количественное определение чувствительности к противомикробным препаратам с помощью SC-MIC

ПРИМЕЧАНИЕ: Пороговое значение на уровне 0,60 для определения SC-MIC установлено в соответствии со статистическим анализом интенсивностей SRS C-D условий активности метаболизма и ингибирования метаболизма для бактерий при различных концентрациях лекарственного воздействия40. Интенсивность C-D для групп, чувствительных к антибиотикам, и устойчивых к антибиотикам, была снабжена нормальным распределением.

  1. Постройте кривую рабочих характеристик приемника (ROC) и оцените порог отсечки на уровне 0,60. Исходя из этого порогового значения, SC-MIC как показатель эффективности антибиотиков может быть определен для определения метаболически неактивной и метаболически активной группы.
  2. Чтобы количественно проанализировать данные визуализации SRS, постройте гистограммы интенсивности сигнала C-D для каждой группы бактерий, получавших последовательно разбавленную концентрацию антибиотиков. Цветные точки данных обозначают разные отдельные бактерии.
  3. Нормализовать интенсивность С-D группы, получавшей антибиотики, до средней интенсивности контрольной группы без лечения антибиотиками. Определить результаты SC-MIC различных комбинаций бактерий и антибиотиков путем количественной оценки интенсивности сигнала SRS в области C-D по сравнению с различными концентрациями антибиотиков, используя пороговое значение 0,60.
  4. Проверьте и сравните показания SC-MIC с показаниями MIC, определенными с использованием обычного анализа микроразбавления бульона.
  5. По данным Института клинических и лабораторных стандартов (CLSI), категория восприимчивости, основанная на результатах метаболической визуализации SRS для каждого тестируемого бактериального штамма, интерпретируется как «восприимчивая», «резистентная» или «промежуточная».

Результаты

Влияние инкубационного времени на инкорпорацию дейтерия измеряется спонтанной рамановской микроспектроскопией в области C-D (от 2070 до 2250 см-1) и C-H (от 2 800 до 3 100 см-1) (рисунок 4a). Покадровые одноклеточные рамановские спектры P. aeruginosa , культивируемые в среде,...

Обсуждение

Быстрый АСТ может быть получен путем оценки ответа бактериальной метаболической активности на лечение антибиотиками с использованием одноклеточной метаболической визуализации SRS в течение 2,5 ч от образца до результатов SC-MIC. Реакция бактериальной метаболической активности и антимик?...

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Благодарности

Эта работа была поддержана NIH R01AI141439 для J.-X.C и M.S, и R35GM136223 для J.-X.C.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Acousto-optic modulationGooch&HousegoR15180-1.06-LTDModulating stokes laser beam
AmoxicillinSigma AldrichA8523-5G
Bandpass filterChromaHQ825/150mBlock the stokes laser beam before the photodiode
Calcium chlorideSigma AldrichC1016-100GCation adjustment
Cation-adjusted Mueller-Hinton BrothFisher ScientificB12322Antimicrobial susceptibility testing of microorganisms by broth dilution methods
CentrifugeThermo Scientific75002542
Cover GlassesVWR16004-318
Culture tube with snap capFisher brand149569B
DaptomycinAcrosA0386346
Deuterium oxide151882Organic solvent to dissolve antibiotics
Deuterium oxide-d6Sigma Aldrich156914Organic solvent as a standard to calibrate SRS imaging system
Escherichia coli BW 25113The Coli Genetic Stock Center7636
Eppendorf polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mLFisher brand05-408-129
Gentamicin sulfateSigma AldrichG4918
Hydrophilic Polyvinylidene Fluoride filtersMillipore-SigmaSLSV025NBpore size 5 µm
ImageJ softwareNIHVersion: 2.0.0-rc-69/1.52tImage processing and analysis
Incubating orbital shaker set at 37 °CVWR97009-890
Inoculation loopSigmaBR452201-1000EA
InSight DeepSee femtosecond pulsed laserSpectra-PhysicsModel: insight X3Tunable laser source and fixed laser source at 1045 nm for SRS imaging
Lock-in amplifierZurich InstrumentHF2LIDemodulate the SRS signals
Oil condenserOlympusU-AACNA 1.4
Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 (PAO1)American Type Culture CollectionATCC 47085
PhotodiodeHamamatsuS3994-01Detector
Polypropylene conical tube 15 mLFalcon14-959-53A
Polypropylene filtersThermo Scientific726-2520pore size 0.2 µm
Sterile petri dishesCorning07-202-031
Syringe 10 mLFisher brand14955459
UV/Vis SpectrophotometerBeckman CoulterModel: DU 530Measuring optical density at wavelength of 600 nm
Vortex mixerVWR97043-562
Water objectiveOlympusUPLANAPO/IR60×, NA 1.2

Ссылки

  1. O'Neill, J. Tackling drug-resistant infections globally: final report and recommendations. The review on Antimicrobial Resistance. , (2016).
  2. Sugden, R., Kelly, R., Davies, S. Combatting antimicrobial resistance globally. Nature Microbiology. 1 (10), 16187 (2016).
  3. Kumar, A., et al. Duration of hypotension before initiation of effective antimicrobial therapy is the critical determinant of survival in human septic shock. Critical Care Medicine. 34 (6), 1589-1596 (2006).
  4. Reller, L. B., Weinstein, M., Jorgensen, J. H., Ferraro, M. J. Antimicrobial susceptibility testing: a review of general principles and contemporary practices. Clinical Infectious Diseases. 49 (11), 1749-1755 (2009).
  5. Frickmann, H., Masanta, W. O., Zautner, A. E. Emerging rapid resistance testing methods for clinical microbiology laboratories and their potential impact on patient management. BioMed Research International. 2014, 375681 (2014).
  6. Avesar, J., et al. Rapid phenotypic antimicrobial susceptibility testing using nanoliter arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (29), 5787-5795 (2017).
  7. Schoepp, N. G., et al. Digital quantification of DNA replication and chromosome segregation enables determination of antimicrobial susceptibility after only 15 minutes of antibiotic exposure. Angewandte Chemie International Edition. 55 (33), 9557-9561 (2016).
  8. van Belkum, A., et al. Innovative and rapid antimicrobial susceptibility testing systems. Nature Reviews Microbiology. 18 (5), 299-311 (2020).
  9. Hou, Z., An, Y., Hjort, K., Sandegren, L., Wu, Z. Time lapse investigation of antibiotic susceptibility using a microfluidic linear gradient 3D culture device. Lab on a Chip. 14 (17), 3409-3418 (2014).
  10. Choi, J., et al. Rapid antibiotic susceptibility testing by tracking single cell growth in a microfluidic agarose channel system. Lab on a Chip. 13 (2), 280-287 (2013).
  11. Lu, Y., et al. Single cell antimicrobial susceptibility testing by confined microchannels and electrokinetic loading. Analytical Chemistry. 85 (8), 3971-3976 (2013).
  12. Kim, S. C., Cestellosblanco, S., Inoue, K., Zare, R. N. Miniaturized antimicrobial susceptibility test by combining concentration gradient generation and rapid cell culturing. Antibiotics. 4 (4), 455-466 (2015).
  13. Choi, J., et al. A rapid antimicrobial susceptibility test based on single-cell morphological analysis. Science Translational Medicine. 6 (267), (2014).
  14. Baltekin, &. #. 2. 1. 4. ;., Boucharin, A., Tano, E., Andersson, D. I., Elf, J. Antibiotic susceptibility testing in less than 30 min using direct single-cell imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (34), 9170-9175 (2017).
  15. Fredborg, M., et al. Real-time optical antimicrobial susceptibility testing. Journal of Clinical Microbiology. 51 (7), 2047-2053 (2013).
  16. Choi, J., et al. A rapid antimicrobial susceptibility test based on single-cell morphological analysis. Science Translational Medicine. 6 (267), (2014).
  17. Barczak, A. K., Hung, D. T. RNA signatures allow rapid identification of pathogens and antibiotic susceptibilities. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (16), 6217-6222 (2012).
  18. Schoepp, N. G., et al. Rapid pathogen-specific phenotypic antibiotic susceptibility testing using digital LAMP quantification in clinical samples. Science Translational Medicine. 9 (410), (2017).
  19. Novelli-Rousseau, A., et al. Culture-free antibiotic-susceptibility determination from single-bacterium Raman spectra. Scientific Reports. 8 (1), 1-12 (2018).
  20. Schröder, U. -. C., et al. Detection of vancomycin resistances in enterococci within 3 1/2 hours. Scientific Reports. 5, 8217 (2015).
  21. Liu, C. -. Y., et al. Rapid bacterial antibiotic susceptibility test based on simple surface-enhanced Raman spectroscopic biomarkers. Scientific Reports. 6 (1), 1-15 (2016).
  22. Chang, K. -. W., et al. Antibiotic susceptibility test with surface-enhanced raman scattering in a microfluidic system. Analytical Chemistry. 91 (17), 10988-10995 (2019).
  23. Galvan, D. D., Yu, Q. surface-enhanced raman scattering for rapid detection and characterization of antibiotic-resistant bacteria. Advanced Healthcare Materials. 7 (13), 1701335 (2018).
  24. Kirchhoff, J., et al. Simple ciprofloxacin resistance test and determination of minimal inhibitory concentration within 2 h using raman spectroscopy. Analytical Chemistry. 90 (3), 1811-1818 (2018).
  25. Zhang, Z., Chen, L., Liu, L., Su, X., Rabinowitz, J. D. Chemical basis for deuterium labeling of fat and NADPH. Journal of the American Chemical Society. 139 (41), 14368-14371 (2017).
  26. Shi, L., et al. Optical imaging of metabolic dynamics in animals. Nature Communications. 9 (1), 2995 (2018).
  27. Berry, D., et al. Tracking heavy water (D2O) incorporation for identifying and sorting active microbial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (2), 194-203 (2015).
  28. Tao, Y., et al. Metabolic-activity-based assessment of antimicrobial effects by D2O-labeled single-cell raman microspectroscopy. Analytical Chemistry. 89 (7), 4108-4115 (2017).
  29. Yang, K., et al. Rapid antibiotic susceptibility testing of pathogenic bacteria using heavy water-labeled single-cell raman spectroscopy in clinical samples. Analytical Chemistry. 91 (9), 6296-6303 (2019).
  30. Song, Y., et al. Raman-Deuterium Isotope Probing for in-situ identification of antimicrobial resistant bacteria in Thames River. Scientific reports. 7 (1), 16648 (2017).
  31. Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  32. Cheng, J. -. X., Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 350 (6264), (2015).
  33. Zhang, C., Zhang, D., Cheng, J. -. X. Coherent Raman scattering microscopy in biology and medicine. Annual Review of Biomedical Engineering. 17, 415-445 (2015).
  34. Yue, S., Cheng, J. -. X. Deciphering single cell metabolism by coherent Raman scattering microscopy. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 46-57 (2016).
  35. Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
  36. Ji, M., et al. Rapid, Label-free detection of brain tumors with stimulated Raman scattering microscopy. Science Translational Medicine. 5 (201), (2013).
  37. He, R., Liu, Z., Xu, Y., Huang, W., Ma, H., Ji, M. Stimulated Raman scattering microscopy and spectroscopy with a rapid scanning optical delay line. Optics Letters. 42 (4), 659-662 (2017).
  38. Suzuki, Y., et al. Label-free chemical imaging flow cytometry by high-speed multicolor stimulated Raman scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (32), 15842-15848 (2019).
  39. Camp, C. H., et al. High-Speed Coherent Raman Fingerprint Imaging of Biological Tissues. Nature Photonics. 8, 627-634 (2014).
  40. Zhang, M., et al. Rapid determination of antimicrobial susceptibility by stimulated raman scattering imaging of D2O metabolic incorporation in a single bacterium. Advanced Science. 7 (19), 2001452 (2020).
  41. Michael, I., et al. A fidget spinner for the point-of-care diagnosis of urinary tract infection. Nature Biomedical Engineering. 4 (6), 591-600 (2020).
  42. Bhattacharyya, R. P., et al. Simultaneous detection of genotype and phenotype enables rapid and accurate antibiotic susceptibility determination. Nature Medicine. 25 (12), 1858-1864 (2019).
  43. Stupar, P., et al. Nanomechanical sensor applied to blood culture pellets: a fast approach to determine the antibiotic susceptibility against agents of bloodstream infections. Clinical Microbiology and Infection. 23 (6), 400-405 (2017).
  44. Barber, A. E., Norton, J. P., Spivak, A. M., Mulvey, M. A. Urinary Tract Infections: Current and Emerging Management Strategies. Clinical Infectious Diseases. 57 (5), 719-724 (2013).
  45. Cohen, J., et al. Sepsis: a roadmap for future research. The Lancet Infectious Diseases. 15 (5), 581-614 (2015).
  46. Choi, J., et al. rapid antimicrobial susceptibility test from positive blood cultures based on microscopic imaging analysis. Scientific Reports. 7 (1), 1148 (2017).
  47. Gherardi, G., et al. Comparative evaluation of the Vitek-2 Compact and Phoenix systems for rapid identification and antibiotic susceptibility testing directly from blood cultures of Gram-negative and Gram-positive isolates. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 72 (1), 20-31 (2012).
  48. Machen, A., Drake, T., Wang, Y. F. Same day identification and full panel antimicrobial susceptibility testing of bacteria from positive blood culture bottles made possible by a combined lysis-filtration method with MALDI-TOF VITEK mass spectrometry and the VITEK2 system. Plos One. 9, 87870 (2014).
  49. Simon, L., et al. Direct identification of 80 percent of bacteria from blood culture bottles by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry using a 10-minute extraction protocol. Journal of Clinical Microbiology. 57 (2), 01278 (2019).
  50. Leekha, S., Terrell, C. L., Edson, R. S. General principles of antimicrobial therapy. Mayo Clinic Proceedings. 86 (2), 156-167 (2011).
  51. Johnson, L., et al. Emergence of fluoroquinolone resistance in outpatient urinary Escherichia coli isolates. The American Journal of Medicine. 121 (10), 876-884 (2008).
  52. Van Belkum, A., et al. Developmental roadmap for antimicrobial susceptibility testing systems. Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 51-62 (2019).
  53. Dubourg, G., Lamy, B., Ruimy, R. Rapid phenotypic methods to improve the diagnosis of bacterial bloodstream infections: meeting the challenge to reduce the time to result. Clinical Microbiology and Infection. 24 (9), 935-943 (2018).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

180

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены