稳定纵向 在Vivo 细胞级可视化胰腺在穆林模型与胰腺内活性成像窗口

摘要

胰 腺的体内高分辨率成像利用胰腺内成像窗口获得便利。

摘要

在活体小动物模型中，胰腺的直接 体内 细胞分辨率成像在技术上具有挑战性。最近的一项活体成像研究，带有腹部成像窗口，使 体内腹部器官中的细胞动力学可视化。然而，由于小鼠胰腺的软板状结构很容易受到生理运动（如持久性和呼吸）的影响，因此很难在细胞水平上在几周内进行稳定的 纵向体内 成像，以识别、跟踪和量化小鼠胰腺中的胰岛或癌细胞。在此，我们描述了一种植入新颖支撑基座的方法，一个集成的胰腺内成像窗口，可以在空间上将胰腺与肠道分离，用于胰腺微结构的纵向延时活性成像。带成像窗口 的纵向体内 成像可实现稳定的可视化，从而在 3 周内跟踪小岛，并实现微观结构的高分辨率三维成像，这一点在正位胰腺癌模型中就证明了这一点。通过我们的方法，进一步的活体成像研究可以阐明细胞水平上涉及胰腺的各种疾病的病理生理学。

引言

胰腺是一种腹部器官，在消化道中具有外分泌功能，内分泌激素在血液中。胰腺的高分辨率细胞成像可以揭示涉及胰腺的各种疾病的病理生理学，包括胰腺炎、胰腺癌和糖尿病^1。传统的诊断成像工具，如计算机断层扫描，磁分辨率成像和超声波学在临床领域广泛提供^1，2。然而，这些成像模式仅限于可视化只有结构或解剖变化，而改变在细胞或分子水平无法确定。鉴于人类糖尿病或胰腺癌的分子变化可在诊断前10年以上启动^，因此，在潜伏期从分子过渡中发现胰腺疾病有可能提供早期诊断和及时干预。因此，通过提供胰腺癌的早期诊断或在糖尿病⁵进展期间对胰岛变化的提前识别，能够克服分辨率的局限性并提供对功能的宝贵见解的成像将显著获得关注。

特别是小岛，核成像、生物发光成像和光学相干断层扫描被推荐为非侵入性胰岛成像技术^6。然而，这些方法的分辨率非常低，典型值从几十微米到几百微米不等，因此检测胰岛细胞水平变化的能力有限。另一方面，以前对小岛的高分辨率研究是在前^体7、8（例如， 胰腺切片或消化）、非生理^9（例如胰腺外化）和异位条件^{10、11、12（}例如，植入肾胶囊下、肝脏内和眼睛前室），这限制了其解释和临床影响。如果能建立高分辨率成像的体内、生理学和矫形模型，将成为胰岛研究的重要平台。

活体动物的体内成像揭示了一种微观分辨率的病理生理学，最近^{受到人们的}极大关注。 在体内 成像方法中，腹部成像窗口¹⁴的开发，将一个窗口植入老鼠的腹部，使得发现了新的发现（即早期肝转移¹⁵ 的微观美斯塔西阶段和肠道上皮¹⁶的干细胞维持机制）。虽然腹部成像窗口提供了宝贵的结果，但这一窗口对胰腺的应用以及基于涉及胰腺的疾病的活体成像研究尚未得到广泛调查。

与人类胰腺的明确定义的实体器官特征不同，小鼠的胰腺是一种分布分散的软组织状结构^17。因此，它不断受到生理运动的影响，包括腹膜和呼吸。先前关于为胰腺应用腹部成像窗口的研究表明，流浪是由于排便引起的运动伪^{影引起的。}在生成的平均图像中观察到严重的模糊，这妨碍了微尺度结构的可视化和识别。

在此，我们描述了使用一种新的支持基础集成胰腺内成像窗口结合活体显微镜^19，20调查纵向细胞水平事件涉及胰腺的疾病。除了对上一研究¹⁸中的方法进行详细描述外，本文还将探讨胰腺成像窗口对涉及胰腺的各种疾病的扩展应用。在此协议中，定制的视频速率激光扫描共聚焦显微镜系统被用作活体显微镜系统。四个激光模块（波长为 405、488、561 和 640 nm）用作激发源，光磁体管 （PMT） 通过带通滤波器 （BPF1: FF01-442/46） 检测到四个发射信号通道:BPF2: FF02-525/50;BPF3: FF01-600/37;BPF4: FF01-685/40）。激光扫描由旋转多边形镜 （X 轴） 和镀锌仪扫描镜 （Y 轴） 组成，使视频速率扫描（每秒 30 帧）成为可能。关于活体显微镜的详细资料在以前的研究中已经描述了10，18，19，20，21，22，23。

在我们之前的小岛研究¹⁸中，我们使用转基因小鼠模型（MIP-GFP）24成功地稳定地对活鼠中的胰岛进行了成像，其中小岛被标记为GFP。该方法使小岛的变化在1周内实现了高分辨率可视化。它还有助于对同一小岛进行长达3周的成像，这表明在糖尿病¹⁸的发病机制期间，对胰岛进行长期研究以进行功能跟踪或监测的可行性。此外，我们开发了一个正位胰腺癌模型，其中荧光胰腺癌细胞（PANC-1 NucLight^Red）25被直接植入小鼠的胰腺。利用胰腺内成像窗口，该模型可作为研究胰腺癌肿瘤微环境细胞和分子病理生理学以及新型药物候选物的治疗监测的平台。

研究方案

本文描述的所有程序均按照《实验室动物护理和使用指南^{》（2011年} ）第8版（2011^年）26 日进行，并经韩国高等科学技术研究院（KAIST）和首尔国立大学邦当医院（SNUBH）机构动物护理和使用委员会批准。

1. 准备窗户和其他材料

1. 定制设计胰腺内成像窗口，使胰腺与腹腔内的肠道分离^18（图1A，B）。在先前研究¹⁸的补充数字中描述了窗口的详细蓝图。
2. 使用C57BL/6N小鼠，8-12周大的雄性，进行活体胰腺成像。注射抗CD31抗体与Alexa 647氟合体，在成像前2小时，用于容器标记^18。
3. 对于胰岛研究，准备一个转基因小鼠模型，其中小岛被标记为荧光记者蛋白。在这里，我们利用了MIP-GFP，其中绿色荧光蛋白在小鼠胰岛素1基因促进剂的控制下表达，该基因促进剂活跃在小鼠²⁴个胰岛的所有β细胞中。
4. 对于胰腺癌研究，准备带有荧光记者蛋白和BALB/C裸鼠标签的转基因癌细胞。在这项研究中，使用了PANC-1核光红细胞。PANC-1癌细胞²⁵ 被贴上了NucLight红荧光探针的标签。
5. 消毒所有手术工具，盖玻璃（是否使用PEG），以及使用高压灭菌器成像窗户。
6. 将 PEG 涂层涂层涂在盖玻璃上，以防止炎症反应并增加生物相容性，这适用于长期成像。

2. 手术

1. 准备一个无菌手术平台，用70%的乙醇对表面进行消毒。
   注:对于纵向成像会话，无菌技术至关重要。
2. 用铁胺/佐拉泽帕姆（30毫克/千克）和西拉津（10毫克/千克）的混合物麻醉小鼠。
   注:建议使用二聚氰胺/佐拉泽帕姆代替氯胺酮，因为它对高血糖的不利影响。最佳麻醉应选择为实验^{的目的9，27。}
3. 使用直肠探头使用家用热控制加热垫监控体温。
4. 剃掉鼠标的左翼，并应用三轮交替酒精和碘为基础的磨砂。
   注意:如果使用脱皮霜，请不要离开超过 1 分钟以避免化学灼伤。
5. 在小鼠的左侧切开1.5厘米的切口，解剖皮肤和肌肉。
6. 在切口边缘用黑色或尼龙 4-0 缝合进行钱包串缝合。
7. 在切口上使用微型缩回器，轻轻地露出脾脏。
8. 小心地用环钳将脾脏集中，并识别胰腺。
9. 将窗口放在鼠标的侧翼，通过窗户的空地穿过脾脏和胰腺。胰腺的操纵必须是非常外邦的，因为它可能导致出血或胰腺炎
10. 轻轻地将胰腺放在成像窗的板上;脾脏将被放置在窗口的开放空间。
11. 对于癌细胞研究，将PANC-1 NucLight Red（1.0 x 10⁶ 细胞）直接注射到胰腺中。
    注:对于矫形人类胰腺癌异种细胞的成像，直接植入癌细胞，如PANC-1或其他人类胰腺癌细胞，可以促进^28。为了用活光显微镜可视化，PANC-1细胞被用红色荧光蛋白用NucLight红扁豆试剂进行转化，该试剂标记核^29。虽然最大注射量不确定，但尽可能减少体积以避免胰腺的压力效应。
12. 在成像窗口边缘涂抹 N-丁基氰酸丙烯酸酯胶水滴。
    1. 要最大限度地减少涂用胶水的量，请使用 31 G 导管针进行应用。如果掉落量大，则组织会无意中粘附在窗户或盖玻璃上。
13. 轻轻地将 12 mm 圆形盖玻璃涂抹到成像窗的边缘。
14. 拉缝合圈，以适应窗口的横向凹槽，并绑它三次。
15. 切开结的最大近端部位，以防止这些小鼠清醒时紧缝的中断。
16. 让小鼠从麻醉（2-3小时）中恢复过来，注射酮洛芬（5毫克/千克，皮下在动物颈部或臀部底部的松弛皮肤）以缓解疼痛。每12小时重新评估疼痛迹象，每24小时考虑酮普罗芬1-3天。
    注:镇痛影响胰岛素分泌反应葡萄糖^9。镇痛的选择和时间必须个性化的实验目的。
17. 将鼠标用足够的床上用品安置在笼子里，以避免窗户与笼子接触。避免在没有窗户手术的情况下与老鼠一起住房子。

3. 活性成像

1. 打开活性显微镜，包括激光功率。
2. 打开加热垫，将家用热调节设置为 37 °C。
   注意:如果没有家用热调节，或者使用具有频繁控制的被动加热垫或灯。
3. 用提拉胺/佐拉泽帕姆（30毫克/千克）和西拉津（10毫克/千克）的混合物进行肌肉内麻醉。
   注:建议使用二聚氰胺/佐拉泽帕姆代替氯胺酮，因为它对高血糖的不利影响。最佳麻醉应选择为实验^{的目的9，27。}
4. 插入血管导管进行注射。
   1. 用食指和第三指对尾部近端施加压力，作为旅游应用的替代方案。如有必要，用灯加热尾部。
   2. 用 70% 乙醇喷雾消毒尾静脉。
   3. 将 30 G 导管插入横向尾静脉。血液的再生将在PE10管中可视化。
   4. 在导管上涂上丝胶带来稳定它。
   5. 根据荧光探头¹⁸的组合，酌情注射FITC/TMR dextran或其他荧光探针（25微克抗CD31与Alexa 647结合）。
      注意:对于荧光结合抗体探头，在成像会话前注射 2 小时。
5. 将鼠标从手术平台转移到成像阶段。
6. 插入直肠探头，通过家用热加热垫系统自动控制体温。
7. 将胰腺成像窗口插入在活体显微镜设置期间准备的窗口支架（图2）。对于倒置显微镜，可能需要窗口支架。
8. 执行活性成像。
   1. 对于胰腺成像，从低放大倍率客观透镜（例如 4 倍）开始，用于扫描胰腺成像窗口中胰腺的整体视图（建议视野:2500 x 2500 μm）。
   2. 确定感兴趣区域后，切换到更高的放大倍率目标镜头（20 倍或 40 倍）以执行细胞水平成像（建议视场:500 x 500 μm 或 250 x 250 μm）。在本实验中，横向和轴向分辨率分别为约 0.5 μm 和 3 μm。
   3. 执行 z 堆栈或延时成像，以观察 3D 结构或细胞级动态（如细胞迁移）。
      注:对于转基因动物（MIP-GFP）的荧光蛋白表达细胞进行成像，30s间歇性488纳米激光照射，功率高达0.43mW，可耐受，不会明显光出血或组织损伤。对于标有Alexa 647的荧光蛋白进行成像，640 nm 激光功率高达 0.17 mW 是可以容忍的，不会明显光出血或组织损伤。长时间激发激光照射，其功率高于此设置可能导致光毒性导致光出血或组织损伤。调整足够的收益和权力，以适当地形象化感兴趣的区域。对于研究所准备的每一次活性显微镜，必须个性化地设置活体显微镜中的参数。

结果

活体显微镜结合支持基础集成胰腺内成像窗口，使小鼠胰腺的纵向细胞水平成像。此与胰腺内成像窗口的协议提供了长期组织稳定性，使高分辨率成像的获取能够跟踪单个小岛长达 3 周。因此，可以实现扩展视野的马赛克成像、Z 堆栈成像的三维 （3D） 重建以及同一位置的纵向跟踪。此外，我们的活体显微镜提供四个通道（405、488、561 和 647 nm）的采集，从而能够同时实现多个细胞可视化及其相?...

讨论

此处描述的协议包括胰腺的活体成像，使用从腹部成像窗口修改的新型支持基础集成胰腺内成像窗口。在上述协议中，第一个关键步骤是将活体胰腺成像窗口植入小鼠体内。对于胶水在窗口中的应用，在窗口边缘和盖玻璃之间涂抹胶水很重要，但不要涂在胰腺组织上，因为它可能会显著中断活体成像。如果胶水直接涂在组织上，不仅玻璃和组织之间的胶水本身，而且辅助的灰尘颗粒也会在成像过?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 647 Succinimidyl Esters (NHS esters)	Invitrogen	A20006	Fluorescent probe for conjugate with antibody
BALB/C Nude	OrientBio	BALB/C Nude	BALB/C Nude
BD Intramedic polyethylene tubing	BD Biosciences	427401	PE10 catheter for connection with needle
C57BL/6N	OrientBio	C57BL/6N	C57BL/6N
Cover glasses circular	Marienfeld	0111520	Cover glass for pancreatic imaging window
FITC Dextran 2MDa	Merck (Former Sigma Aldrich)	FD200S	For vessel identification
IMARIS 8.1	Bitplane	IMARIS	Image processing
Intravital Microscopy	IVIM tech	IVM-C	Intravital Microscopy
IRIS Scissor	JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD	S-1107-10	This product can be replaced with the product from other company
Loctite 401	Henkel	401	N-butyl cyanoacrylate glue
Micro Needle holder	JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD	H-1126-10	This product can be replaced with the product from other company
Micro rectractor	JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD	17004-03	This product can be replaced with the product from other company
Microforceps	JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD	F-1034	This product can be replaced with the product from other company
MIP-GFP	The Jackson Laboratory	006864	B6.Cg-Tg(Ins1-EGFP)1Hara/J
Nylon 4-0	AILEE	NB434	Non-Absorbable Suture
Omnican N 100 30G	B BRAUN	FT9172220S	For Vascular Catheter, Use only Needle part
PANC-1 NucLightRed	Custom-made	Custom-made	Made in laboratory
Pancreatic imaging window	Geumto Engineering	Custom order	Pancreatic imaging window - custom order
Physiosuite	Kent Scientific	PS-02	Homeothermic temperature controller
Purified NA/LE Rat Anti-Mouse CD31	BD Biosciences	553708	Antibody for in vivo vessel labeling
Ring Forceps	JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD	F-1090-3	This product can be replaced with the product from other company
Rompun	Bayer	Rompun	Anesthetic agent
TMR Dextran 65-85kDa	Merck (Former Sigma Aldrich)	T1162	For vessel identification
Window holder	Geumto Engineering	Custom order	Window holder - custom order
Zoletil	Virbac	Zoletil 100	Anesthetic agent