Visualizzazione longitudinale stabilizzata a livello cellulare in vivo del pancreas in un modello murino con una finestra di imaging intravitale pancreatico

Riepilogo

L'imaging ad alta risoluzione in vivo del pancreas è stato facilitato con la finestra di imaging intravitale pancreatico.

Abstract

L'imaging diretto in vivo a risoluzione cellulare del pancreas in un modello di piccolo animale vivo è stato tecnicamente impegnativo. Un recente studio di imaging intravitale, con una finestra di imaging addominale, ha permesso la visualizzazione delle dinamiche cellulari negli organi addominali in vivo. Tuttavia, a causa dell'architettura morbida del pancreas del topo che può essere facilmente influenzata dal movimento fisiologico (ad esempio, peristalsi e respirazione), è stato difficile eseguire l'imaging longitudinale in vivo stabilizzato per diverse settimane a livello cellulare per identificare, tracciare e quantificare isole o cellule tumorali nel pancreas del topo. Qui, descriviamo un metodo per impiantare una nuova base di supporto, una finestra di imaging intravitale pancreatica integrata, che può separare spazialmente il pancreas dall'intestino per l'imaging intravitale longitudinale time-lapse della microstruttura del pancreas. L'imaging longitudinale in vivo con la finestra di imaging consente una visualizzazione stabile, consentendo il tracciamento delle isole per un periodo di 3 settimane e l'imaging tridimensionale ad alta risoluzione della microstruttura, come evidenziato qui in un modello di cancro del pancreas ortotopico. Con il nostro metodo, ulteriori studi di imaging intravitale possono chiarire la fisiopatologia di varie malattie che coinvolgono il pancreas a livello cellulare.

Introduzione

Il pancreas è un organo addominale con una funzione esocrina nel tratto digestivo e una funzione endocrina di secernere ormoni nel flusso sanguigno. L'imaging cellulare ad alta risoluzione del pancreas potrebbe rivelare la fisiopatologia di varie malattie che coinvolgono il pancreas, tra cui pancreatite, cancro del pancreas e diabete mellito¹. Gli strumenti di diagnostica per immagini convenzionali come la tomografia computerizzata, l'imaging a risoluzione magnetica e l'ecografia sono ampiamente disponibili nel campo clinico^1,2. Tuttavia, queste modalità di imaging sono limitate alla visualizzazione solo di cambiamenti strutturali o anatomici, mentre le alterazioni a livello cellulare o molecolare non possono essere determinate. Dato che i cambiamenti molecolari nel diabete mellito o nel cancro del pancreas nell'uomo possono iniziare più di 10 anni prima della diagnosi^3,4, l'individuazione delle malattie pancreatiche dalla loro transizione molecolare durante il periodo latente ha il potenziale per fornire una diagnosi precoce e un intervento tempestivo. Pertanto, l'imaging che supererà i limiti della risoluzione e fornirà preziose informazioni sulla funzione guadagnerà notevolmente l'attenzione fornendo una diagnosi precoce del cancro del pancreas o l'identificazione avanzata dell'alterazione delle isole durante la progressione del diabete mellito⁵.

In particolare con le isole, l'imaging nucleare, l'imaging a bioluminescenza e la tomografia a coerenza ottica sono stati suggeriti come tecniche di imaging delle isole non invasive⁶. Tuttavia, la risoluzione di questi metodi è sostanzialmente bassa, con valori tipici che vanno da diverse decine a centinaia di micrometri, offrendo una capacità limitata di rilevare cambiamenti a livello cellulare negli isolotti. D'altra parte, precedenti studi ad alta risoluzione sulle isole sono stati eseguiti in condizioni ex vivo^7,8 (ad esempio, affettamento o digestione del pancreas),⁹ non fisiologico (ad esempio, esteriorizzazione del pancreas) e condizioni eterotopiche^10,11,12 (ad esempio, impianto sotto la capsula renale, all'interno del fegato e nella camera anteriore dell'occhio), che limita la loro interpretazione e le implicazioni cliniche. Se è possibile stabilire un modello in vivo,fisiologico e ortotopico di imaging ad alta risoluzione, sarà una piattaforma critica per lo studio delle isole pancreatiche.

L'imaging intravitale, che rivela la fisiopatologia a livello di risoluzione microscopica in un animale vivo, ha recentemente ricevuto grande attenzione¹³. Tra i metodi di imaging in vivo, lo sviluppo di una finestra di imaging addominale¹⁴, che impianta una finestra nell'addome di un topo, ha permesso la scoperta di nuovi risultati (cioè uno stadio di pre-micrometastasi delle metastasi epatiche precoci¹⁵ e meccanismo di mantenimento delle cellule staminali nell'epitelio intestinale¹⁶). Sebbene la finestra di imaging addominale fornisca risultati preziosi, le applicazioni di questa finestra per il pancreas e la conseguente ricerca di imaging intravitale basata su malattie che coinvolgono il pancreas, non sono state ampiamente studiate.

A differenza delle caratteristiche ben definite degli organi solidi del pancreas umano, il pancreas di un topo è una struttura simile ai tessuti molli diffusamente distribuita¹⁷. Pertanto, è incessantemente influenzato da movimenti fisiologici tra cui peristalsi e respirazione. Un precedente studio sull'applicazione di una finestra di imaging addominale per il pancreas ha dimostrato che il vagabondaggio si è verificato a causa di artefatti di movimento indotti da movimenti intestinali¹⁸. È stata osservata una grave sfocatura nell'immagine mediata risultante, che ha impedito la visualizzazione e l'identificazione delle strutture su microscala.

Qui, descriviamo l'uso di una nuova finestra di imaging intravitale pancreatico integrata di base di supporto combinata con la microscopia intravitale^19,20 per indagare gli eventi di livello cellulare longitudinale nelle malattie che coinvolgono il pancreas. Oltre a una descrizione dettagliata della metodologia nel precedente studio¹⁸, l'applicazione estesa della finestra di imaging pancreatico per varie malattie che coinvolgono il pancreas sarà affrontata in questo documento. In questo protocollo, un sistema di microscopia confocale a scansione laser a velocità video personalizzato è stato utilizzato come sistema di microscopia intravitale. Quattro moduli laser (lunghezze d'onda a 405, 488, 561 e 640 nm) sono stati utilizzati come sorgente di eccitazione e quattro canali di segnali di emissione sono stati rilevati da tubi fotomoltiplicatori (PMT) attraverso filtri passa-banda (BPF1: FF01-442/46; BPF2: FF02-525/50; BPF3: FF01-600/37; BPF4: FF01-685/40). La scansione laser consisteva in uno specchio poligonale rotante (asse X) e uno specchio di scansione galvanometro (asse Y) che consentivano la scansione della velocità video (30 fotogrammi al secondo). Informazioni dettagliate sulla microscopia intravitale sono state descritte negli studi precedenti^{10,18,19,20,21,22,23.}

Nel nostro precedente studio sulle isole^18,abbiamo ripreso con successo e stabilmente le isole in topi vivi utilizzando un modello murino transgenico (MIP-GFP)²⁴ in cui le isole sono state etichettate con GFP. Il metodo ha consentito la visualizzazione ad alta risoluzione dei cambiamenti negli isolotti per un periodo di 1 settimana. Ha anche facilitato l'imaging delle stesse isole per un massimo di 3 settimane, il che suggerisce la fattibilità di studi a lungo termine delle isole pancreatiche per il monitoraggio funzionale o il monitoraggio durante la patogenesi del diabete mellito¹⁸. Inoltre, abbiamo sviluppato un modello di carcinoma pancreatico ortotopico in cui le cellule tumorali pancreatiche fluorescenti (PANC-1 NucLight Red)²⁵ sono state impiantate direttamente nel pancreas del topo. Con l'applicazione della finestra di imaging intravitale pancreatico, questo modello potrebbe essere utilizzato come piattaforma per studiare la fisiopatologia cellulare e molecolare nel microambiente tumorale del cancro del pancreas e per il monitoraggio terapeutico di nuovi farmaci candidati.

Protocollo

Tutte le procedure descritte in questo documento sono state condotte in conformità con^{l'8a edizione} della Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio (2011)²⁶ e approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso il Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST) e il Seoul National University Bundang Hospital (SNUBH).

1. Preparazione della finestra e di altri materiali

1. Progettazione personalizzata della finestra di imaging intravitale pancreatico per isolare il pancreas dall'intestino nella cavità addominale¹⁸ (Figura 1A, B). Un progetto dettagliato della finestra è descritto in una figura supplementare di uno studio precedente¹⁸.
2. Utilizzare topi C57BL / 6N, maschi di 8-12 settimane, per l'imaging pancreatico intravitale. Iniettare l'anticorpo anti-CD31 coniugato con un fluoroforo Alexa 647, 2 ore prima dell'imaging, ai fini dell'etichettatura dei vasi¹⁸.
3. Per lo studio delle isole, preparare un modello murino transgenico in cui le isole sono etichettate con una proteina reporter fluorescente. Qui, abbiamo utilizzato MIP-GFP, dove la proteina fluorescente verde è stata espressa sotto il controllo del promotore del gene insulina 1 del topo, che è attivo nelle cellule beta di tutte le isole del topo²⁴.
4. Per lo studio sul cancro del pancreas, preparare cellule tumorali transgeniche etichettate con una proteina reporter fluorescente e topi nudi BALB / C. In questo studio, sono stati utilizzati i globuli rossi PANC-1 NucLight. Le cellule tumorali PANC-1²⁵ sono state etichettate con la sonda fluorescente NucLight Red.
5. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici, coprire il vetro (con PEG o meno) e le finestre di imaging utilizzando un'autoclave.
6. Applicare il rivestimento PEG sul vetro di copertura per prevenire la risposta infiammatoria e aumentare la biocompatibilità, che è adatto per l'imaging a lungo termine.

2. Chirurgia

1. Preparare una piattaforma chirurgica sterile e sterilizzare le superfici con il 70% di etanolo.
   NOTA: per le sessioni di imaging longitudinale, la tecnica asettica è essenziale.
2. Anestetizzare i topi con una miscela di tiletamina/zolazepam (30 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg).
   NOTA: L'uso di tiletamina / zolazepam è raccomandato al posto della ketamina a causa del suo effetto avverso di iperglicemia. L'anestesia ottimale dovrebbe essere selezionata ai fini dell'esperimento^9,27.
3. Monitorare la temperatura corporea utilizzando una sonda rettale con una piastra riscaldante controllata omeotermica.
4. Rasare il fianco sinistro del mouse e applicare tre cicli di alternanza di alcol e scrub a base di iodio.
   NOTA: Se si utilizza una crema depilatoria, non lasciare più di 1 minuto per evitare ustioni chimiche.
5. Fai un'incisione di 1,5 cm sul fianco sinistro del topo e seziona la pelle e il muscolo.
6. Eseguire una sutura a cordone di borsa con una sutura nera o nylon 4-0 nel margine dell'incisione.
7. Utilizzare un micro riavvolgitore sull'incisione ed esporre delicatamente la milza.
8. Mettere a bagno con cura la milza con una pinza ad anello e identificare il pancreas.
9. Posizionare la finestra sul fianco del mouse e passare la milza e il pancreas attraverso lo spazio aperto della finestra. La manipolazione del pancreas deve essere molto gentile in quanto può causare sanguinamento o pancreatite
10. Posizionare delicatamente il pancreas sulla piastra della finestra di imaging; la milza sarà posizionata sullo spazio aperto della finestra.
11. Per lo studio sulle cellule tumorali, iniettare PANC-1 NucLight Red (1,0 x 10⁶ cellule) direttamente nel pancreas.
    NOTA: Per l'imaging degli xenotrapianti ortotopici del cancro pancreatico umano, l'impianto diretto di cellule tumorali come PANC-1 o altre cellule tumorali pancreatiche umane potrebbe essere facilitato²⁸. Per visualizzare con microscopia a fluorescenza intravitale, le cellule PANC-1 sono state trasdotte con proteina fluorescente rossa utilizzando il reagente lentivirale NucLight Red che etichetta il nucleo²⁹. Sebbene il volume massimo di iniezione sia incerto, diminuire il volume il più possibile per evitare l'effetto di pressione nel pancreas.
12. Applicare gocce di colla N-butil cianoacrilato sul margine della finestra di imaging.
    1. Per ridurre al minimo la quantità di colla applicata, utilizzare un ago catetere da 31 G per l'applicazione. Se la quantità della goccia è grande, il tessuto aderirà involontariamente alla finestra o al vetro di copertura.
13. Applicare delicatamente un vetro di copertura rotondo da 12 mm sul margine della finestra di imaging.
14. Tirare il cappio di sutura per adattarlo alla scanalatura laterale della finestra e legarlo tre volte.
15. Tagliare il sito prossimale massimo del nodo per prevenire l'interruzione di punti stretti quando questi topi sono svegli.
16. Lasciare che i topi si riprendano dall'anestesia (2-3 ore) e iniettare ketoprofene (5 mg / kg, sottocutaneo nella pelle sciolta alla base del collo o dell'anca dell'animale) per alleviare il dolore. Rivalutare i segni di dolore ogni 12 ore e il ketoprofene dovrebbe essere considerato ogni 24 ore per 1-3 giorni.
    NOTA: L'analgesia influenza la secrezione di insulina in risposta al glucosio^9. La scelta e la tempistica dell'analgesia devono essere individualizzate a scopo sperimentale.
17. Accogliere il topo nella gabbia con biancheria da letto sufficiente per evitare il contatto della finestra con la gabbia. Evitare di alloggiare la casa con i topi senza l'intervento chirurgico alla finestra.

3. Imaging intravitale

1. Accendere il microscopio intravitale compresa la potenza laser.
2. Accendere la piastra riscaldante e impostare la regolazione omeotermica a 37 °C.
   NOTA: In alternativa, utilizzare una piastra riscaldante passiva o una lampada con controllo frequente se non vi è alcuna regolazione omeotermica.
3. Eseguire l'anestesia intramuscolare con una miscela di tiletamina/zolazepam (30 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg).
   NOTA: L'uso di tiletamina / zolazepam è raccomandato al posto della ketamina a causa del suo effetto avverso di iperglicemia. L'anestesia ottimale dovrebbe essere selezionata ai fini degli esperimenti^9,27.
4. Inserire un catetere vascolare per l'iniezione.
   1. Applicare una pressione sul lato prossimale della coda con l'indice e il terzo dito in alternativa all'applicazione del laccio emostatico. Riscaldare la coda con una lampada, se necessario.
   2. Sterilizzare la vena della coda con uno spray al 70% di etanolo.
   3. Inserire un catetere da 30 G nella vena laterale della coda. Il rigurgito di sangue sarà visualizzato nel tubo PE10.
   4. Applicare un nastro di seta sul catetere per stabilizzarlo.
   5. Iniettare IL DESTRANO FITC/TMR o altre sonde fluorescenti (25 μg di anti-CD31 coniugato con Alexa 647), a seconda dei casi, secondo la combinazione di sonde fluorescenti¹⁸.
      NOTA: per le sonde fluorescenti a anticorpi coniugati, iniettare 2 ore prima della sessione di imaging.
5. Trasferire il mouse dalla piattaforma chirurgica alla fase di imaging.
6. Inserire una sonda rettale per controllare automaticamente la temperatura corporea con il sistema di termoforo omeotermico.
7. Inserire la finestra di imaging pancreatico nel porta finestra preparato durante la configurazione della microscopia intravitale (Figura 2). Per un microscopio invertito, potrebbe non essere necessario un porta finestra.
8. Eseguire l'imaging intravitale.
   1. Per l'imaging del pancreas, iniziare con una lente obiettiva a basso ingrandimento (ad esempio, 4x) per la scansione dell'intera vista del pancreas nella finestra di imaging pancreatico (campo visivo consigliato: 2500 x 2500 μm).
   2. Dopo aver segnato la regione di interesse, passare all'obiettivo con ingrandimento più elevato (20x o 40x) per eseguire l'imaging a livello cellulare (campo visivo consigliato: 500 x 500 μm o 250 x 250 μm). In questo esperimento, la risoluzione laterale e assiale era di circa 0,5 μm e 3 μm, rispettivamente.
   3. Esegui l'imaging z-stack o time-lapse per osservare la struttura 3D o le dinamiche a livello cellulare, come la migrazione cellulare.
      NOTA: per l'imaging delle cellule fluorescenti che esprimono proteine di animali transgenici (MIP-GFP), 30 s di esposizione laser intermittente a 488 nm con potenza fino a 0,43 mW erano tollerabili senza fotosbiancamento evidente o danni ai tessuti. Per l'imaging delle proteine fluorescenti etichettate con Alexa 647, la potenza laser di 640 nm fino a 0,17 mW era tollerabile senza fotosbiancamenti evidenti o danni ai tessuti. L'esposizione laser ad eccitazione prolungata con una potenza superiore a questa impostazione può portare a fotosciviazione o danni ai tessuti per fototossicità. Regola il guadagno e la potenza adeguati per immaginare in modo appropriato la regione di interesse. L'impostazione dettagliata dei parametri nella microscopia intravitale deve essere individualizzata per ogni microscopia intravitale preparata nell'istituto.

Risultati

La microscopia intravitale combinata con la finestra di imaging intravitale pancreatico integrata nella base di supporto consente l'imaging longitudinale a livello cellulare del pancreas in un topo. Questo protocollo con la finestra di imaging intravitale pancreatico fornisce stabilità tissutale a lungo termine che consente l'acquisizione di immagini ad alta risoluzione per tracciare le singole isole per un massimo di 3 settimane. Di conseguenza, è possibile ottenere l'imaging a mosaico per un campo visivo esteso, la r...

Discussione

Il protocollo qui descritto consiste nell'imaging intravitale del pancreas utilizzando una nuova finestra di imaging intravitale pancreatico integrata nella base di supporto modificata da una finestra di imaging addominale. Tra i protocolli sopra descritti, il primo passo critico è l'impianto della finestra di imaging pancreatico intravitale nel topo. Per l'applicazione della colla nella finestra, è importante applicare la colla tra il margine della finestra e il vetro di copertura, ma non sul tessuto pancreatico, in q...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 647 Succinimidyl Esters (NHS esters)	Invitrogen	A20006	Fluorescent probe for conjugate with antibody
BALB/C Nude	OrientBio	BALB/C Nude	BALB/C Nude
BD Intramedic polyethylene tubing	BD Biosciences	427401	PE10 catheter for connection with needle
C57BL/6N	OrientBio	C57BL/6N	C57BL/6N
Cover glasses circular	Marienfeld	0111520	Cover glass for pancreatic imaging window
FITC Dextran 2MDa	Merck (Former Sigma Aldrich)	FD200S	For vessel identification
IMARIS 8.1	Bitplane	IMARIS	Image processing
Intravital Microscopy	IVIM tech	IVM-C	Intravital Microscopy
IRIS Scissor	JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD	S-1107-10	This product can be replaced with the product from other company
Loctite 401	Henkel	401	N-butyl cyanoacrylate glue
Micro Needle holder	JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD	H-1126-10	This product can be replaced with the product from other company
Micro rectractor	JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD	17004-03	This product can be replaced with the product from other company
Microforceps	JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD	F-1034	This product can be replaced with the product from other company
MIP-GFP	The Jackson Laboratory	006864	B6.Cg-Tg(Ins1-EGFP)1Hara/J
Nylon 4-0	AILEE	NB434	Non-Absorbable Suture
Omnican N 100 30G	B BRAUN	FT9172220S	For Vascular Catheter, Use only Needle part
PANC-1 NucLightRed	Custom-made	Custom-made	Made in laboratory
Pancreatic imaging window	Geumto Engineering	Custom order	Pancreatic imaging window - custom order
Physiosuite	Kent Scientific	PS-02	Homeothermic temperature controller
Purified NA/LE Rat Anti-Mouse CD31	BD Biosciences	553708	Antibody for in vivo vessel labeling
Ring Forceps	JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD	F-1090-3	This product can be replaced with the product from other company
Rompun	Bayer	Rompun	Anesthetic agent
TMR Dextran 65-85kDa	Merck (Former Sigma Aldrich)	T1162	For vessel identification
Window holder	Geumto Engineering	Custom order	Window holder - custom order
Zoletil	Virbac	Zoletil 100	Anesthetic agent