单骨骼肌肉纤维解剖，用于全山神经肌肉结的免疫荧光和形态分析

摘要

准确检测神经肌肉结状组件的能力对于评估其结构中的修改至关重要，因为病理学或发育过程。在这里，我们提出了一个简单明了的方法，以获得全安装神经肌肉交汇点的高质量图像，可用于执行定量测量的完整描述。

摘要

神经肌肉结 （NMJ） 是运动神经和骨骼肌之间的一个专门接触点。此外围突触具有高形态和功能可塑性。在许多神经系统疾病中，NMJ是导致神经转移衰竭、虚弱、萎缩，甚至肌肉纤维死亡的早期病理靶点。由于其相关性，对 NMJ 组件之间关系的某些方面进行定量评估的可能性有助于了解与其装配/拆解相关的流程。与肌肉配合时，第一个障碍是获得技术专长，在不损害肌肉纤维的情况下快速识别和解剖肌肉。第二个挑战是利用高质量的检测方法获取可用于进行定量分析的 NMJ 图像。本文提出了一个分步协议，从大鼠中解剖外周数字龙骨和鞋底肌肉。它还解释了使用免疫荧光来可视化全安装NMJ的预和后合成元素。 获得的结果表明，该技术可用于建立突触的微观解剖，并识别其某些成分在生理或病理条件下状态的微妙变化。

引言

哺乳动物神经肌肉结（NMJ）是由运动神经元神经末梢、骨骼肌肉纤维上的后关节膜和末梢施万细胞^1、2、3组成的大型胆碱三方突触。这种突触表现出高形态和功能可塑性4，5，6，7，8，即使在成年时，NMJs可以进行动态结构修改。例如，一些研究人员已经表明，运动神经末梢在^{微米尺度9}时不断改变其形状。另据报道，NMJ的形态响应功能要求，改变使用，老化，锻炼，或变化的运动活动4，10，11，12，13，14，15。因此，训练和缺乏使用是改变NMJ的一些特征的基本刺激，如其大小，长度，突触囊泡和受体的分散，以及神经末梢分支14，16，17，18，19，20。

此外，已经表明，任何结构变化或退化这个重要交汇点可能导致运动神经元细胞死亡和肌肉萎缩^21。人们还认为，神经和肌肉之间交流的改变可能是生理年龄相关NMJ变化的原因，也可能是其在病理状态下的破坏。神经肌肉结拆解在肌萎缩性侧索硬化症（ALS）的发病中起着至关重要的作用，这是一种神经退行性疾病，是肌肉^{神经相互作用}受损的最佳例子之一。尽管对运动神经元功能障碍进行了大量研究，但ALS中观察到的恶化是否由于运动神经元的直接损伤而发生，然后延伸到皮质-脊柱预测22:在ALS中观察到的恶化是否由于运动神经元的直接损伤而发生，以及是否延伸到皮质-脊柱预测^22:是否由于运动神经元的直接损伤而恶化，仍有待讨论。或者，如果它应该被认为是一个离散轴突，其中退化开始在神经末梢和进展到运动神经元 Somas^23，24。鉴于ALS病理学的复杂性，考虑独立过程的混合是合乎逻辑的。由于NMJ是肌肉和神经之间生理病理相互作用的核心作用，其不稳定性是有关疾病起源的关键点，有待分析。

哺乳动物神经肌肉系统在功能上被组织成离散的运动单元，由运动神经元和肌肉纤维组成，这些肌肉纤维完全由神经末梢内侧组成。每个电机单元都有具有相似或相同的结构和功能特性的纤维^25。运动神经元选择性招募允许优化肌肉响应功能需求。现在很明显，哺乳动物的骨骼肌肉由四种不同的纤维类型组成。有些肌肉是根据他们最丰富的纤维类型的特征命名的。例如，鞋底（后肢后肢的后肢肌肉参与身体姿势的维护）具有大多数慢抽搐单位（类型 1），并被识别为慢肌肉。相反，扩展数字长久（EDL）基本上由具有类似快速抽搐特性的单位（2型纤维）组成，被称为用于运动所需的相位运动的快速肌肉。换句话说，虽然成人肌肉是塑料的性质，由于荷尔蒙和神经的影响，其纤维组成决定了执行不同活动的能力，如鞋底经历持续低强度活动和EDL，表现出更快速的单抽搐。不同类型的肌肉纤维中可变的其他特征与它们的结构有关（线粒体含量、肉瘤视网膜的延伸、Z线的厚度）、肌素ATPase含量和肌素重链组成26、27、28、29。

对于啮齿动物NMJ，肌肉之间有显著的差异^28，29。从大鼠对鞋底和EDL进行的形态学分析显示突触区域与纤维直径之间呈正相关关系（即鞋底慢纤维的突触区域大于EDL快速纤维），但NMJ区域与纤维大小的比例在^{肌肉30、31}两个肌肉中相似。此外，在神经末梢方面，1型纤维的端板绝对区域低于2型纤维，而纤维直径的正常化使1型纤维中的神经末梢区域成为最大的^32。

然而，很少有研究侧重于形态学分析，以显示一些NMJ组件^33，34的变化的证据。因此，由于NMJ在生物体功能中的相关性，其形态和生理学在各种病理中都发生了变化，因此，必须优化不同类型肌肉的解剖方案，使其质量足以使整个NMJ结构的可视化。也有必要评估在不同的实验情况或条件，如老化或运动^{35，36，37，38}发生预或后合成变化。此外，它可以帮助证明NMJ成分的更微妙的变化，如改变神经丝磷化在终端神经末梢，如ALS³⁹报道。

研究方案

所有动物程序均按照国家法律 N+ 18611 的准则执行，该法律旨在保护用于实验目的的动物。该议定书已得到机构道德委员会（CEUA IIBCE，第004/09/2015号议定书）的批准。

1. 肌肉解剖（第1天）

注:在开始之前，在杜尔贝科的磷酸盐盐水（DPBS）中制作40 mL的0.5%的副甲醛（PFA），pH 7.4。可选，使 20 mL 的 4% PFA。准备 5 mL 阿利库特，并在 -20 °C 下冻结。 解剖当天，解冻4%的阿利奎特，并添加35mL的DPBS获得40 mL的0.5%PFA。

1. EDL 的隔离（快速抽搐肌肉）
   1. 对老鼠实施安乐死。将动物放在腹部朝上的地方。使用脚趾之间的手术刀片对后肢进行初始切口。
      注:在这种情况下，在腹内注射90:10毫克/千克氯胺酮:西拉津给予安乐死大鼠，但麻醉的其他选择也允许。
   2. 剥去皮肤，向上拉，直到老鼠膝盖暴露。
   3. 要找到 EDL，请跟随脚肌腱到环状韧带。这个韧带绕两个肌腱。用单带剪刀（或类似）切割两个肌腱之间的韧带。通过提升两者来识别 EDL 肌腱，并选择使脚趾向上移动的肌腱。
   4. 用单带剪刀切肌腱。然后，当用精细的生物钳子握住肌腱时，开始慢慢地将EDL肌肉从头骨前部、腹股星和腹股星长子^40（ 见 图1A）中分离出来。
      注意:确保肌肉分离，没有任何损伤。这样做，通过削减其余的横向肌肉，以打开他们之间的路径（EDL没有表面的位置），同时举行和提升EDL肌肉。
   5. 要完全隔离肌肉，用单带剪刀切开附着在老鼠膝盖上的肌腱。
   6. 将解剖的肌肉浸入 0.5% PFA 的 5 mL 中，在 4 °C 下离开 24 小时。 可选，将肌肉钉在一块纸板中，然后用朝下的肌肉转动肌肉。然后将其完全浸入固定解决方案的 8 mL 中。此步骤有助于在固定过程中保持肌肉拉长。
2. 鞋底隔离（慢抽搐肌肉）
   1. 翻转动物（腹部现在朝下）。通过皮肤，使用手术刀片切开钙化肌腱。
   2. 在生物钳子和单带剪刀的帮助下，将胃内膜肌肉与骨骼分离，形成"肌肉盖"。鞋底将在肌肉盖的内侧。它可以识别，因为它是红色的颜色，有一个平面形态。
   3. 用一对生物钳子，伸手和抬起位于胃内皮上方的鞋底肌腱（见图1B）。
   4. 用单带剪刀切肌腱。抬起整个肌肉，同时切割一些薄弱的附件点（即神经血管元素）。最后，为了完全释放鞋底肌肉，用单带剪刀切割形成钙化肌腱的鞋底筋。
   5. 重复步骤 1.1.6 修复解剖的鞋底肌肉。

2. 调戏纤维制备（第2天）

1. 固定24小时后，用6ml的DPBS溶液3倍冲洗肌肉，每次10分钟，然后分离肌肉纤维。
2. 要隔离纤维，将肌肉放在显微镜滑梯上。使用立体显微镜，用一对生物钳轻轻握住一根肌腱。然后，与其他生物钳子，开始慢慢捏肌腱，以分离肌肉纤维。之后慢慢地将捏紧的组织向上拉向相反的肌肉肌腱。有必要重复此操作多次，直到获得多个小型的、孤立的捆绑包。
3. 小心地将它们放在预先处理的幻灯片上（硅化）。有必要保持所有的纤维，以便它们不重叠。此时，将纤维空气干燥 24 小时。

3. 免疫荧光

1. 原发性抗体孵化（第3天）
   注:所有步骤均在室温下执行，除非另有说明。在不将纤维从幻灯片中分离的情况下，去除不同溶液的最有效方法是使用胰岛素注射器。
   1. 要开始免疫染色过程，用 pap 笔包围干燥的孤立肌肉纤维，形成防水屏障。
   2. 要滋润肌肉纤维，加入 200 μL 蒸馏水 5 分钟，然后将水更改为 200 μL 的 DPBS，以便在接下来的 5 分钟孵化中。此时，开始免疫荧光标签。
   3. 在 30 分钟内用含有 50 mM 甘氨酸、1% BSA 和 1% Triton X-100 的阻塞缓冲器 （BB） 孵育纤维。
   4. 以制造商建议的浓度用原抗体替换 BB。使用 BB 稀释抗体。本实验使用 SMI 32 或 SMI 31 的 400 μL 在 1/800 稀释时识别非磷酸化 （Nf） 或磷酸 （Phos-Nf） 神经丝质 H，以检测 NMJ 早产成分。
      注:当决定识别整个先天性元素，而不是评估神经丝磷酸化时，选择抗体对突触，突触物理或SV2a以前成功使用。
   5. 在 4 °C 的夜间用原抗体稀释孵育纤维（可选，孵化可在 37 °C 下进行 1 小时）。在这两种情况下，使用潮湿的腔室进行孵化都很重要。
2. 免疫荧光:二次抗体潜伏（第4天）
   1. 取出原发性抗体，用 500 μL 的 DPBS 和最后一次 BB 将纤维冲洗 3x，每次 10 分钟。
   2. 取出最后一次洗涤，加入在BB中稀释的荧光标记的二级抗体。在这项实验中，使用了500微升的山羊抗鼠亚历克萨氟488，在BB中稀释1/1000。为了查看NMJs的后合成元素，在二次抗体稀释中添加了1:300 α-Bungarotoxin（Btx）生物素-XX结合物。
      注:添加 Btx-biotin XX 可在检测到可放大信号的链球菌素后，获得更好的信号到噪声图像。此外，链球菌素与不同荧光素的结合增加了联合标签测定中的颜色组合。或者，荧光标记的 Btx 允许获得类似质量的图像。
   3. 在室温下将二级抗体和 Btx 孵育为 2 小时，或在 37 °C 下孵育 1 小时，不受光线保护。
   4. 取出二级抗体和 Btx. Wash 3x 10 分钟， 每个 500 μL 的 Dpbs 和最后冲洗与 Bb 。
   5. 在室温下用 500 μL 的斯特雷普塔维丁亚历克萨氟 555 在 1/1000 稀释时用 BB 孵育 1 小时。此时，如果需要，添加一个探头来对抗核，如最终浓度为 1 μg/mL 的二氨基苯酚。
   6. 取出孵化液，用 500 μL 的 DPBS 将纤维清洗 3 倍，每次 10 分钟。然后，安装纤维。
3. 安装
   1. 将 4 点透明指甲油放在显微镜滑动器上，就好像它们是正方形的顶点一样。让他们干1-2分钟。这些将是覆盖唇将休息的点，有助于避免组织粉碎。
   2. 取出最后的DPBS洗涤，并添加足够的安装介质（+200 μL）覆盖纤维;避免干燥。
      注:要准备 10 mL 的安装介质组合，请使用 Tris-HCl 1，5 M pH 8，8:甘油在 4:1 （v:v）。
   3. 使用 200 μL 移液器尖端小心地将安装介质铺在纤维上，以确保所有媒体完全浸入其中。放置盖玻璃之前，请移除气泡。
   4. 将盖片放在样品上，以防止产生气泡。这种运动可以在钳子的帮助下完成。

4. 显微镜和形态分析

1. 使用激光聚焦显微镜成像被取笑的纤维制剂。
2. 使用一微米间隔，在整个突触中拍摄一系列光学部分（30 μm Z 堆栈）。要设置堆栈，请使用 Btx 信号。图像至少 15-20 NMJs 每个肌肉状况与 2048 px x 2048 px 分辨率。选择此方法是为了获得具有足够光学质量和分辨率的图像进行形态分析。
3. 要执行测量，请使用任何分析软件的堆栈投影图像。
   注:虽然解释的形态分析是手动完成的，但有两种最近开发的基于图像J的工具，用于研究NMJ形态^学前和后形态学的许多不同方面。
4. 要获取 NMJ 区域总值，请使用 Photoshop磁套索工具选择端板的外部边框（染色区域的外部轮廓，参见图 2），并确定直方图窗口中选定的像素数。然后，像素区域可以使用共焦软件指定的刻度转换为方形微米。
5. 使用相同的套索工具，选择内部边框（末板内染色区域的轮廓，参见 图 2），并确定上面详细列出的整个结构（或空区）中的未染色区域（步骤 4.4）。在从每个 NMJ 的空区减去总面积后，将获得后合成区域值。
6. 获得青春期前区域，该区域被定义为具有抗神经丝免疫荧光的区域，其方式与总 NMJ 区域类似。
   注:所有这些参数都用于确定突触后密度指数（突触后区域/总面积）和 NMJ 覆盖范围（突触前区域/后合成区域）。较高的后合成密度指数意味着更密集或更紧凑的端板，而较小的 NMJ 覆盖反映了神经末梢和端板之间的更差的相互作用（两者都与衰减过程兼容）。这里所示的情况是，由于在神经终端水平上检测到磷酸化和非磷化形式的神经丝，就计算了磷酸化/非磷酸化前信号比和磷酸化/非磷酸化覆盖率。

结果

此协议提供了一个简单的方法来隔离和免疫污渍肌肉纤维从两种不同类型的肌肉（快速和慢抽搐肌肉，见 图1）。使用正确的标记和 /或探针，可以检测和评估 NMJ 组件，因为从定量角度来评估疾病进展或特定药物治疗可能产生的一些形态变化。在本研究中，NMJ的早熟和后合成成分分别使用抗Nf或抗磷Nf抗体和Btx（图2，上面板）进行荧光标记。免疫染色?...

讨论

在本文中，我们提出了一个详细的协议，用于解剖两个大鼠骨骼肌（一个慢抽搐，另一个快速抽搐），纤维肌肉隔离和免疫荧光检测的预和后合成标记，以定量评估NMJ的变化以及组装/拆解过程。这种协议可用于啮齿动物模型^41，42评估NMJ在生理或病理过程中，如这里例证的运动神经元退化模型，如在ALS hSOD1G93A大鼠发现。

为了获得成...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereomicroscope with cool light illumination	Nikon	SMZ-10A
Rocking platform	Biometra (WT 16)	042-500
Cover glasses (24 x 32 mm)	Deltalab	D102432
Premium (Plus) microscope slides	PORLAB	PC-201-16
Tweezers	F.S.T	11253-20
Uniband LA-4C Scissors 125mm	E.M.S	77910-26
Disponsable surgical blades #10	Sakira Medical	1567
Disponsable sterile syringe (1 ml)	Sakira Medical	1569
Super PAP pen	E.M.S	71310
100 μl or 200 μl pipette	Finnpipette	9400130
Confocal microscope	Zeiss	LSM 800 - AiryScan
NTac:SD-TgN(SOD1G93A)L26H rats	Taconic	2148-M
1X PBS (Dulbecco)	Gibco	21600-010
Paraformaldehyde	Sigma	158127
Triton X-100	Sigma	T8787
Glycine	Amresco	167
BSA	Bio Basic INC.	9048-46-8
Glycerol	Mallinckrodt	5092
Tris	Amresco	497
Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Phosphorylated Antibody	BioLegend	801601	Previously Covance # SMI 31P
Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Nonphosphorylated Antibody	BioLegend	801701	Previously Covance # SMI-32P
Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse IgG (H+L)	Thermo Scientific	A11029
α-Bungarotoxin, biotin-XX conjugate	Invitrogen	B1196
Streptavidin, Alexa Fluor 555 conjugate	Invitrogen	S32355
Diaminophenylindole (DAPI)	Sigma	D8417