Disección De Fibras Musculares Esqueléticas Individuales Para Análisis Inmunofluorescentes Y Morfométricos De Las Uniones Neuromusculares De Montaje Completo

Resumen

La capacidad de detectar con precisión los componentes de la unión neuromuscular es crucial en la evaluación de modificaciones en su arquitectura debido a procesos patológicos o de desarrollo. Aquí presentamos una descripción completa de un método sencillo para obtener imágenes de alta calidad de uniones neuromusculares de montaje completo que se pueden utilizar para realizar mediciones cuantitativas.

Resumen

La unión neuromuscular (NMJ) es un punto de contacto especializado entre el nervio motor y el músculo esquelético. Esta sinapsis periférica exhibe alta plasticidad morfológica y funcional. En desordenes numerosos del sistema nervioso, NMJ es una blanco patológica temprana dando por resultado falta de la neurotransmisión, debilidad, atrofia, e incluso en muerte de la fibra de músculo. Debido a su relevancia, la posibilidad de evaluar cuantitativamente ciertos aspectos de la relación entre los componentes nmj puede ayudar a comprender los procesos asociados con su montaje / desmontaje. El primer obstáculo cuando se trabaja con los músculos es obtener la experiencia técnica para identificar y diseccionar rápidamente sin dañar sus fibras. El segundo desafío es utilizar métodos de detección de alta calidad para obtener imágenes NMJ que se pueden utilizar para realizar análisis cuantitativos. Este artículo presenta un protocolo paso a paso para diseccionar los músculos del longus del digitorum del extensor y del sóseo de ratas. También se explica el uso de la inmunofluorescencia para visualizar elementos pre y postsinápticos de NMJ de montaje completo. Los resultados obtenidos demuestran que esta técnica puede utilizarse para establecer la anatomía microscópica de la sinapsis e identificar cambios sutiles en el estado de algunos de sus componentes en condiciones fisiológicas o patológicas.

Introducción

La unión neuromuscular de mamíferos (NMJ) es una gran sinapsis tripartita colinérgica compuesta por la terminación nerviosa de la neurona motora, la membrana postsináptica en la fibra muscular esquelética y las células terminales de Schwann^1,2,3. Esta sinapsis exhibe una alta plasticidad morfológica y funcional^4,5,6,7,8,incluso durante la edad adulta cuando los NMJ pueden sufrir modificaciones estructurales dinámicas. Por ejemplo, algunos investigadores han demostrado que las terminaciones nerviosas motoras cambian continuamente su forma a la escala micrómetro^9. También se ha divulgado que la morfología del NMJ responde a los requisitos funcionales, al uso alterado, al envejecimiento, al ejercicio, o a las variaciones en actividad locomotriz^{4,10,11,12,13,14,15.} Así, el entrenamiento y la falta de uso representan estímulos esenciales para modificar algunas características del NMJ, como su tamaño, longitud, dispersión de vesículas y receptores sinápticos, así como la ramificación terminal nerviosa^{14,16,17,18,19,20.}

Además, se ha demostrado que cualquier cambio estructural o degeneración de esta unión vital podría resultar en la muerte celular de la neurona motora y la atrofia muscular²¹. También se piensa que la comunicación alterada entre los nervios y los músculos podría ser responsable de los cambios fisiológicos relativos a la edad NMJ y posiblemente de su destrucción en estados patológicos. El desmantelamiento de la unión neuromuscular juega un papel crucial en la aparición de la Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA), una enfermedad neurodegenerativa que constituye uno de los mejores ejemplos de alteración de la interacción músculo-nervio^3. A pesar de los numerosos estudios realizados sobre la disfunción de la neurona motora, todavía se debate si el deterioro observado en la ELA se produce debido al daño directo en la neurona motora y luego se extiende a las proyecciones cortico-espinales²²; o si debe considerarse como una axonopatía distal donde la degeneración comienza en las terminaciones nerviosas y progresa hacia la neurona motora somas^23,24. Dada la complejidad de la patología de la ELA, es lógico considerar que se produce una mezcla de procesos independientes. Como nmj es el jugador central de la interacción fisiopatológica entre el músculo y el nervio, su desestabilización representa un punto crucial en el origen de la enfermedad que es relevante para ser analizado.

El sistema neuromuscular de los mamíferos está organizado funcionalmente en unidades motoras discretas, que consisten en una neurona motora y las fibras musculares que son inervadas exclusivamente por su terminal nervioso. Cada unidad motora tiene fibras con propiedades estructurales y funcionales similares o idénticas²⁵. El reclutamiento selectivo de la neurona motora permite optimizar la respuesta muscular a las demandas funcionales. Ahora está claro que los músculos esqueléticos de los mamíferos se componen de cuatro tipos diferentes de fibras. Algunos músculos son nombrados según las características de su tipo de fibra más abundante. Por ejemplo, el sóleo (un músculo posterior de la extremidad posterior involucrado en el mantenimiento de la postura corporal) lleva una mayoría de unidades de contracción lenta (tipo 1) y se reconoce como un músculo lento. En cambio, el extensor digitorum longus (EDL) se compone esencialmente de unidades con propiedades similares de contracción rápida (fibras tipo 2) y se conoce como un músculo rápido especializado para los movimientos fásicos necesarios para la locomoción. En otras palabras, aunque los músculos adultos son de naturaleza plástica debido a las influencias hormonales y neuronales, su composición de fibras determina la capacidad de realizar diferentes actividades, como se ve en el sóseo que experimenta una actividad continua de baja intensidad y EDL que exhibe una contracción única más rápida. Otras características que son variables entre los diferentes tipos de fibras musculares están relacionadas con su estructura (contenido mitocondrial, extensión del retículo sarcopásmico, grosor de la línea Z), contenido de miosina ATPasa, y composición de la cadena pesada de miosina^26,27,28,29.

Para los NMJ de roedores, hay diferencias significativas entre los músculos^28,29. Los análisis morfométricos realizados en sóleo y EDL de ratas revelaron una correlación positiva entre el área sináptica y el diámetro de la fibra (es decir, el área sináptica en las fibras lentas del sóleo es mayor que en las fibras rápidas de EDL) pero la relación entre el área de NMJ y el tamaño de la fibra es similar en ambos músculos^30,31. Además, en relación a los terminales nerviosos, las áreas absolutas de endplate en las fibras tipo 1 fueron menores que en las fibras tipo 2, mientras que la normalización por diámetro de la fibra hizo que las áreas de los terminales nerviosos en las fibras tipo 1 fueran las más grandes^32.

Sin embargo, muy pocos estudios se centran en el análisis morfométrico para mostrar la evidencia de cambios en algunos de los componentes del NMJ^33,34. Así, debido a la relevancia del NMJ en la función del organismo, cuya morfología y fisiología se ven alteradas en diversas patologías, es importante optimizar los protocolos de disección de diferentes tipos de músculos con la calidad suficiente para permitir la visualización de toda la estructura nmj. También es necesario evaluar la ocurrencia de cambios pre o postsinápticos en diferentes situaciones o condiciones experimentales como el envejecimiento o el ejercicio^35,36,37,38. Además, puede ser útil evidenciar alteraciones más sutiles en los componentes de NMJ, como la fosforilación alterada del neurofilamento en las terminaciones nerviosas terminales, como se informa en la ELA^39.

Protocolo

Todos los procedimientos animales se realizaron de acuerdo con los lineamientos de la Ley Nacional N° 18611 para el Cuidado de animales utilizados con fines experimentales. El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética Institucional (CEUA IIBCE, Protocolo Número 004/09/2015).

1. Disección muscular (Día 1)

NOTA: Antes de comenzar, haga 40 mL de paraformadehído al 0,5% (PFA), pH 7,4 en solución salina de fosfato (DPBS) de Dulbecco. Opcionalmente, haga 20 mL de 4% PFA. Preparar alícuotas de 5 mL y congelar a -20 °C. El día de la disección, descongelar una alícuota al 4% y añadir 35 mL de DPBS para obtener 40 mL de PFA al 0,5%.

1. Aislamiento de EDL (músculo de contracción rápida)
   1. Eutanasiar a una rata. Coloque al animal con el abdomen hacia arriba. Haga una incisión inicial usando una cuchilla quirúrgica entre los dedos de los dedos hacia la extremidad posterior.
      NOTA: En este caso, una inyección intraperitoneal de 90:10 mg/Kg de ketamina: la xilazina fue dada para euthanize la rata, pero otras opciones de la anestesia también se permiten.
   2. Desprenda la piel, tirando de ella hacia arriba hasta que la rodilla de la rata esté expuesta.
   3. Para encontrar el EDL, siga los tendones del pie hasta el ligamento anular. Este ligamento rodea dos tendones. Corte el ligamento entre los dos tendones con tijeras unibandas (o similares). Identifique el tendón EDL levantando ambos y elija el que hace que los dedos de los dedos se muevan hacia arriba.
   4. Cortar el tendón con tijeras unibandas. Luego, mientras sostiene el tendón con pinzas biológicas finas, comience a separar lentamente el músculo EDL del tibial anterior, el peroneus brevis y el peroneus longus⁴⁰ (ver Figura 1A).
      NOTA: Asegúrese de que el músculo esté separado sin ningún daño. Haga esto cortando el resto de los músculos laterales para abrir un camino entre ellos (el EDL no tiene una ubicación superficial) mientras sostiene y levanta el músculo EDL.
   5. Para aislar completamente el músculo, corte el tendón unido a la rodilla de la rata con tijeras unibandas.
   6. Sumergir el músculo diseccionado en 5 mL de PFA al 0,5% y dejar durante 24 h a 4 ºC. Opcionalmente, grapa el músculo en un pedazo de cartón y gire con el músculo hacia abajo. A continuación, sumergirlo completamente en 8 mL de la solución fijadora. Este paso ayuda a mantener el músculo alargado durante el proceso de fijación.
2. Aislamiento del sóleo (músculo de contracción lenta)
   1. Voltee al animal (el abdomen ahora está mirando hacia abajo). A través de la piel, corte el tendón calcáneo usando una cuchilla quirúrgica.
   2. Con la ayuda de las pinzas biológicas y las tijeras unibanda, separe el músculo gastrocnemio de los huesos, creando una "tapa muscular". El sóleo estará en el lado interno de la tapa muscular. Se puede identificar porque es de color rojo y tiene una morfología plana.
   3. Con un par de pinzas biológicas, alcanzar y levantar el tendón del sóleo que se encuentra por encima del gastrocnemio (ver Figura 1B).
   4. Cortar el tendón con tijeras unibandas. Levante todo el músculo mientras corta algunos de los puntos de unión débiles (es decir, elementos neurovasculares). Finalmente, para liberar completamente el músculo sóseo, corte el fascículo del sóseo que forma el tendón calcáneo con tijeras unibanda.
   5. Repetir el paso 1.1.6 para reparar el músculo sóseo diseccionado.

2. Preparación de fibra burlada (Día 2)

1. Después de 24 h de fijación, enjuague los músculos con 6 mL de solución dpbs 3x durante 10 min cada uno antes de aislar las fibras musculares.
2. Para aislar las fibras, coloque un músculo en un portaobjetos al microscopio. Usando un estereomicroscopio, sostenga suavemente uno de los tendones con un par de pinzas biológicas. Luego, con las otras pinzas biológicas, comience a pellizcar el tendón lentamente para separar las fibras musculares. Después de eso, tire lentamente del tejido pellizcado hacia arriba hacia el tendón muscular opuesto. Será necesario repetir esta acción varias veces hasta obtener múltiples haces pequeños y aislados.
3. Colócales cuidadosamente en un portaobjetos pre-tratado (silanizado). Es necesario mantener todas las fibras en orden para que no se superpongan. En este punto, secar al aire las fibras durante 24 h.

3. Inmunofluorescencia

1. Incubación primaria de anticuerpos (Día 3)
   NOTA: Todos los pasos se realizaron a temperatura ambiente, excepto si se indica lo contrario. La forma más eficiente de eliminar las diferentes soluciones sin separar las fibras del portaobjetos es usar una jeringa de insulina.
   1. Para comenzar el proceso de inmunotenstenimiento, rodee las fibras musculares aisladas secas con una pluma de Papanicolaou para crear una barrera impermeable.
   2. Para hidratar las fibras musculares, agregue 200 μL de agua destilada durante 5 min, y luego cambie el agua a 200 μL de DPBS para la siguiente incubación de 5 min. En este punto, inicie el etiquetado de inmunofluorescencia.
   3. Incubar fibras con 300 μL de un tampón de bloqueo (BB) que contenga 50 mM de glicina, 1% de BSA y 1% de Tritón X-100 durante 30 min.
   4. Reemplace BB con el anticuerpo primario a una concentración sugerida por los fabricantes. Utilice el BB para diluir el anticuerpo. Este experimento utilizó 400 μL de SMI 32 o SMI 31 que reconocieron el neurofilamento H no fosforilado (Nf) o fosforilado (Fosfos-Nf) a la dilución de 1/800 para detectar el componente presináptico NMJ.
      NOTA: Al decidir reconocer todo el elemento presináptico en lugar de evaluar la fosforilación del neurofilamento, elija anticuerpos contra la sinapsina, la sinaptofisina o sv2a que se emplearon previamente con éxito.
   5. Incubar las fibras con la dilución primaria de anticuerpos a 4 °C durante la noche (opcionalmente, la incubación se puede realizar a 37 °C durante 1 h). En ambos casos, será importante realizar la incubación utilizando una cámara húmeda.
2. Inmunofluorescencia: Incubación secundaria de anticuerpos (Día 4)
   1. Retire el anticuerpo primario y enjuague las fibras 3x durante 10 min cada una con 500 μL de DPBS y la última vez con BB.
   2. Retiramos este último lavado y añadimos el anticuerpo secundario marcado fluorescentemente diluido en BB. Para este experimento, se utilizaron 500 μL de anti-ratón de cabra Alexa Fluor 488 a 1/1000 de dilución en BB. Para ver el elemento postsináptico de los NMJ, se añadieron 1:300 α-Bungarotoxina (Btx) biotina-XX conjugada a la dilución secundaria de anticuerpos.
      NOTA: La adición de Btx-biotina XX permite mejores imágenes de señal a ruido una vez detectadas con estreptavidina que amplifica la señal. Además, la conjugación de la estreptavidina a diversos fluoróforos aumentó combinaciones del color en análisis del co-etiquetado. Alternativamente, btx marcado fluorescentemente permite obtener imágenes de calidad similar.
   3. Incubar el anticuerpo secundario y el Btx durante 2 h a temperatura ambiente o 1 h a 37 °C protegidos de la luz.
   4. Retire el anticuerpo secundario y el Btx. Lavar 3x durante 10 min cada uno con 500 μL de DPBS y el último enjuague con BB.
   5. Incubar con 500 μL de Streptavidin Alexa Fluor 555 a 1/1000 de dilución con BB durante 1 h a temperatura ambiente. En este punto, si se desea, añadir una sonda para contratener los núcleos, como diaminofenilindol a una concentración final de 1 μg/mL.
   6. Retire la solución de incubación y lave las fibras 3x durante 10 min cada una con 500 μL de DPBS. Luego, monte las fibras.
3. Montura
   1. Coloque 4 puntos de esmalte de uñas transparente en el portaobjetos del microscopio como si fueran los vértices de un cuadrado. Déjalos secar 1-2 min. Estos serán los puntos donde descansarán las cubiertas, ayudando a evitar el aplastamiento de tejidos.
   2. Retire el último lavado DPBS y agregue suficientes medios de montaje (~ 200 μL) para cubrir las fibras; evitar el secado.
      NOTA: Para preparar 10 mL de la mezcla de medios de montaje, utilice Tris-HCl 1,5 M pH 8,8: glicerol en un 4:1 (v:v).
   3. Utilice una punta de pipeta de 200 μL para extender cuidadosamente el medio de montaje sobre las fibras para garantizar una inmersión completa de todas ellas. Antes de colocar el vidrio de la cubierta, retire las burbujas de aire.
   4. Coloque el cubrebocas sobre las muestras tratando de evitar la generación de burbujas de aire. Este movimiento se puede hacer con la ayuda de los pórceps.

4. Microscopía y análisis morfométrico

1. Imagen de las preparaciones de fibra burlada usando microscopía confocal láser.
2. Tome una serie de secciones ópticas (pilas Z de 30 μm) a través de toda la sinapsis utilizando un intervalo de un micrómetro. Para establecer la pila, utilice la señal Btx. Imagen de al menos 15-20 NMJ para cada condición muscular con una resolución de 2048 px x 2048 px. Este método fue elegido para obtener imágenes con suficiente calidad óptica y resolución para el análisis morfométrico.
3. Para realizar las mediciones, utilice las imágenes de proyección de las pilas con cualquier software de análisis.
   NOTA: Aunque el análisis morfométrico explicado se realizó manualmente, existen dos herramientas basadas en Image J desarrolladas recientemente para estudiar muchos aspectos diferentes de la morfología NMJ pre y postsináptica^33,34.
4. Para obtener los valores del área NMJ total, seleccione el borde externo (contorno externo del área teñida, consulte la Figura 2) del módulo con la herramienta lazo magnético de Photoshop y determine el número de píxeles seleccionados en la ventana Histograma. Luego, las áreas de píxeles se pueden convertir en micrómetros cuadrados utilizando la escala especificada por el software confocal.
5. Con la misma herramienta de lazo, seleccione el borde interior (contornos del área teñida dentro del endplate, véase la figura 2)y determine el área no teñida en toda la estructura (o área vacía) como se detalla anteriormente (paso 4.4.). Los valores del Área Postsináptica se obtendrán después de restar el área total del área vacía de cada NMJ.
6. Obtener el Área Presináptica, que se define como el área con inmunofluorescencia anti-neurofilamento, de manera similar a la zona NMJ Total.
   NOTA: Todos estos parámetros fueron utilizados para determinar el índice de densidad post-sináptica (área postsináptica/área total) y la cobertura NMJ (área presináptica/área postsináptica). Un índice de densidad postsináptica más alto implica un endplate más denso -o más compacto-, mientras que una cobertura nmj más pequeña refleja una interacción mucho más pobre entre el terminal nervioso y el endplate (ambos compatibles con un proceso de la denervación). En el caso aquí mostrado, puesto que las formas fosforiladas y no-fosforiladas de neurofilamentos fueron detectadas en el nivel terminal del nervio, el ratio presináptico fosforilado/no-fosforilado de la señal y el ratio fosforilado/no-fosforilado de la cobertura fueron calculados.

Resultados

Este protocolo ofrece un método sencillo para aislar e inmunotener las fibras musculares de dos tipos diferentes de músculos (músculos de contracción rápida y lenta, ver Figura 1). Utilizando los marcadores y/o sondas correctos, los componentes de NMJ pueden ser detectados y evaluados desde un punto de vista cuantitativo para valorar algunos de los cambios morfológicos que pueden ocurrir como consecuencia de la progresión de la enfermedad o de un tratamiento farmacológico específico...

Discusión

En este artículo, presentamos un protocolo detallado para la disección de dos músculos esqueléticos de la rata (uno lento-contracción y el otro rápido-contracción contracción), aislamiento del músculo de la fibra y detección de la inmunofluorescencia de marcadores pre y postsinápticos para evaluar cuantitativo cambios de NMJ así como procesos del montaje/del desmontaje. Este tipo de protocolo puede ser útil en los modelos de roedores^41,42 para evalua...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereomicroscope with cool light illumination	Nikon	SMZ-10A
Rocking platform	Biometra (WT 16)	042-500
Cover glasses (24 x 32 mm)	Deltalab	D102432
Premium (Plus) microscope slides	PORLAB	PC-201-16
Tweezers	F.S.T	11253-20
Uniband LA-4C Scissors 125mm	E.M.S	77910-26
Disponsable surgical blades #10	Sakira Medical	1567
Disponsable sterile syringe (1 ml)	Sakira Medical	1569
Super PAP pen	E.M.S	71310
100 μl or 200 μl pipette	Finnpipette	9400130
Confocal microscope	Zeiss	LSM 800 - AiryScan
NTac:SD-TgN(SOD1G93A)L26H rats	Taconic	2148-M
1X PBS (Dulbecco)	Gibco	21600-010
Paraformaldehyde	Sigma	158127
Triton X-100	Sigma	T8787
Glycine	Amresco	167
BSA	Bio Basic INC.	9048-46-8
Glycerol	Mallinckrodt	5092
Tris	Amresco	497
Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Phosphorylated Antibody	BioLegend	801601	Previously Covance # SMI 31P
Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Nonphosphorylated Antibody	BioLegend	801701	Previously Covance # SMI-32P
Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse IgG (H+L)	Thermo Scientific	A11029
α-Bungarotoxin, biotin-XX conjugate	Invitrogen	B1196
Streptavidin, Alexa Fluor 555 conjugate	Invitrogen	S32355
Diaminophenylindole (DAPI)	Sigma	D8417