면역형광및 전체산 신경근육 접합의 형태 분석에 대한 단일 골격 근육 섬유의 해부

요약

신경 근육 접합 구성 요소를 정확하게 검출하는 능력은 병리학적 또는 발달 과정으로 인해 아키텍처의 수정을 평가하는 데 중요합니다. 여기서 우리는 정량 적 측정을 수행하는 데 사용할 수있는 전산 신경 근육 접합의 고품질 이미지를 얻기 위해 간단한 방법에 대한 완전한 설명을 제시합니다.

초록

신경 근육 접합 (NMJ)은 운동 신경과 골격 근육 사이의 접촉전문 지점입니다. 이 주변 시냅스는 높은 형태학적 및 기능적 가소성을 나타낸다. 수많은 신경계 장애에서, NMJ는 신경 전달 실패의 결과로 초기 병리학 대상, 약점, 위축, 심지어 근육 섬유 죽음. 관련성 때문에 NMJ 구성 요소 간의 관계의 특정 측면을 정량적으로 평가할 수 있어 어셈블리/분해와 관련된 프로세스를 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 근육작업 시 첫 번째 장애물은 섬유질을 손상시키지 않고 신속하게 식별하고 해부할 수 있는 기술적 전문 지식을 확보하는 것입니다. 두 번째 과제는 고품질 검출 방법을 활용하여 정량 분석을 수행하는 데 사용할 수 있는 NMJ 이미지를 얻는 것입니다. 이 문서에서는 쥐에서 근간 이수 및 발바닥 근육을 해부하기위한 단계별 프로토콜을 제공합니다. 또한 전체 마운트 NMJs의 사전 및 포스트냅스 요소를 시각화하기 위해 면역 형광의 사용을 설명합니다.

서문

포유동물 신경근육 접합(NMJ)은 운동 신경 신경 결말, 골격 근 섬유의 포스트냅틱 막, 및 말단 슈완 세포^1,2,3으로구성된 대형 콜린성 삼자시냅스이다. 이 시냅스는 NMJ가 동적 구조 적 변형을 겪을 수있는 성인기 동안에도 높은 형태학적 및 기능성 가소성^4,5,6,7,8을나타낸다. 예를 들어, 몇몇 연구원은 모터 신경 결말이 마이크로미터 규모^9에서지속적으로 그들의 모양을 바꾸는 것을 보여주었습니다. 또한 NMJ의 형태는 기능적 요구 사항, 변경된 사용, 노화, 운동 또는 운동 활동의 변화에 반응하는 것으로 보고되었다^{4,10,11,12, 13,14,15.} 따라서, 훈련 및 사용 부족은 NMJ의 크기, 길이, 시냅스 소포 및 수용체의 분산, 신경 단자 분지^{14,16,17,18,19,20과}같은 NMJ의 일부 특성을 수정하는 필수 자극을 나타낸다.

더욱이, 이 중요한 접합의 구조적 변화 또는 변성은 운동 신경 세포 죽음과 근육 위축^(21)의귀착될 수 있다는 것을 보여주었습니다. 그것은 또한 신경과 근육 사이 변경 된 의사 소통 생리 연령 관련 NMJ 변경 에 대 한 책임 있을 수 있습니다 생각 하 고 아마도 병 적 상태에서 그것의 파괴에 대 한. 신경 근육 접합 해체는 근위축성 측삭 경화증 (ALS)의 발병에 중요한 역할을하며, 이는 손상된 근육 신경 상호 작용^3의가장 좋은 예 중 하나를 구성하는 신경 퇴행성 질환입니다. 운동 신경 기능 장애에 실시 된 수많은 연구에도 불구하고, 그것은 여전히 ALS에서 관찰 된 악화모터 뉴런으로의 직접적인 손상으로 인해 발생하는지 여부를 논쟁하고 다음 코르티코 척추 프로젝션^(22)으로확장; 또는 신경 엔딩에서 변성과 운동 신경^{소마스(23,24)를}향해 진행되는 변성 축삭병증으로 간주되어야 하는 경우. ALS 병리학의 복잡성을 감안할 때 독립적 인 프로세스의 혼합이 발생하는 것을 고려하는 것이 논리적입니다. NMJ는 근육과 신경 사이의 생리적 상호 작용의 중심 플레이어이기 때문에, 그 불안정은 분석될 관련있는 질병의 기원에 있는 중추적인 점을 나타냅니다.

포유류 신경 근육 시스템은 기능적으로 이산 운동 단위로 구성되며, 운동 신경 과 신경 단말만으로 인내되는 근육 섬유로 구성됩니다. 각 모터 유닛에는 유사하거나 동일한 구조 및 기능성^{특성(25)을}가진 섬유가 있습니다. 모터 뉴런 선택적 모집을 통해 기능적 요구에 대한 근육 반응을 최적화할 수 있습니다. 이제 포유류 골격 근육은 네 가지 섬유 유형으로 구성되어 있음이 분명합니다. 일부 근육은 가장 풍부한 섬유 유형의 특성에 따라 명명됩니다. 예를 들어, 솔레우스(체형의 유지에 관여하는 뒷다리의 후방 근육)는 슬로우 트위치 유닛(type 1)의 대부분을 부담하며 느린 근육으로 인식된다. 대신, 엑스텐소 디지오룸 롱투스(EDL)는 본질적으로 유사한 빠른 트위치 특성(유형 2 섬유)을 가진 단위로 구성되며 운동에 필요한 미세한 운동으로 알려져 있습니다. 즉, 호르몬과 신경 영향으로 인해 성인 근육이 자연에 플라스틱이지만, 섬유 조성은 연속저강도 활동과 더 빠른 단일 트위치를 나타내는 EDL에서 볼 수 있듯이 다양한 활동을 수행할 수 있는 능력을 결정합니다. 다른 특징들은 근육섬유의 다양한 유형들 사이에서 가변적인 특징들이 그들의 구조(미토콘드리아 함량, 석관 망상의 확장, Z 선의 두께), 미신 ATPase 함량 및 미신 중형사슬^{조성물(26,27,28,29)과}관련이 있다.

설치류 NMJ의 경우 근육^28,29사이에 상당한 차이가 있습니다. 쥐로부터 발바닥 및 EDL에서 수행된 형태측정 분석은 시냅스 영역과 섬유 직경(즉, 솔레우스 느린 섬유의 시냅스 영역이 EDL 고속 섬유보다 크다) 사이의 긍정적인 상관관계를 보였지만, NMJ 영역과 섬유 크기 사이의 비율은 근육^30,31모두에서 유사하다. 또한, 신경단과 관련하여, 타입-1 섬유의 엔드플레이트 절대 영역은 타입-2 섬유보다 낮았고, 섬유 직경에 의한 정상화는 타입-1 섬유에서 신경 단자 영역을 가장 큰^32로만들었다.

그러나, 몇몇 NMJ 분대의 변경의 증거를 보여주기 위하여 형태 분석에 집중하는 거의 연구 결과는^33,34. 따라서, 다양한 병리학에서 형태와 생리학이 변경되는 유기체의 기능에 있는 NMJ의 관련성 때문에, 전체 NMJ 구조의 시각화를 허용할 만큼 충분히 질로 근육의 다른 모형의 해부 프로토콜을 최적화하는 것이 중요합니다. 또한 노화 나^{운동(35, 36,37,38)과}같은 다양한 실험 상황 또는 조건에서 사전 또는 포스트냅틱 변화의 발생을 평가할 필요가^있다. 또한, ALS^39에보고된 바와 같이 말기 신경 엔딩에서 변경된 신경필라멘트 인산화와 같은 NMJ 성분에서 보다 미묘한 변화를 입증하는 데 도움이 될 수 있다.

프로토콜

모든 동물 절차는 실험 목적으로 사용되는 동물 관리를위한 국가 법 N ° 18611의 지침에 따라 수행되었다. 이 프로토콜은 기관 윤리위원회(CEUA IIBCE, 프로토콜 번호 004/09/2015)에 의해 승인되었습니다.

1. 근육 해부 (1일차)

참고: 시작하기 전에 40mL의 0.5% 파라포름데히드(PFA), pH 7.4를 덜벡코의 인산염 식염수(DPBS)에서 확인합니다. 선택적으로, 4 % PFA의 20 mL을 합니다. 5mL 알리코를 준비하고 -20 °C에서 동결하십시오. 해부 당일, 4% 알리쿼트해질하고 35mL의 DPBS를 추가하여 40mL의 0.5% PFA를 얻습니다.

1. EDL의 격리 (빠른 경련 근육)
   1. 쥐를 안락사시다. 복부가 위쪽으로 향하는 동물을 놓습니다. 발가락 사이의 수술 용 블레이드를 사용하여 뒷사지쪽으로 초기 절개를하십시오.
      참고: 이 경우, 90:10 mg/kg 케타민:자일라진의 관면 주사는 쥐를 안락사시키기 위해 주어졌지만, 마취의 다른 옵션도 허용됩니다.
   2. 쥐 무릎이 노출 될 때까지 위로 당겨, 피부를 벗겨.
   3. EDL을 찾으려면 발 힘줄을 따라 발 성 인대에 따라 가십시오. 이 인대는 두 개의 힘줄을 동그라미. 유니밴드 가위로 두 힘줄 사이의 인대를 잘라냅니다(또는 이와 유사). 둘 다 들어 올려서 EDL 힘줄을 식별하고 발가락이 위쪽으로 이동하게 하는 것을 선택합니다.
   4. 단장 가위로 힘줄을 잘라냅니다. 그런 다음, 미세한 생물학적 핀셋으로 힘줄을 들고 있는 동안, 티비알리스 전방, 페네누스 브레비스 및 peroneus longus^40에서 EDL 근육을 천천히 분리하기 시작합니다(그림 1A참조).
      참고: 근육이 손상 없이 분리되었는지 확인합니다. EDL 근육을 잡고 들어 올리는 동안 그들 사이의 경로를 열기 위해 측면 근육의 나머지 부분을 절단하여이 작업을 수행 (EDL은 피상적 인 위치가 없습니다).
   5. 근육을 완전히 분리하려면 쥐 무릎에 부착 된 힘줄을 유니밴드 가위로 자른다.
   6. 해부된 근육을 0.5% PFA5mL로 담그고 4°C에서 24시간 동안 둡니다. 선택적으로, 골판지 조각에 근육을 스테이플과 아래로 향하고 근육으로 설정합니다. 그런 다음 고정 솔루션의 8 mL에 완전히 침지하십시오. 이 단계는 고정 과정에서 길쭉한 근육을 유지하는 데 도움이됩니다.
2. 솔레우스의 격리 (느린 트위치 근육)
   1. 동물을 뒤집습니다 (복부는 이제 아래쪽으로 향하고 있습니다). 피부를 통해 수술용 블레이드를 사용하여 칼수선 힘줄을 자른다.
   2. 생물학적 핀셋과 단장 가위의 도움으로 위트네미근 근육을 뼈에서 분리하여 "근육 뚜껑"을 만듭니다. 솔레루스는 근육 뚜껑의 내부 측면에있을 것입니다. 그것은 색상에 빨간색과 평면 형태를 가지고 있기 때문에 식별 할 수 있습니다.
   3. 한 쌍의 생물학적 핀셋으로 위장병 위에 있는 솔레우스 힘줄을 도달하고 들어 올립니다(그림 1B참조).
   4. 단장 가위로 힘줄을 잘라냅니다. 약한 부착 점 (즉, 신경 혈관 원소)의 일부를 절단하면서 전체 근육을 들어 올립니다. 마지막으로, 완전히 솔레루스 근육을 해제하기 위해, 단장 가위로 칼칼수선 힘줄을 형성하는 밑창 근막을 잘라.
   5. 해부 된 솔레우스 근육을 고치기 위해 1.1.6 단계를 반복하십시오.

2. 조롱 섬유 준비 (2 일)

1. 고정의 24 시간 후, 근육 섬유를 분리하기 전에 10 분 마다 10 분 동안 DPBS 용액 의 6 mL3x로 근육을 헹구는다.
2. 섬유를 분리하려면 현미경 슬라이드에 근육을 배치하십시오. 스테레오 현미경을 사용하여 한 쌍의 생물학적 핀셋으로 힘줄 중 하나를 부드럽게 잡습니다. 그런 다음, 다른 생물학적 핀셋으로, 근육 섬유를 분리하기 위해 천천히 힘줄을 꼬집어 시작합니다. 그 후 천천히 반대 근육 힘줄을 향해 위쪽으로 꼬집은 조직을 당깁니다. 여러 개의 작고 격리된 번들을 얻을 때까지 이 작업을 여러 번 반복해야 합니다.
3. 미리 처리된 슬라이드(격리)에 신중하게 배치합니다. 겹치지 않도록 모든 섬유를 순서대로 유지해야 합니다. 이 시점에서 24 시간 동안 섬유를 공기 건조시하십시오.

3. 면역형광

1. 1차 항체 배양 (3일차)
   참고: 달리 명시된 경우를 제외하고 모든 단계는 실온에서 수행되었습니다. 슬라이드에서 섬유를 분리하지 않고 다른 솔루션을 제거하는 가장 효율적인 방법은 인슐린 주사기를 사용하는 것입니다.
   1. 면역 염색 과정을 시작하려면 말린 분리된 근육 섬유를 PAP 펜으로 둘러싸서 방수 장벽을 만듭니다.
   2. 근육 섬유에 수분을 공급하려면 증류수 200 μL을 5분 동안 추가한 다음 물을 DPBS 200 μL로 변경하여 다음 5분 배양에 대해 이렇게 합니다. 이 시점에서 면역 형광 라벨링을 시작합니다.
   3. 50mM 글리신을 함유한 블로킹 버퍼(BB)의 300μL, 1% BSA, 30분 동안 트리톤 X-100 1%를 함유한 섬유를 배양한다.
   4. 제조 업체에 의해 제안 된 농도에서 1 차적인 항체로 BB를 대체하십시오. BB를 사용하여 항체를 희석시하십시오. 본 실험은 NMJ 사전합성 성분을 검출하기 위해 1/800 희석에서 비인광(Nf) 또는 인광(Phos-Nf) 신경필라멘트 H를 인식한 SMI 32 또는 SMI 31의 400 μL을 사용했다.
      참고: 신경필라멘트 인산화를 평가하는 대신 전체 사전 시냅스 원소를 인식하기로 결정할 때, 이전에 성공적으로 사용되었던 시냅신, 시냅토피신 또는 SV2a에 대하여 항체를 선택하십시오.
   5. 1차 항체 희석을 한 섬유에 하룻밤 사이에 4°C로 배양한다(선택적으로, 인큐베이션은 1h에 대해 37°C에서 수행될 수 있다). 두 경우 모두 습한 챔버를 사용하여 배양을 수행하는 것이 중요합니다.
2. 면역형광: 이차 항체 배양 (4일차)
   1. 1차 항체를 제거하고 각각 10분 동안 섬유를 3x헹구고 DPBS500 μL과 BB를 마지막으로 헹구는다.
   2. 이 마지막 세척을 제거하고 BB에서 희석 형광 라벨이 부착 된 이차 항체를 추가하십시오. 이 실험을 위해, BB에서 1/1000 희석에서 염소 항 마우스 알렉사 플루어 488의 500 μL이 사용되었다. NMJs의 포스트냅스 원소를 보려면 1:300 α-분가로톡신(Btx) 비오틴-XX 컨쥬게이트가 이차 항체 희석에 첨가되었다.
      참고: Btx-biotin XX를 추가하면 신호를 증폭시키는 스트렙타비딘으로 감지된 더 나은 신호-잡음 이미지를 사용할 수 있습니다. 또한, 다른 형광에 대한 연쇄상 구균은 공동 라벨링 에세이에서 색 조합을 증가시다. 또는 형광으로 레이블이 부착된 Btx를 사용하면 유사한 품질의 이미지를 얻을 수 있습니다.
   3. 이차 항체와 Btx를 실온에서 2시간 또는 빛으로부터 보호하는 37°C에서 1시간 동안 배양한다.
   4. 이차 항체를 제거하고 Btx. DPBS 500 μL과 BB로 마지막 헹구기로 각각 10 분 동안 3배 세척하십시오.
   5. Streptavidin 알렉사 플루어 555의 500 μL을 실온에서 1 시간 동안 BB로 희석하여 배양합니다. 이 시점에서, 원하는 경우, 1 μg/mL의 최종 농도에서 디아미피놀린돌과 같은 핵을 카운터스테인에 프로브를 추가한다.
   6. 인큐베이션 용액을 제거하고 500 μL의 DPBS로 각각 10 분 동안 섬유를 3 배 세척하십시오. 그런 다음 섬유를 장착합니다.
3. 장착
   1. 마치 사각형의 정점인 것처럼 현미경 슬라이드에 투명한 매니큐어 4점을 놓습니다. 1-2분 건조시키세요. 이들은 커버립이 쉬게 될 지점이 될 것입니다, 조직 분쇄를 방지하는 데 도움.
   2. 마지막 DPBS 세척을 제거하고 섬유를 덮을 충분한 장착 용지(~ 200 μL)를 추가합니다. 건조를 피하십시오.
      참고: 마운팅 미디어 믹스의 10mL를 준비하려면 Tris-HCl 1,5 M pH 8,8: 글리세롤을 4:1 (v:v)에 사용하십시오.
   3. 200 μL 파이펫 팁을 사용하여 섬유 위에 장착 미디어를 조심스럽게 분산하여 모든 파이프를 완벽하게 침지합니다. 커버 글래스를 놓기 전에 기포를 제거합니다.
   4. 기포의 생성을 방지하기 위해 샘플에 커버 슬립을 배치합니다. 이 운동은 집게의 도움으로 수행 할 수 있습니다.

4. 현미경 검사 및 형태 분석

1. 레이저 공초점 현미경 을 사용하여 조롱 섬유 준비를 이미지.
2. 1마이크로미터 간격을 사용하여 시냅스 전체에 일련의 광학 섹션(30 μm Z 스택)을 사용하십시오. 스택을 설정하려면 Btx 신호를 사용합니다. 2048 px x 2048 px 해상도를 가진 각 근육 상태에 대해 최소 15-20 개의 NMJ를 이미지합니다. 이 방법은 형태 분석에 대한 충분한 광학 품질 및 해상도를 가진 이미지를 얻기 위해 선택되었다.
3. 측정을 수행하려면 분석 소프트웨어와 함께 스택의 프로젝션 이미지를 사용합니다.
   참고: 설명된 형태 분석이 수동으로 수행되었지만, 최근 개발된 이미지 J 기반 도구는 사전 및 포스트냅스 NMJ^{형태33,34의}다양한 측면을 연구하기 위한 두 가지 상이한 측면이 있다.
4. 총 NMJ 영역 값을 얻으려면 Photoshop 마그네틱 올가미 도구를 사용하여 엔드플레이트의 외부 테두리(스테인드 영역의 외부 윤곽선, 그림 2참조)를 선택하고 히스토그램 창에서 선택한 픽셀 수를 결정합니다. 그런 다음, 픽셀 영역은 공초점 소프트웨어에 의해 지정된 스케일을 사용하여 정사각형 마이크로미터로 변환될 수 있다.
5. 동일한 올가미 도구를 사용하여 내부 테두리(엔드플레이트 내의 스테인드 영역의 윤곽선, 그림 2참조)를 선택하고 위에 자세히 설명된 대로 전체 구조(또는 빈 영역)에서 비염색영역을 결정합니다(단계 4.4.). 포스트냅틱 영역 값은 각 NMJ의 빈 영역에서 총 면적을 빼낸 후 얻을 수 있습니다.
6. 전시냅틱 영역을 획득하여, 이는 전체 NMJ 영역과 유사한 방식으로 항 신경필라멘트 면역 형광을 가진 영역으로 정의된다.
   참고: 이러한 모든 매개 변수는 시냅틱 후 밀도 지수(포스트냅틱 영역/총 면적) 및 NMJ 커버리지(사전 시냅틱 영역/포스트냅스 영역)를 결정하는 데 사용되었습니다. 포스트냅스 밀도 지수가 높을수록 밀도가 높거나 더 컴팩트한 엔드플레이트를 의미하는 반면, 더 작은 NMJ 커버리지는 신경 단자와 엔드플레이트 사이의 훨씬 더 열악한 상호 작용을 반영합니다(모두 기질 검사 과정과 호환). 여기에 나타난 경우, 신경말기 수준에서 인광 및 비인포인이 검출되었기 때문에 인광/비인성 전시화 신호 비율 및 인지질/비인계 커버리지 비율이 계산되었다.

결과

이 프로토콜은 두 가지 유형의 근육 (빠르고 느린 경련 근육, 그림 1참조)에서 면역 스테인 근육 섬유를 분리하고 분리하는 간단한 방법을 제공합니다. 올바른 마커 및/또는 프로브를 사용하여, NMJ 성분은 질병 진행 또는 특정 약물 치료의 결과로 발생할 수 있는 형태학적 변화의 일부를 평가하기 위한 정량적 관점 이후 검출 및 평가될 수 있다. 본 연구에서는, NMJ의 전시냅틱 ...

토론

이 기사에서는 2개의 쥐 골격 근(느린 경련 과 다른 빠른 경련), 섬유 근육 격리 및 면역 불침식 검출을 위한 상세한 프로토콜을 제시하여 NMJ 변경사항뿐만 아니라 조립/분해 공정을 정량적으로 평가합니다. 이러한 종류의 프로토콜은 ALS hSOD1G93A 랫트에서 발견되는 것과 같은 운동 뉴런 변성의 모델에서 본명술된 바와 같이 생리적 또는 병리학적 과정 동안 NMJ를 평가하는 설치류^모델(41...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereomicroscope with cool light illumination	Nikon	SMZ-10A
Rocking platform	Biometra (WT 16)	042-500
Cover glasses (24 x 32 mm)	Deltalab	D102432
Premium (Plus) microscope slides	PORLAB	PC-201-16
Tweezers	F.S.T	11253-20
Uniband LA-4C Scissors 125mm	E.M.S	77910-26
Disponsable surgical blades #10	Sakira Medical	1567
Disponsable sterile syringe (1 ml)	Sakira Medical	1569
Super PAP pen	E.M.S	71310
100 μl or 200 μl pipette	Finnpipette	9400130
Confocal microscope	Zeiss	LSM 800 - AiryScan
NTac:SD-TgN(SOD1G93A)L26H rats	Taconic	2148-M
1X PBS (Dulbecco)	Gibco	21600-010
Paraformaldehyde	Sigma	158127
Triton X-100	Sigma	T8787
Glycine	Amresco	167
BSA	Bio Basic INC.	9048-46-8
Glycerol	Mallinckrodt	5092
Tris	Amresco	497
Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Phosphorylated Antibody	BioLegend	801601	Previously Covance # SMI 31P
Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Nonphosphorylated Antibody	BioLegend	801701	Previously Covance # SMI-32P
Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse IgG (H+L)	Thermo Scientific	A11029
α-Bungarotoxin, biotin-XX conjugate	Invitrogen	B1196
Streptavidin, Alexa Fluor 555 conjugate	Invitrogen	S32355
Diaminophenylindole (DAPI)	Sigma	D8417