Dissecção de fibras musculares esqueléticas únicas para análises imunofluorescentes e morfométricas de junções neuromusculares de monte inteiro

Resumo

A capacidade de detectar com precisão componentes de junção neuromuscular é crucial na avaliação de modificações em sua arquitetura devido a processos patológicos ou de desenvolvimento. Aqui apresentamos uma descrição completa de um método simples para obter imagens de alta qualidade de junções neuromusculares de montagem inteira que podem ser usadas para realizar medições quantitativas.

Resumo

A junção neuromuscular (NMJ) é um ponto de contato especializado entre o nervo motor e o músculo esquelético. Esta sinapse periférica exibe alta plasticidade morfológica e funcional. Em numerosos distúrbios do sistema nervoso, nMJ é um alvo patológico precoce resultando em falha de neurotransmissão, fraqueza, atrofia e até mesmo na morte da fibra muscular. Devido à sua relevância, a possibilidade de avaliar quantitativamente certos aspectos da relação entre os componentes do NMJ pode ajudar a compreender os processos associados à sua montagem/desmontagem. O primeiro obstáculo ao trabalhar com músculos é obter a expertise técnica para identificar e dissecar rapidamente sem danificar suas fibras. O segundo desafio é utilizar métodos de detecção de alta qualidade para obter imagens NMJ que possam ser usadas para realizar análise quantitativa. Este artigo apresenta um protocolo passo-a-passo para dissecar extensor digitorum longus e soleus músculos de ratos. Também explica o uso da imunofluorescência para visualizar elementos pré e postingaptáticos de NMJs de montagem integral. Os resultados obtidos demonstram que essa técnica pode ser usada para estabelecer a anatomia microscópica da sinapse e identificar alterações sutis no status de alguns de seus componentes em condições fisiológicas ou patológicas.

Introdução

A junção neuromuscular do mamífero (NMJ) é uma grande sinapse tripartite colinérgica composta pelo nervo do neurônio motor, a membrana pós-sináptica na fibra muscular esquelética e as células schwann terminais^1,2,3. Esta sinapse apresenta alta plasticidade morfológica e funcional^4,5,6,7,8, mesmo durante a idade adulta, quando os NMJs podem sofrer modificações estruturais dinâmicas. Por exemplo, alguns pesquisadores têm mostrado que terminações nervosas motoras mudam continuamente sua forma na escala de micrômetros⁹. Também foi relatado que a morfologia do NMJ responde aos requisitos funcionais, uso alterado, envelhecimento, exercício ou variações na atividade locomotor^{4,10,11,12,13,14,15}. Assim, o treinamento e a falta de uso representam estímulos essenciais para modificar algumas características do NMJ, como seu tamanho, comprimento, dispersão de vesículas e receptores sinápticos, bem como ramificação terminal nervoso^{14,16,17,18,19,20}.

Além disso, foi demonstrado que qualquer alteração estrutural ou degeneração dessa junção vital poderia resultar em morte celular do neurônio motor e atrofia muscular²¹. Acredita-se também que a comunicação alterada entre nervos e músculos poderia ser responsável pelas alterações fisiológicas relacionadas à idade do NMJ e possivelmente por sua destruição em estados patológicos. O desmantelamento da junção neuromuscular desempenha um papel crucial no surgimento da Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA), doença neurodegenerativa que constitui um dos melhores exemplos de interação músculo-nervo prejudicada³. Apesar dos inúmeros estudos realizados sobre a disfunção do neurônio motor, ainda se debate se a deterioração observada na ELA ocorre devido ao dano direto no neurônio motor e, em seguida, estende-se às projeções cortico-espinhais²²; ou se deve ser considerada como uma axonopatia distal onde a degeneração começa nas terminações nervosas e progride em direção ao neurônio motor somas^23,24. Dada a complexidade da patologia da ELA, é lógico considerar que ocorre uma mistura de processos independentes. Como o NMJ é o ator central da interação fisiopatológica entre músculo e nervo, sua desestabilização representa um ponto crucial na origem da doença que é relevante a ser analisada.

O sistema neuromuscular de mamíferos é funcionalmente organizado em unidades motoras discretas, consistindo de um neurônio motor e as fibras musculares que são exclusivamente inervadas pelo seu terminal nervoso. Cada unidade motora possui fibras com propriedades estruturais e funcionais semelhantes ou idênticas²⁵. O recrutamento seletivo do neurônio motor permite otimizar a resposta muscular às demandas funcionais. Agora está claro que os músculos esqueléticos dos mamíferos são compostos de quatro tipos diferentes de fibras. Alguns músculos são nomeados de acordo com as características de seu tipo de fibra mais abundante. Por exemplo, o soleus (um músculo posterior do membro posterior envolvido na manutenção da postura corporal) possui a maioria das unidades de contração lenta (tipo 1) e é reconhecido como um músculo lento. Em vez disso, o extensor digitorum longus (EDL) é essencialmente composto de unidades com propriedades semelhantes de contração rápida (fibras tipo 2) e é conhecido como um músculo rápido especializado para movimentos filásticos necessários para a locomoção. Em outras palavras, embora os músculos adultos sejam de natureza plástica devido às influências hormonais e neurais, sua composição de fibras determina a capacidade de realizar diferentes atividades, como visto no soleus que experimenta atividade contínua de baixa intensidade e EDL que exibe uma contração única mais rápida. Outras características que são variáveis entre diferentes tipos de fibras musculares estão relacionadas à sua estrutura (conteúdo mitocondrial, extensão do ânticulo sarcoplasmático, espessura da linha Z), teor de myosina ATPase e composição da cadeia pesada de miosina^26,27,28,29.

Para os NMJs roedores, há diferenças significativas entre os músculos^28,29. Análises morfométricas realizadas em soleus e EDL de ratos revelaram uma correlação positiva entre a área sináptica e o diâmetro da fibra (ou seja, a área sináptica em fibras lentas soleus é maior do que nas fibras rápidas EDL), mas a razão entre a área de NMJ e o tamanho da fibra é semelhante em ambos os músculos^30,31. Além disso, em relação aos terminais nervosos, as áreas absolutas da placa endplate nas fibras tipo 1 foram menores do que nas fibras tipo 2, enquanto a normalização por diâmetro de fibras fez áreas de terminais nervosos nas fibras tipo 1 as maiores³².

No entanto, pouquíssimos estudos se concentram na análise morfométrica para mostrar as evidências de mudanças em alguns dos componentes do NMJ^33,34. Assim, devido à relevância do NMJ na função do organismo, cuja morfologia e fisiologia são alteradas em diversas patologias, é importante otimizar protocolos de dissecção de diferentes tipos de músculos com qualidade suficiente para permitir a visualização de toda a estrutura do NMJ. Também é necessário avaliar a ocorrência de alterações pré ou pós-sinápticas em diferentes situações experimentais ou condições como envelhecimento ou exercício^35,36,37,38. Além disso, pode ser útil evidenciar alterações mais sutis em componentes do NMJ, como a fosforilação de neurofilamento alterada nas terminações nervosas terminais terminais, conforme relatado na ALS³⁹.

Protocolo

Todos os procedimentos animais foram realizados de acordo com as diretrizes da Lei Nacional nº 18.611 para cuidados com animais utilizados para fins experimentais. O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética Institucional (CEUA IIBCE, Protocolo nº 004/09/2015).

1. Dissecção muscular (Dia 1)

NOTA: Antes de começar, faça 40 mL de paraformaldeído (PFA), pH 7,4 na solução salina fosfato de Dulbecco (DPBS). Opcionalmente, faça 20 mL de 4% pfa. Prepare 5 mL aliquots e congele a -20 °C. No dia da dissecção, descongele uma alíquota de 4% e adicione 35 mL de DPBS para obter 40 mL de 0,5% de PFA.

1. Isolamento do EDL (músculo de contração rápida)
   1. Eutanize um rato. Coloque o animal com o abdômen voltado para cima. Faça uma incisão inicial usando uma lâmina cirúrgica entre os dedos dos dedos do pé em direção ao membro traseiro.
      NOTA: Neste caso, uma injeção intraperitoneal de 90:10 mg/Kg de cetamina:xilazina foi dada para eutanásia do rato, mas outras opções de anestesia também são permitidas.
   2. Retire a pele, puxando-a para cima até que o joelho do rato seja exposto.
   3. Para encontrar o EDL, siga os tendões do pé até o ligamento anular. Este ligamento circunda dois tendões. Corte o ligamento entre os dois tendões com tesoura uniband (ou similar). Identifique o tendão edl levantando ambos e escolha o que faz os dedos se moverem para cima.
   4. Corte o tendão com uma tesoura uniband. Em seguida, mantendo o tendão com pinças biológicas finas, comece a separar lentamente o músculo EDL da tíbia anterior, do peroneus brevis e peroneus longus⁴⁰ (ver Figura 1A).
      NOTA: Certifique-se de que o músculo está separado sem qualquer dano. Faça isso cortando o resto dos músculos laterais para abrir um caminho entre eles (o EDL não tem uma localização superficial) enquanto segura e levanta o músculo EDL.
   5. Para isolar completamente o músculo, corte o tendão preso ao joelho do rato com uma tesoura uniband.
   6. Mergulhe o músculo dissecado em 5 mL de 0,5% PFA e deixe por 24h a 4 °C. Opcionalmente, grampeie o músculo em um pedaço de papelão e gire-o com o músculo virado para baixo. Em seguida, mergulhe-o completamente em 8 mL da solução fixativa. Esta etapa ajuda na manutenção do músculo alongado durante o processo de fixação.
2. Isolamento do soleus (músculo de contração lenta)
   1. Vire o animal (o abdômen está agora voltado para baixo). Através da pele, corte o tendão calcâneo usando uma lâmina cirúrgica.
   2. Com a ajuda da pinça biológica e da tesoura uniband, separe o músculo gastrocnemius dos ossos, criando uma "tampa muscular". O soleus estará no lado interno da tampa muscular. Pode ser identificado porque é de cor vermelha e tem uma morfologia plana.
   3. Com um par de pinças biológicas, alcance e levante o tendão do soleus que fica acima do gastrocnemius (ver Figura 1B).
   4. Corte o tendão com uma tesoura uniband. Levante todo o músculo enquanto corta alguns dos pontos de apego fracos (ou seja, elementos neurovasculares). Por fim, para libertar completamente o músculo soleus, corte o soleus fascicle que forma o tendão calcâneo com tesoura uniband.
   5. Repita o passo 1.1.6 para fixar o músculo s soleus dissecado.

2. Preparação de fibras provocadas (dia 2)

1. Após 24 horas de fixação, enxágue os músculos com 6 mL de solução DPBS 3x por 10 minutos cada antes de isolar as fibras musculares.
2. Para isolar as fibras, coloque um músculo em um slide de microscópio. Usando um estereótipo, segure suavemente um dos tendões com um par de pinças biológicas. Em seguida, com as outras pinças biológicas, comece a beliscar o tendão lentamente para separar as fibras musculares. Depois disso, puxe lentamente o tecido apertado para cima em direção ao tendão muscular oposto. Será necessário repetir esta ação várias vezes até obter vários pequenos pacotes isolados.
3. Coloque-os cuidadosamente em um slide pré-tratado (silanizado). É necessário manter todas as fibras em ordem para que elas não se sobreponham. Neste ponto, seque as fibras por 24 h.

3. Imunofluorescência

1. Incubação primária de anticorpos (Dia 3)
   NOTA: Todas as etapas foram realizadas em temperatura ambiente, exceto se indicado de outra forma. A maneira mais eficiente de remover as diferentes soluções sem separar fibras do slide é usar uma seringa de insulina.
   1. Para iniciar o processo de imunossuagem, cerque as fibras musculares isoladas secas com uma caneta pap para criar uma barreira impermeável.
   2. Para hidratar as fibras musculares, adicione 200 μL de água destilada por 5 minutos e, em seguida, troque a água para 200 μL de DPBS para a próxima incubação de 5 minutos. Neste ponto, inicie a rotulagem de imunofluorescência.
   3. Incubar fibras com 300 μL de um tampão de bloqueio (BB) contendo 50 mM de glicato, 1% BSA e 1% Triton X-100 por 30 min.
   4. Substitua o BB pelo anticorpo primário em uma concentração sugerida pelos fabricantes. Use o BB para diluir o anticorpo. Este experimento utilizou 400 μL de SMI 32 ou SMI 31 que reconheceram o neurofilamento não fosforilado (NF) ou fosforilado (Phos-Nf) em diluição de 1/800 para detectar o componente pressináptico NMJ.
      NOTA: Ao decidir reconhecer todo o elemento pré-sináptico em vez de avaliar a fosforilação neurofilamental, escolha anticorpos contra sinapsina, sinaptofisina ou SV2a que foram previamente empregados.
   5. Incubar as fibras com a diluição do anticorpo primário a 4 °C durante a noite (opcionalmente, a incubação pode ser realizada a 37 °C por 1 h). Em ambos os casos, será importante realizar a incubação utilizando uma câmara úmida.
2. Imunofluorescência: Incubação de anticorpos secundários (Dia 4)
   1. Remova o anticorpo primário e enxágue as fibras 3x por 10 minutos cada uma com 500 μL de DPBS e a última vez com BB.
   2. Remova esta última lavagem e adicione o anticorpo secundário rotulado fluorescente diluído em BB. Para este experimento, foi utilizado 500 μL de anti-rato de cabra Alexa Fluor 488 a 1/1000 diluição em BB. Para ver o elemento postsinápico dos NMJs, 1:300 α-Bungarotoxina (Btx) conjugado biotin-XX foi adicionado à diluição de anticorpos secundários.
      NOTA: A adição de Btx-biotin XX permite melhores imagens de sinal a ruído uma vez detectadas com streptavidin que amplifica o sinal. Além disso, a conjugação de streptavidin a diferentes fluoroforos aumentou as combinações de cores em ensaios de co-rotulagem. Alternativamente, o Btx fluorescentemente rotulado permite obter imagens de qualidade semelhante.
   3. Incubar o anticorpo secundário e o Btx por 2h em temperatura ambiente ou 1h a 37 °C protegido da luz.
   4. Remova o anticorpo secundário e o Btx. Wash 3x por 10 min cada com 500 μL de DPBS e o último enxágue com BB.
   5. Incubar com 500 μL de Streptavidin Alexa Fluor 555 a 1/1000 diluição com BB por 1h em temperatura ambiente. Neste ponto, se desejar, adicione uma sonda para contra-conter os núcleos, como diaminofenilimale em uma concentração final de 1 μg/mL.
   6. Remova a solução de incubação e lave fibras 3x por 10 minutos cada com 500 μL de DPBS. Então, monte as fibras.
3. Montagem
   1. Coloque 4 pontos de esmalte transparente no slide do microscópio como se fossem os vértices de um quadrado. Deixe-os secar 1-2 min. Estes serão os pontos onde as tampas descansarão, ajudando a evitar o esmagamento de tecidos.
   2. Remova a última lavagem DPBS e adicione mídia de montagem suficiente (~ 200 μL) para cobrir as fibras; evite a secagem.
      NOTA: Para preparar 10 mL da mistura de mídia de montagem, use Tris-HCl 1,5 M pH 8,8: glicerol em um 4:1 (v:v).
   3. Use uma ponta de pipeta de 200 μL para espalhar cuidadosamente a mídia de montagem sobre as fibras para garantir uma imersão completa de todas elas. Antes de colocar o vidro de cobertura, remova as bolhas de ar.
   4. Coloque a mancha nas amostras tentando evitar a geração de bolhas de ar. Esse movimento pode ser feito com a ajuda de fórceps.

4. Microscopia e análise morfométrica

1. Imagem os preparos de fibra provocado usando microscopia confocal a laser.
2. Pegue uma série de seções ópticas (pilhas Z de 30 μm) em toda a sinapse usando um intervalo de um micrômetro. Para definir a pilha, use o sinal Btx. Imagem mínima de 15-20 NMJs para cada condição muscular com uma resolução 2048 px x 2048 px. Este método foi escolhido para obter imagens com qualidade óptica e resolução suficientes para a análise morfométrica.
3. Para realizar as medições, use as imagens de projeção de pilhas com qualquer software de análise.
   NOTA: Embora a análise morfométrica explicada tenha sido feita manualmente, existem duas ferramentas recém-desenvolvidas baseadas em Imagem J para estudar muitos aspectos diferentes da morfologia NMJ pré e postinástica^33,34.
4. Para obter os valores totais da área do NMJ, selecione a borda externa (contorno externo da área manchada, consulte a Figura 2) da placa final usando a ferramenta de laço Magnético Photoshop e determine o número de pixels selecionados na janela Histograma. Em seguida, as áreas de pixel podem ser convertidas em micrômetros quadrados usando a escala especificada pelo software confocal.
5. Com a mesma ferramenta de laço, selecione a borda interna (contornos da área manchada dentro da placa final, consulte a Figura 2) e determine a área não manchada em toda a estrutura (ou área vazia) conforme detalhado acima (passo 4.4.). Os valores da Área Pós-Sináptica serão obtidos após subtrair a área total da área vazia de cada NMJ.
6. Obtenha a Área Pré-Sináptica, que é definida como a área com imunofluorescência anti-neurofilamento, de forma semelhante à área total do NMJ.
   NOTA: Todos esses parâmetros foram utilizados para determinar o índice de densidade pós-sináptica (Área Pós-Sináptica/Área Total) e a Cobertura NMJ (Área Pré-Sináptica/Área Pós-Sináptica). Um índice de densidade pós-sináptica mais alto implica uma placa final mais densa ou mais compacta, enquanto uma cobertura NMJ menor reflete uma interação muito pior entre terminal nervoso e placa final (ambas compatíveis com um processo de denervação). No caso aqui mostrado, uma vez que foram detectadas formas fosfoiladas e não fosfoiladas de neurofilamentos no nível terminal nervoso, calculou-se a razão de sinal presintolético fosfoilado/não fosfoilado e a razão de cobertura fosfoilada/não fosfoilada.

Resultados

Este protocolo oferece um método simples para isolar e imunostain fibras musculares de dois tipos diferentes de músculos (músculos de contração rápida e lenta, ver Figura 1). Utilizando os marcadores e/ou sondas corretos, os componentes do NMJ podem ser detectados e avaliados, uma vez que um ponto de vista quantitativo para avaliar algumas das alterações morfológicas que podem ocorrer como consequência da progressão da doença ou de um tratamento medicamentoso específico. No pres...

Discussão

Neste artigo, apresentamos um protocolo detalhado para a dissecção de dois músculos esqueléticos de ratos (um contração lenta e outro de contração rápida), isolamento muscular de fibras e detecção de imunofluorescência de marcadores pré e pós-sinápticos para avaliar quantitativamente as alterações do NMJ, bem como processos de montagem/desmontagem. Esse tipo de protocolo pode ser útil nos modelos de roedores^41,42 para avaliar nmj durante process...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereomicroscope with cool light illumination	Nikon	SMZ-10A
Rocking platform	Biometra (WT 16)	042-500
Cover glasses (24 x 32 mm)	Deltalab	D102432
Premium (Plus) microscope slides	PORLAB	PC-201-16
Tweezers	F.S.T	11253-20
Uniband LA-4C Scissors 125mm	E.M.S	77910-26
Disponsable surgical blades #10	Sakira Medical	1567
Disponsable sterile syringe (1 ml)	Sakira Medical	1569
Super PAP pen	E.M.S	71310
100 μl or 200 μl pipette	Finnpipette	9400130
Confocal microscope	Zeiss	LSM 800 - AiryScan
NTac:SD-TgN(SOD1G93A)L26H rats	Taconic	2148-M
1X PBS (Dulbecco)	Gibco	21600-010
Paraformaldehyde	Sigma	158127
Triton X-100	Sigma	T8787
Glycine	Amresco	167
BSA	Bio Basic INC.	9048-46-8
Glycerol	Mallinckrodt	5092
Tris	Amresco	497
Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Phosphorylated Antibody	BioLegend	801601	Previously Covance # SMI 31P
Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Nonphosphorylated Antibody	BioLegend	801701	Previously Covance # SMI-32P
Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse IgG (H+L)	Thermo Scientific	A11029
α-Bungarotoxin, biotin-XX conjugate	Invitrogen	B1196
Streptavidin, Alexa Fluor 555 conjugate	Invitrogen	S32355
Diaminophenylindole (DAPI)	Sigma	D8417