树脂辅助捕获与同量异位串联质量标签标记相结合，用于蛋白质硫醇氧化的多重定量

摘要

蛋白硫醇氧化在正常的生理和病理生理条件下具有显著意义。我们描述了定量氧化还原蛋白质组学方法的细节，该方法利用树脂辅助捕获，同量异位标记和质谱，能够对蛋白质的可逆氧化半胱氨酸残基进行位点特异性鉴定和定量。

摘要

蛋白质硫醇的可逆氧化修饰最近已成为细胞功能的重要介质。本文描述了定量氧化还原蛋白质组学方法的详细程序，该方法利用树脂辅助捕获（RAC）与串联质量标签（TMT）同量异位标记和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）相结合，允许在蛋白质组水平上对氧化蛋白硫醇进行多重随机定量。关于氧化半胱氨酸残基的位点特异性定量信息为这种修饰的功能影响提供了额外的见解。

该工作流程适用于多种样品类型，包括培养细胞（例如，哺乳动物，原核生物）和整个组织（例如，心脏，肺，肌肉），它们最初被裂解/匀浆化，游离硫醇被烷基化以防止人工氧化。然后，氧化的蛋白质硫醇被硫醇亲和树脂还原和捕获，通过允许在不额外转移蛋白质/肽的情况下执行正在进行的消化、标记和洗涤程序，从而简化和简化工作流程步骤。最后，通过LC-MS/MS洗脱和分析标记的肽，以揭示整个蛋白质组中与硫醇氧化相关的全面化学计量变化。该方法大大提高了对氧化还原依赖性调节在与蛋白硫醇氧化相关的生理和病理生理状态下的作用的理解。

引言

在稳态条件下，细胞产生活性氧、氮或硫物质，有助于促进代谢和信号^传导等过程1，²，3^，延伸到原核生物和真核生物。这些反应性物质的生理水平是正常细胞功能所必需的，也称为"良性应激"^1，4。相反，氧化剂的增加导致氧化剂和抗氧化剂之间的不平衡会导致氧化应激或"痛苦"¹，从而导致细胞损伤。氧化剂通过修饰不同的生物分子（包括蛋白质、DNA、RNA 和脂质）将信号转导到生物途径。特别是，蛋白质的半胱氨酸残基是高反应性位点，由于半胱氨酸上的硫醇基团而容易氧化，其对不同类型的氧化剂具有反应^性5。这产生了多种基于半胱氨酸的可逆氧化还原翻译后修饰（PTM），包括亚硝基化（SNO），谷硫酰化（SSG），亚磺酰化（SOH），过硫化（SSH），多硫化（SSN_H），酰化和二硫化物。半胱氨酸氧化的不可逆形式包括亚磺酰化（SO₂H）和磺酰化（SO₃H）。

半胱氨酸残基的可逆氧化修饰可以起到保护作用，防止进一步不可逆氧化，或作为下游细胞途径的信号分子^6，7。一些硫醇氧化还原PTM的可逆性允许半胱氨酸位点作为"氧化还原^开关"8，9^，其中这些位点的氧化还原状态的变化会改变蛋白质功能以调节它们在瞬时过程中的作用。氧化还原^{PTMs 10}的调节作用已在蛋白质功能11的许多方面观察到，包括催化12，蛋白质 - 蛋白质相互作用¹³，构象变化14，金属离子配位¹⁵或药理抑制剂结合¹⁶。此外，氧化还原PTM参与调节转录17、翻译¹⁸或代谢¹⁹等途径的蛋白质的半胱氨酸位点。鉴于氧化还原PTM对蛋白质功能和生物过程的影响，量化半胱氨酸位点响应氧化还原状态扰动而经历的氧化程度非常重要。

具有氧化还原状态改变的半胱氨酸位点的鉴定侧重于正常和扰动条件之间位点特异性水平的氧化态比较。倍数变化测量通常用于确定哪些位点发生显着改变，因为这有助于用户解释哪些半胱氨酸位点可能对研究具有生理意义。或者，对特定样品类型的可逆硫醇氧化进行化学计量测量，可以大致了解细胞氧化的生理状态，这是一项经常被忽视和未充分利用的重要测量。修饰化学计量法基于量化修饰硫醇的百分比与总蛋白硫醇（修饰和未修饰）的比率^20，21。因此，化学计量测量提供了比倍数变化更精确的测量，尤其是在使用质谱时。通过使用化学计量法来确定特定半胱氨酸位点的PTM占用率，可以更容易地确定氧化增加的意义。例如，硫醇氧化增加3倍可能是由于低至1%至3%或大至30%至90%的转变所致。对于仅占1%的位点，氧化增加3倍可能对蛋白质的功能几乎没有影响;然而，对于处于休息状态的占用率为 30% 的站点，增加 3 倍可能会受到更大的影响。在总氧化硫醇和特定氧化修饰（包括蛋白质谷硫酰化 （SSG） 和亚硝基化 （SNO））之间进行化学计量测量时，可以揭示有关特定修饰类型的比率和定量信息。

由于可逆硫醇氧化通常是一种低丰度的翻译后修饰，因此已经开发了多种方法来富集生物样品中含有这些修饰的蛋白质。Jaffrey和其他人设计的一种早期方法，称为生物素转换技术（BST）²²，涉及多个步骤，其中未修饰的硫醇通过烷基化被阻断，可逆修饰的硫醇被还原为新生的游离硫醇，新生的游离硫醇被生物素标记，标记的蛋白质通过链霉亲和素亲和力下拉富集。该技术已在许多研究中用于分析SNO和SSG，并且可以适应于探测其他形式的可逆硫醇氧化^23，24。虽然BST已被用于探测不同形式的可逆硫醇氧化，但这种方法的一个问题是富集受到未生物素化蛋白质与链霉亲和素的非特异性结合的影响。我们实验室开发的另一种方法称为树脂辅助捕获（RAC）^25，26 （图1），它避免了通过生物素 - 链霉亲和素系统富集硫醇基团的问题。

在可逆氧化的硫醇还原后，具有新生游离硫醇的蛋白质被硫醇亲和树脂富集，该树脂共价捕获游离硫醇基团，允许比BST更特异性地富集含半胱氨酸的蛋白质。将RAC与同量异位标记和质谱分析的最新进展的多重功能相结合，为蛋白质组范围内可逆氧化的半胱氨酸残基的富集、鉴定和定量创造了一个强大而灵敏的工作流程。质谱技术的最新进展使得能够对硫醇氧化还原蛋白质组进行更深入的分析，从而增加了对蛋白质硫醇氧化的原因和影响的理解²⁷。从特定地点的定量数据中获得的信息可以进一步研究可逆氧化修饰的机理影响和下游影响²⁸.利用该工作流程可以深入了解可逆半胱氨酸氧化对正常生理事件（如衰老）的生理影响，其中SSG水平随年龄而不同。使用SS-31（elamipretide）部分逆转了对SSG的衰老影响，SS-31是一种新型肽，可增强老年小鼠的线粒体功能并降低SSG水平，使它们具有与年轻小鼠更相似的SSG谱²⁹。

归因于纳米颗粒暴露的病理生理条件已被证明涉及小鼠巨噬细胞模型中的SSG。使用RAC与质谱联用，作者表明SSG水平与氧化应激程度和巨噬细胞吞噬功能受损直接相关。数据还揭示了对诱导不同程度氧化应激的不同工程纳米材料响应的途径特异性差异³⁰。该方法还证明了其在原核物种中的实用性，用于研究光合蓝藻中昼夜循环对硫醇氧化的影响。观察到硫醇氧化在几个关键生物过程中的广泛变化，包括电子传递、碳固定和糖酵解。此外，通过正交验证，确认了几个关键功能位点被修饰，表明这些氧化修饰的调节作用⁶。

在本文中，我们描述了标准化工作流程（图1）的细节，展示了RAC方法富集蛋白质总氧化半胱氨酸硫醇及其随后标记和化学计量定量的实用性。该工作流程已在不同样品类型的氧化还原状态研究中实施，包括细胞培养^物27，³⁰和整个组织（例如骨骼肌，心脏，肺）²⁹，31，^32，33。虽然此处未包括，但RAC方案也很容易适用于研究特定形式的可逆氧化还原修饰，包括SSG，SNO和S-酰化，如前所述²⁵，^29，34。

研究方案

协议中描述的与动物或人类样本/组织有关的所有程序均由人类和动物研究伦理委员会的批准并遵循其机构指南。

1. 样品均质/裂解

1. 冷冻组织样本
   1. 使用预冷的剃须刀片和镊子在干冰上的玻璃显微镜载玻片上切碎冷冻组织（~30毫克）。将切碎的组织转移到含有 700 μL 缓冲液 A 的预冷 5 mL 圆底聚苯乙烯管中（参见 表 1），并在冰上孵育 30 分钟，避光。
   2. 破碎组织30秒或直到用手持式组织均质器完全匀浆。将样品放在冰上，让泡沫再消退10分钟。
      注意:放置在干冰上的铝烤盘为纸巾的初始加工/切碎提供了稳定的工作表面和平台。
2. 或者，使用100 mm培养皿中的贴壁细胞培养物作为起始材料。
   1. 将细胞保持在冰上，并使用血清移液管用含有100 mM NEM的10 mL冰冷PBS冲洗细胞两次。
   2. 通过加入 1 mL 冷匀浆/裂解缓冲液并用刚性细胞刮刀剧烈刮擦来裂解细胞。使用微量移液器将裂解物转移到 2 mL 离心管中。
      注意:冲洗缓冲液和裂解缓冲液可以根据不同尺寸的培养容器进行相应缩放。通常，需要2-5百万个细胞;然而，这取决于特定细胞类型的裂解效率和蛋白质产量。可以在没有NEM的情况下制备均质缓冲液，用于分析总硫醇的样品。
3. 使用微量移液器将所得匀浆（步骤1.1.2或1.2.2）转移到2mL离心管中，并在4°C下全速（≥16，000× g）离心10分钟。
4. 使用微量移液器将上清液（~700μL或~1mL用于细胞培养）转移到5mL锥形微量离心管中，并在55°C下在黑暗中以850rpm振荡孵育30分钟。
5. 使用玻璃血清移液管，向样品中加入4mL冰冷的丙酮，并在-20°C下孵育过夜以沉淀蛋白质并去除过量的 N-乙基马来酰亚胺。

2. 树脂辅助捕获

1. 用丙酮洗涤沉淀的蛋白质沉淀两次，方法是在4°C下以20，500× g 离心10分钟，倾析丙酮，使用微量移液管除去任何剩余的丙酮，并使用玻璃血清移液管加入3mL新鲜冰冷的丙酮。倒置几次混合。第二次洗涤后，让颗粒风干1-2分钟，注意不要过度干燥，因为重悬可能会变得困难。
2. 使用微量移液器，加入 1 mL 缓冲液 B（参见 表 1），并使用输出为 250 W 和短暂涡旋的浴超声仪一次重复超声处理 15-30 秒溶解蛋白质。根据制造商的方案使用二辛可宁酸（BCA）测定法测量蛋白质浓度。
3. 为了标准化样品中的蛋白质浓度以进行进一步处理并确保完全去除NEM，请使用微量移液器将500 μg蛋白质转移到0.5 mL 10 kDa离心过滤器中，并使用重悬缓冲液调整至500 μL的最终体积。
4. 在室温下以 14，000 × g 离心，直到离心过滤器中的体积小于 100 μL。 通过在收集管中倒置过滤器来收集样品。以 1，000 × g 离心 2 分钟，并使用缓冲液 C 调节至 500 μL 的最终体积（参见 表 1）。
5. 通过使用微量移液管加入20μL的500mM二硫苏糖醇（DTT）至终浓度为20mM，并将样品在37°C下孵育30分钟，同时以850rpm振荡，从而减少蛋白质硫醇。
6. 还原后，使用微量移液器将样品转移到0.5 mL 10 kDa离心过滤器中，并在室温下以14，000 × g 离心15分钟，或直到离心过滤器中的体积小于100μL。 加入缓冲液D（见 表1）以将离心过滤器中的体积补足至500μL。
   1. 重复离心并在步骤2.6中加入500μL三次，第四次离心后，通过将过滤器倒置在收集管中并以1，000× g 离心2分钟来收集样品。
7. 根据制造商的方案使用BCA测定法测量蛋白质浓度。
8. 在缓冲液更换期间，使用微量天平称量适量的树脂（30 mg/样品）并将其转移到50 mL离心管中，以制备硫醇亲和树脂。然后，使用血清移液管，加水至终浓度为30mg / mL树脂，并在室温下搅拌孵育1小时以使树脂适当水合。
   注意:制造商已停产上述硫醇亲和树脂。这种硫醇亲和树脂的可能替代品是市售的。然而，这种替代物的结合能力降低了近5倍（见 补充信息）。或者，可以使用2-（吡啶基二硫基）乙胺盐酸盐和 N-羟基琥珀酰亚胺活化树脂合成硫醇亲和树脂（见 补充信息）。
   1. 树脂水化后，将离心柱放在真空歧管上，并使用微量移液管将 500 μL 树脂浆液转移到每根色谱柱上。应用真空去除水分;重复此步骤一次，每根色谱柱总共获得30mg树脂。或者，以 1，000 × g 离心 2 分钟，而不是使用真空歧管进行此操作以及所有树脂洗涤和洗脱步骤。
      注意:切割 1000 μL 移液器吸头的末端以增加孔径有助于树脂的转移。重要的是在移液之间研磨，以确保树脂保持悬浮状态，并将均匀且等量的树脂转移到每根色谱柱上。
   2. 用微量移液管加入 500 μL 超纯水并施加真空以去除水分来洗涤树脂;重复此操作 5 次。然后，用 500 μL 缓冲液 E 洗涤树脂 5 次（见 表 1）。
      注意:或者，在所有后续洗涤步骤中，可以使用 1，000 x g 离心 2 分钟代替真空歧管。所有后续洗涤步骤均以 500 μL 的体积执行。向色谱柱中添加洗涤缓冲液时，小心地添加足够的力以使树脂完全重悬，同时避免飞溅和树脂损失;这样可以完全有效地清洗树脂。
9. 使用微量移液器将每个还原样品中的150 μg蛋白质转移到新管中，并调整至最终体积为120 μL缓冲液C（见 表1）。使用微量移液管将蛋白质溶液转移到含有树脂的堵塞离心柱中，将盖子放在色谱柱上，并在室温下以850rpm振荡孵育2小时。
10. 用25mM HEPES，pH 7.0洗涤树脂五次;8 M 尿素;随后用2 M NaCl进行5次;其次是用80%乙腈（ACN）和0.1%三氟乙酸（TFA）进行五次;最后用25 mM HEPES，pH 7.7，如步骤2.8.2中所述，五次并更换插头。
    注意:样品可以在这里洗脱，以便在蛋白质水平（例如，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），蛋白质印迹）进行分析，如步骤4.1中所述。

3. 树脂上胰蛋白酶消化和TMT标记

1. 通过在缓冲液C中以0.5μg/μL的浓度溶解，制备足够的测序级修饰胰蛋白酶溶液，每个样品6-8 μg（见 表1），以使最终体积允许每个样品至少120 μL。使用微量移液器，向样品中加入120μL该胰蛋白酶溶液，并在37°C下以850rpm振荡孵育过夜。
   注意:为了提高消化效率，第二天可以通过去除胰蛋白酶溶液并用新鲜溶液代替来包括额外的消化步骤，并继续消化2小时。
2. 用25mM HEPES，pH 7.0洗涤树脂五次;其次是五乘以2M NaCl;其次是五次，乙腈含量为80%，TFA含量为0.1%;然后用25 mM HEPES进行三次，pH 7.7。最后，用50mM三乙基碳酸氢铵缓冲液（TEAB）洗涤树脂两次并更换塞子。
3. 制备TMT标记试剂，首先让它们升温至室温，然后使用16，000 × g的离心机短暂旋转。使用微量移液器向每瓶TMT标记试剂中加入150 μL无水乙腈。将小瓶在室温下在设置为850rpm的热混合器上孵育5分钟以完全溶解试剂。短暂涡旋并以 16，000 × g 旋转以收集试剂。
4. 使用微量移液器，向洗涤的树脂中加入 40 μL 100 mM TEAB，然后加入 70 μL 溶解的 TMT 试剂，并在室温下以 850 rpm 振荡孵育 1 小时。将任何剩余的TMT试剂储存在-80°C。
   注意:记下分配给每个生物样品的单个TMT标签（图1）。
5. 如前所述，用 80% 乙腈和 0.1% TFA 洗涤树脂 5 次，用 100 mM 碳酸氢铵缓冲液 （ABC）、pH 8.0 洗涤树脂 3 次，用水洗涤树脂两次，然后更换插头。

4. 肽洗脱

1. 使用微量移液管向每根色谱柱中加入 100 μL 20 mM DTT 中的 100 mM ABC（pH 8.0），洗脱标记的肽，并在室温下在设置为 850 rpm 的热混合器上孵育 30 分钟。
   注意:添加DTT后，树脂会结块。树脂可以用移液器吸头破碎，以分解团块并确保肽的完全洗脱。
2. 孵育后，将色谱柱置于用于固相萃取（SPE）的真空歧管上，施加真空，并将样品洗脱到5 mL微量离心管中。重复此步骤一次。
3. 最后，加入 100 μL 80% 乙腈和 0.1% TFA，在室温下孵育 10 分钟，然后洗脱到相同的 5 mL 离心管中。将所有馏分收集在同一个 5 mL 微量离心管中。
   注意:为防止样品损失，必须使用低结合管进行洗脱，并且单个5 mL管的体积必须保持在4.0 mL或以下。
4. 将洗脱的样品放入真空浓缩器中直至干燥。将干肽储存在-80°C，稍后重悬。
   注意:样品也可以单独洗脱，在合并样品之前，可以通过SDS-PAGE取出等分试样进行分析，以便在肽水平进行分析。

5. 肽烷基化和脱盐/净化

1. 使用微量移液器加入少量100mM ABC缓冲液，pH 8.0（不大于500μL）重悬干燥的肽。使用输出为 250 W 的浴超声仪一次重复超声处理 15-30 秒，并涡旋溶解并转移到 2 mL 管中。
   注意:要添加的 100 mM ABC、pH 8.0 的体积基于以 150 mM 摩尔浓度重悬 DTT 所需的体积。用户需要根据最初在步骤 4.1 中添加的内容确定样品中存在的 DTT 量。
2. 使用微量移液管加入足够浓缩的碘乙酰胺（IAA）储备溶液（600mM），以达到DTT:IAA的1:4摩尔比，并将样品在室温下以850rpm振荡孵育1小时。
3. 使用微量移液管添加浓TFA（10%）将样品酸化至pH < 3，并根据制造商的说明使用反相净化进行样品脱盐。
4. 将干净的肽放入真空浓缩器中直至干燥。将干肽储存在-80°C直至进一步分析。

6. 液相色谱-串联质谱

1. 使用输出为 250 W 的浴超声仪一次重复超声处理 15-30 秒，并在含有 3% 乙腈的 20-40 μL 水中涡旋，重悬干燥的肽。根据制造商的方案通过进行BCA测定来确定肽浓度。
2. 如^前所述，通过反相LC和MS / MS分离样品6，并记录400-2000m/z范围内的MS1光谱。确保利用高能碰撞解离（HCD）来获取报告离子强度信息，以分析同量异位标记的肽。有关仪器运行条件²⁷，³⁰ 和 MS 数据分析^27，31 的更多详细信息^，请参阅之前报告的方法部分。
   注意:可以使用不同的LC-MS/MS系统或设置来分析肽样品。肽鉴定的覆盖范围和灵敏度将取决于所使用的特定系统和设置。

结果

该方案的完成将导致以前氧化的含半胱氨酸肽的高度特异性富集，通常具有>95%的特异性^27，35，36。然而，该方案的几个关键步骤需要特别注意，例如，在样品裂解/均质化之前对游离硫醇进行初始封闭，这禁止人工氧化和人工氧化硫醇的非特异性富集²⁵。样品可以在方案的几个阶段和不同的方法进行分析，包?...

讨论

树脂辅助捕获已用于各种样品类型和生物系统，用于研究半胱氨酸残基的氧化修饰²⁵，^29，30。该方法允许在多个水平和读数下评估样品，包括使用SDS-PAGE和蛋白质印迹分析的蛋白质和肽，以及使用质谱法评估单个半胱氨酸位点。无论样品类型或最终终点如何，该方法最终都能高效、特异性地富集含半胱氨酸的蛋白质和肽

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-(Pyridyldithio)ethylamine hydrochloride	Med Chem Express	HY-101794	Reagent for in-house resin synthesis
2.0 mL LoBind centrifuge tubes	Eppendorf	22431048
5.0 mL LoBind centrifuge tubes	Eppendorf	30108310
5.0 mL round bottom tubes	Falcon	352054
Acetone	Fisher Scientific	A949-1
Acetonitrile	Sigma Aldrich	34998
Activated Thiol–Sepharose 4B	Sigma Aldrich	T8512	Potential replacement for thiol-affinity resin
Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filter	Millipore Sigma	UFC5010BK
Ammonium bicarbonate	Sigma Aldrich	09830
Bicinchonicic acid (BCA)	Thermo Scientific	23227	Protein Assay Reagent
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Centrifuge	Eppendorf	5415R
Dithiothreitol (DTT)	Thermo Scientific	20291
EDTA	Sigma Aldrich	E5134
HEPES buffer	Sigma Aldrich	H4034
Homogenizer	BioSpec Products	985370
Iodoacetimide (IAA)	Sigma Aldrich	I1149
N-ethylmaleimide	Sigma Aldrich	4259
NHS-Activated Sepharose 4 Fast Flow	Cytiva	17-0906-01	Reagent for in-house resin synthesis
QIAvac 24 Plus vacuum manifold	Qiagen	19413
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S3014
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma Aldrich	L6026
Sonicator	Branson	1510R-MT
Spin columns	Thermo Scientific	69705
Strata C18-E reverse phase columns	Phenomenex	8B-S001-DAK	Peptide desalting
Thermomixer	Eppendorf	5355
Thiopropyl Sepharose 6B	GE Healthcare	17-0420-01	Thiol-affinity resin; *Production of Thiopropyl Sepharose 6B resin has been discontinued by the manufacturer (see protocol for details).
TMT isobaric labels (16 plex)	Thermo Scientific	A44522	Peptide labeling reagent; available in multiple formats
Triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB)	Sigma Aldrich	T7408
Trifluoroacetic acid (TFA)	Sigma Aldrich	T6508
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
Trypsin	Promega	V5820
Urea	Sigma Aldrich	U5378
Vacufuge Plus speedvac	Eppendorf	22820001	vacuum concentrator
Vortex mixer	Scientific Industries	SI-0236