Capture assistée par résine couplée à un étiquetage de masse en tandem isobare pour la quantification multiplexée de l’oxydation des protéines thiols

Résumé

L’oxydation des protéines thiols a des implications significatives dans des conditions physiologiques et physiopathologiques normales. Nous décrivons les détails d’une méthode quantitative de protéomique redox, qui utilise la capture assistée par résine, le marquage isobare et la spectrométrie de masse, permettant l’identification et la quantification spécifiques au site des résidus de cystéine oxydés de protéines de manière réversible.

Résumé

Les modifications oxydatives réversibles sur les thiols protéiques sont récemment apparues comme des médiateurs importants de la fonction cellulaire. Nous décrivons ici la procédure détaillée d’une méthode quantitative de protéomique redox qui utilise la capture assistée par résine (RAC) en combinaison avec le marquage isobare par étiquette de masse en tandem (TMT) et la chromatographie liquide-spectrométrie de masse en tandem (LC-MS / MS) pour permettre la quantification stochiométrique multiplexée des thiols de protéines oxydées au niveau du protéome. Les informations quantitatives spécifiques au site sur les résidus oxydés de cystéine fournissent des informations supplémentaires sur les impacts fonctionnels de ces modifications.

Le flux de travail est adaptable à de nombreux types d’échantillons, y compris les cellules en culture (par exemple, mammifères, procaryotes) et les tissus entiers (par exemple, le cœur, les poumons, les muscles), qui sont initialement lysés / homogénéisés et avec des thiols libres alkylés pour empêcher l’oxydation artificielle. Les thiols de protéines oxydées sont ensuite réduits et capturés par une résine d’affinité thiol, qui rationalise et simplifie les étapes du flux de travail en permettant aux procédures de digestion, d’étiquetage et de lavage d’être effectuées sans transfert supplémentaire de protéines / peptides. Enfin, les peptides marqués sont élués et analysés par LC-MS/MS pour révéler des changements stœchiométriques complets liés à l’oxydation du thiol sur l’ensemble du protéome. Cette méthode améliore considérablement la compréhension du rôle de la régulation redox-dépendante dans les états physiologiques et physiopathologiques liés à l’oxydation des protéines thiol.

Introduction

Dans des conditions homéostatiques, les cellules génèrent des espèces réactives d’oxygène, d’azote ou de soufre qui aident à faciliter les processus, tels que le métabolisme et la signalisation ^1,2,3, s’étendant à la fois aux procaryotes et aux eucaryotes. Les niveaux physiologiques de ces espèces réactives sont nécessaires au bon fonctionnement cellulaire, également connu sous le nom d'«eustress»^1,4. En revanche, une augmentation des oxydants qui entraîne un déséquilibre entre les oxydants et les antioxydants peut pr....

Protocole

Toutes les procédures décrites dans le protocole concernant les échantillons/tissus animaux ou humains ont été approuvées et suivies par les lignes directrices institutionnelles du comité d’éthique de la recherche sur les humains et les animaux.

1. Homogénéisation/lyse des échantillons

1. Échantillons de tissus congelés
   1. Hacher du tissu congelé (~30 mg) sur une lame de microscope en verre sur de la glace sèche à l’aide d’une lame de rasoir prérefroidie et d’une pince. Transférer le tissu haché dans un tube de polystyrène à fond rond prérefroidi de 5 mL contenant 700 μL de tampon A (voir le tableau 1) et incuber....

Résultats

L’achèvement du protocole entraînera un enrichissement hautement spécifique de peptides contenant de la cystéine anciennement oxydés, souvent avec une spécificité de >95% 27,35,36. Cependant, plusieurs étapes clés du protocole nécessitent une attention particulière, par exemple le blocage initial des thiols libres avant la lyse/homogénéisation de l’échantillon, qui interdit l’oxydation artificielle et l’enr.......

Discussion

La capture assistée par résine a été utilisée dans divers types d’échantillons et systèmes biologiques pour étudier les modifications oxydatives des résidus de cystéine^25,29,30. Cette méthode permet d’évaluer des échantillons à plusieurs niveaux et lectures, y compris des protéines et des peptides à l’aide de SDS-PAGE et de Western blot, ainsi que des sites individuels de cystéine à l’aide de la spectro.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-(Pyridyldithio)ethylamine hydrochloride	Med Chem Express	HY-101794	Reagent for in-house resin synthesis
2.0 mL LoBind centrifuge tubes	Eppendorf	22431048
5.0 mL LoBind centrifuge tubes	Eppendorf	30108310
5.0 mL round bottom tubes	Falcon	352054
Acetone	Fisher Scientific	A949-1
Acetonitrile	Sigma Aldrich	34998
Activated Thiol–Sepharose 4B	Sigma Aldrich	T8512	Potential replacement for thiol-affinity resin
Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filter	Millipore Sigma	UFC5010BK
Ammonium bicarbonate	Sigma Aldrich	09830
Bicinchonicic acid (BCA)	Thermo Scientific	23227	Protein Assay Reagent
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Centrifuge	Eppendorf	5415R
Dithiothreitol (DTT)	Thermo Scientific	20291
EDTA	Sigma Aldrich	E5134
HEPES buffer	Sigma Aldrich	H4034
Homogenizer	BioSpec Products	985370
Iodoacetimide (IAA)	Sigma Aldrich	I1149
N-ethylmaleimide	Sigma Aldrich	4259
NHS-Activated Sepharose 4 Fast Flow	Cytiva	17-0906-01	Reagent for in-house resin synthesis
QIAvac 24 Plus vacuum manifold	Qiagen	19413
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S3014
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma Aldrich	L6026
Sonicator	Branson	1510R-MT
Spin columns	Thermo Scientific	69705
Strata C18-E reverse phase columns	Phenomenex	8B-S001-DAK	Peptide desalting
Thermomixer	Eppendorf	5355
Thiopropyl Sepharose 6B	GE Healthcare	17-0420-01	Thiol-affinity resin; *Production of Thiopropyl Sepharose 6B resin has been discontinued by the manufacturer (see protocol for details).
TMT isobaric labels (16 plex)	Thermo Scientific	A44522	Peptide labeling reagent; available in multiple formats
Triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB)	Sigma Aldrich	T7408
Trifluoroacetic acid (TFA)	Sigma Aldrich	T6508
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
Trypsin	Promega	V5820
Urea	Sigma Aldrich	U5378
Vacufuge Plus speedvac	Eppendorf	22820001	vacuum concentrator
Vortex mixer	Scientific Industries	SI-0236