JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Окисление белка тиола имеет значительные последствия при нормальных физиологических и патофизиологических условиях. Мы описываем детали количественного метода окислительно-восстановительной протеомики, который использует захват с помощью смолы, изобарическую маркировку и масс-спектрометрию, что позволяет идентифицировать и количественно оценивать обратимо окисленные цистеиновые остатки белков.

Аннотация

Обратимые окислительные модификации белковых тиолов недавно стали важными медиаторами клеточной функции. Здесь мы описываем подробную процедуру количественного метода окислительно-восстановительной протеомики, который использует смоляной захват (RAC) в сочетании с изобарической маркировкой тандемной массы (TMT) и жидкостной хроматографией-тандемной масс-спектрометрией (LC-MS / MS), чтобы позволить мультиплексированную стохиометрическую количественную оценку окисленных белковых тиолов на уровне протеома. Количественная информация об окисленных остатках цистеина для конкретных участков дает дополнительное представление о функциональном воздействии таких модификаций.

Рабочий процесс адаптируется ко многим типам образцов, включая культивируемые клетки (например, млекопитающие, прокариоты) и целые ткани (например, сердце, легкие, мышцы), которые первоначально лизируются / гомогенизируются и со свободными тиолами, алкилированными для предотвращения искусственного окисления. Окисленные белковые тиолы затем восстанавливаются и захватываются тиол-аффинной смолой, которая оптимизирует и упрощает этапы рабочего процесса, позволяя выполнять процедуры переваривания, маркировки и промывки без дополнительной передачи белков / пептидов. Наконец, меченые пептиды элюируются и анализируются LC-MS / MS, чтобы выявить комплексные стехиометрические изменения, связанные с окислением тиола во всем протеоме. Этот метод значительно улучшает понимание роли окислительно-восстановительной регуляции при физиологических и патофизиологических состояниях, связанных с окислением белка тиола.

Введение

В гомеостатических условиях клетки генерируют активный кислород, азот или серу, которые помогают облегчить процессы, такие как метаболизм и передача сигналов 1,2,3, распространяющихся как на прокариот, так и на эукариот. Физиологические уровни этих реактивных видов необходимы для правильной клеточной функции, также известной как «эустресс»1,4. Напротив, увеличение окислителей, которое приводит к дисбалансу между окислителями и антиоксидантами, может вызвать окислительный стресс или «дистресс»1, что приводит к повреждению клеток. Окислители передают сигналы биологическим путям, модифицируя различные биомолекулы, включая белок, ДНК, РНК и липиды. В частности, цистеиновые остатки белков представляют собой высокореакционноспособные участки, склонные к окислению из-за тиольной группы на цистеине, которая является реакционноспособной по отношению к различным типам окислителей5. Это приводит к появлению широкого спектра обратимых посттрансляционных модификаций на основе окислительно-восстановительных систем (ПТМ) для цистеина, включая нитрозилирование (SNO), глутатионилирование (SSG), сульфенилирование (SOH), персульфидирование (SSH), полисульфидирование (SSnH), ацилирование и дисульфиды. Необратимые формы окисления цистеина включают сульфинилирование (SO2H) и сульфонилирование (SO3H).

Обратимые окислительные модификации остатков цистеина могут выполнять защитные роли, предотвращающие дальнейшее необратимое окисление, или служить сигнальными молекулами для последующих клеточных путей 6,7. Обратимость некоторых окислительно-восстановительных ПТМ позволяет цистеиновым сайтам функционировать как «окислительно-восстановительные переключатели»8,9, при этом изменения в окислительно-восстановительном состоянии этих сайтов изменяют функцию белка для регулирования их роли в переходных процессах. Модулирующие эффекты окислительно-восстановительных ПТМ10 наблюдались во многих аспектах функциибелка 11, включая катализ12, белково-белковые взаимодействия13, изменение конформации14, координацию ионов металлов15 или фармакологическое связывание ингибитора16. Кроме того, окислительно-восстановительные ПТМ участвуют в цистеиновых сайтах белков, которые регулируют такие пути, как транскрипция17, трансляция18 или метаболизм19. Учитывая влияние, которое окислительно-восстановительные ПТМ оказывают на функцию белка и биологические процессы, важно количественно оценить степень окисления, которую подвергается сайт цистеина в ответ на возмущение окислительно-восстановительного состояния.

Идентификация цистеиновых участков с измененными окислительно-восстановительными состояниями сосредоточена на сравнении состояния окисления на сайт-специфическом уровне между нормальными и возмущенными условиями. Измерения изменения складок часто используются для определения того, какие участки значительно изменены, поскольку это помогает пользователям интерпретировать, какие участки цистеина могут быть физиологически значимыми для исследования. В качестве альтернативы, стехиометрические измерения обратимого окисления тиола в конкретном типе образца дают общую картину физиологического состояния в отношении клеточного окисления, что является важным измерением, которое часто упускается из виду и недостаточно используется. Модификационная стехиометрия основана на количественной оценке процента модифицированного тиола в соотношении к общему тиолу белка (модифицированному и немодифицированному)20,21. В результате стехиометрические измерения предлагают более точное измерение, чем изменение складки, особенно при использовании масс-спектрометрии. Значение увеличения окисления может быть более легко установлено с помощью стехиометрии для определения занятости PTM конкретного участка цистеина. Например, 3-кратное увеличение окисления тиола может быть результатом перехода всего на 1% к 3% или от 30% до 90%. 3-кратное увеличение окисления для участка, который заполняется только на 1%, может оказать незначительное влияние на функцию белка; тем не менее, 3-кратное увеличение для участка с 30% заполняемостью в состоянии покоя может быть более существенным. Стехиометрические измерения, выполняемые между общими окисленными тиолами и специфическими окислительными модификациями, включая глутатионилирование белка (SSG) и нитрозилирование (SNO), могут выявить соотношения и количественную информацию в отношении конкретных типов модификаций.

Поскольку обратимое окисление тиола обычно представляет собой посттрансляционную модификацию с низким содержанием, было разработано несколько подходов для обогащения белков, содержащих эти модификации, из биологических образцов. Ранний подход, разработанный Jaffrey и другими, названный методом переключения биотина (BST)22, включает в себя несколько этапов, на которых немодифицированные тиолы блокируются путем алкилирования, обратимо модифицированные тиолы восстанавливаются до зарождающихся свободных тиолов, зарождающиеся свободные тиолы мечуются биотином, а меченые белки обогащаются сцеплением сродства стрептавидина. Этот метод использовался для профилирования SNO и SSG во многих исследованиях и может быть адаптирован для зондирования других форм обратимого окисления тиола23,24. В то время как BST использовался для исследования различных форм обратимого окисления тиола, одна из проблем с этим подходом заключается в том, что на обогащение влияет неспецифическое связывание небиотинилированных белков со стрептавидином. Альтернативный подход, разработанный в нашей лаборатории, названный смоляным захватом (RAC)25,26 (Рисунок 1), обходит вопрос обогащения тиоловых групп с помощью системы биотин-стрептавидин.

После восстановления обратимо окисленных тиолов белки с зарождающимися свободными тиолами обогащаются тиол-аффинной смолой, которая ковалентно захватывает свободные тиольные группы, что позволяет более специфическо обогащать цистеинсодержащие белки, чем BST. Соединение RAC с мультиплексирующей способностью последних достижений изобарической маркировки и масс-спектрометрии создает надежный и чувствительный рабочий процесс для обогащения, идентификации и количественной оценки обратимо окисленных остатков цистеина на уровне протеома. Последние достижения в области масс-спектрометрии позволили гораздо глубже профилировать тиоловый окислительно-восстановительный протеом, повышая понимание как причины, так и следствия окисления белка тиола27. Информация, полученная на основе количественных данных по конкретным участкам, позволяет проводить дальнейшие исследования механистических воздействий и последующих эффектов обратимых окислительных модификаций28. Использование этого рабочего процесса дало представление о физиологических последствиях обратимого окисления цистеина в отношении нормальных физиологических событий, таких как старение, при этом уровни SSG различались в зависимости от возраста. Эффекты старения на SSG были частично обращены вспять с помощью SS-31 (эламипретид), нового пептида, который усиливает митохондриальную функцию и снижает уровень SSG у пожилых мышей, в результате чего у них профиль SSG, более похожий на молодых мышей29.

Было показано, что патофизиологические условия, связанные с воздействием наночастиц, включают SSG в модель макрофагов мыши. Используя RAC в сочетании с масс-спектрометрией, авторы показали, что уровни SSG напрямую коррелируют со степенью окислительного стресса и нарушения фагоцитарной функции макрофагов. Данные также выявили специфические для пути различия в реакции на различные инженерные наноматериалы, которые вызывают различные степени окислительного стресса30. Метод также доказал свою полезность при прокариотических видах, где он применялся для изучения влияния суточных циклов на фотосинтетические цианобактерии в отношении окисления тиола. Наблюдались широкие изменения в окислении тиола в нескольких ключевых биологических процессах, включая перенос электронов, фиксацию углерода и гликолиз. Кроме того, с помощью ортогональной валидации было подтверждено, что несколько ключевых функциональных участков были модифицированы, что свидетельствует о регуляторной роли этих окислительных модификаций6.

Здесь мы описываем детали стандартизированного рабочего процесса (рисунок 1), демонстрируя полезность подхода RAC для обогащения общих окисленных цистеиновых тиолов белков и их последующей маркировки и стехиометрической количественной оценки. Этот рабочий процесс был реализован в исследованиях окислительно-восстановительного состояния в различных типах образцов, включая клеточные культуры27,30 и целые ткани (например, скелетные мышцы, сердце, легкие)29,31,32,33. Хотя протокол RAC не включен здесь, он также легко адаптируется для исследования конкретных форм обратимых окислительно-восстановительных модификаций, включая SSG, SNO и S-ацилирование, как упоминалось ранее 25,29,34.

протокол

Все процедуры, описанные в протоколе, связанные с образцами/тканями животных или человека, были одобрены и соответствовали институциональным руководящим принципам Комитета по этике исследований человека и животных.

1. Гомогенизация/лизис образцов

  1. Замороженные образцы тканей
    1. Измельчите замороженную ткань (~30 мг) на предметном стекле микроскопа по сухому льду с помощью предварительно охлажденного лезвия бритвы и щипцов. Переложить измельченную ткань в предварительно охлажденную полистирольную трубку круглого дна объемом 5 мл, содержащую 700 мкл буфера А (см. таблицу 1), и инкубировать на льду в течение 30 мин, защищенном от света.
    2. Разрушают ткань в течение 30 с или до полной гомогенизации с помощью ручного гомогенизатора тканей. Поместите образцы на лед и дайте пене спуститься еще на 10 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Алюминиевый противень, помещенный на сухой лед, обеспечивает стабильную рабочую поверхность и платформу для первоначальной обработки/измельчения ткани.
  2. Альтернативно, используют адгезивные клеточные культуры в 100 мм культуральных чашках в качестве исходного материала.
    1. Держите клетки на льду и используйте серологическую пипетку, чтобы промыть клетки дважды 10 мл ледяного PBS, содержащего 100 мМ NEM.
    2. Лизируйте клетки, добавляя 1 мл буфера холодной гомогенизации/лизиса и энергично соскребая жестким клеточным скребком. Перенесите лизат в центрифужную трубку объемом 2 мл с помощью микропипетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер промывки и буфер лизиса могут быть масштабированы в соответствии с сосудами культуры разного размера. Как правило, требуется 2-5 миллионов клеток; однако это варьируется в зависимости от эффективности лизиса и выхода белка для конкретных типов клеток. Буфер гомогенизации может быть получен без NEM для образцов, анализируемых на общие тиолы.
  3. Перенесите полученный гомогенат (стадия 1.1.2 или 1.2.2) в центрифужную трубку объемом 2 мл с помощью микропипетки и центрифугу на полной скорости (≥16 000 × г) при 4 °C в течение 10 мин.
  4. Перенесите супернатант (~700 мкл или ~1 мл для клеточной культуры) с помощью микропипетки в коническую микроцентрифужную трубку объемом 5 мл и инкубируйте в течение 30 мин при 55 °C в темноте с встряхиванием при 850 об/мин.
  5. Используя стеклянную серологическую пипетку, добавьте 4 мл ледяного ацетона в образцы и инкубируйте при -20 °C в течение ночи для осаждения белка и удаления избытка N-этилмалеймида.

2. Захват смолой

  1. Дважды промыть осажденные белковые гранулы ацетоном путем центрифугирования при 20 500 × г при 4 °C в течение 10 мин, декантируя ацетон, удаляя оставшийся ацетон с помощью микропипетки и добавляя 3 мл свежего ледяного ацетона с помощью стеклянной серологической пипетки. Инвертировать несколько раз, чтобы перемешать. После второй промывки дайте гранулам высохнуть на воздухе в течение 1-2 минут, стараясь не пересохнуть, так как повторное суспендирование может стать затруднительным.
  2. Используя микропипетку, добавляют 1 мл буфера В (см. Табл. 1) и солюбилизируют белок с помощью повторной обработки ультразвуком в течение 15-30 с за один раз с использованием звукового анализатора ванны с выходом 250 Вт и коротким вихрем. Измерьте концентрацию белка с помощью анализа бицинхониновой кислоты (BCA) в соответствии с протоколом производителя.
  3. Чтобы стандартизировать концентрации белка в образцах для дальнейшей обработки и обеспечить полное удаление NEM, перенесите 500 мкг белка в центробежный фильтр 0,5 мл 10 кДа с помощью микропипетки и отрегулируйте до конечного объема 500 мкл с буфером повторного суспензии.
  4. Центрифуга при 14 000 × г при комнатной температуре до тех пор, пока объем в центробежном фильтре не составит менее 100 мкл. Соберите образцы путем инвертирования фильтра в коллекторной трубке. Центрифуга при 1000 × г в течение 2 мин и регулировка до конечного объема 500 мкл с использованием буфера С (см. Таблицу 1).
  5. Уменьшают тиолы белка путем добавления 20 мкл 500 мМ дитиотрейтола (DTT) с использованием микропипетки до конечной концентрации 20 мМ и инкубации образцов в течение 30 мин при 37 °C при встряхивании при 850 об/мин.
  6. После восстановления переведите образцы с помощью микропипетки на центробежные фильтры и центрифугу объемом 0,5 мл 10 кДа в течение 15 мин при 14 000 × г при комнатной температуре или до тех пор, пока объем в центробежном фильтре не составит менее 100 мкл. Добавьте буфер D (см. Таблицу 1), чтобы восполнить объем в центробежном фильтре до 500 мкл.
    1. Повторите центрифугирование и добавление до 500 мкл на стадии 2,6 три раза, а после четвертой центрифугирования соберите образцы путем инвертирования фильтра в коллекторной трубке и центрифугирования при 1000 × г в течение 2 мин.
  7. Измерьте концентрацию белка с помощью анализа BCA в соответствии с протоколом производителя.
  8. Во время этого буферного обмена готовят тиол-аффинную смолу, взвешивая соответствующее количество смолы (30 мг / образец) с использованием микровеса и перенося ее в 50 мл центрифужную трубку. Затем, используя серологическую пипетку, добавляют воду для конечной концентрации смолы 30 мг/мл и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч с перемешиванием для правильной гидратации смолы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Упомянутая выше тиолаффинная смола была прекращена производителем. Возможная замена этой тиол-аффинной смолы коммерчески доступна. Однако эта замена имеет почти в 5 раз меньшую связующую способность (см. Дополнительную информацию). Альтернативно, тиол-аффинная смола может быть синтезирована с использованием 2-(пиридилдитио)этиламина гидрохлорида и N-гидроксисукцинимид-активированной смолы (см. Дополнительную информацию).
    1. После гидратации смолы поместите спиновые колонны на вакуумный коллектор и перенесите 500 мкл смолистой суспензии с помощью микропипетки в каждую колонну. Применяйте вакуум для удаления воды; Повторите этот шаг один раз, чтобы получить в общей сложности 30 мг смолы на столбец. Альтернативно, центрифуга на 1000 × г в течение 2 мин вместо использования вакуумного коллектора для этого и всех этапов промывки и элюирования смолы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вырезание конца наконечника пипетки объемом 1000 мкл для увеличения размера отверстия помогает с переносом смолы. Важно тритурировать между пипетками, чтобы гарантировать, что смола остается взвешенной и однородной, и равное количество смолы переносится в каждую колонну.
    2. Промыть смолу, добавив 500 мкл сверхчистой воды микропипеткой и применив вакуум для удаления воды; повторите это 5 раз. Затем промыть смолу 5 раз 500 мкл буфера Е (см. табл. 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативно, центрифугирование при 1 000 х г в течение 2 мин может использоваться вместо вакуумного коллектора для всех последующих этапов промывки. Все последующие этапы промывки выполняются объемом 500 мкл. При добавлении буферов для промывки в колонку осторожно добавляйте с достаточным усилием, чтобы полностью повторно суспендировать смолу, избегая при этом разбрызгивания и потери смолы; это позволяет полностью и эффективно промывать смолу.
  9. Используя микропипетку, перенесите 150 мкг белка из каждого восстановленного образца в новую пробирку и отрегулируйте до конечного объема 120 мкл буфера С (см. Таблицу 1). Переложите белковый раствор с помощью микропипетки в закупоренную спиновую колонну, содержащую смолу, поместите колпачок на колонку и инкубируйте в течение 2 ч при комнатной температуре с встряхиванием при 850 об/мин.
  10. Промыть смолу пять раз при 25 мМ HEPES, рН 7,0; 8 М мочевины; затем пять раз с 2 M NaCl; затем пять раз с 80% ацетонитрилом (ACN) с 0,1% трифторуксусной кислотой (TFA); и, наконец, пять раз с 25 мМ HEPES, рН 7,7, как описано в шаге 2.8.2, и замените вилку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы могут быть элюированы здесь для анализа на уровне белка (например, электрофорез SDS-полиакриламидного геля (SDS-PAGE), вестерн-блот), как описано в шаге 4.1.

3. Триптическое сбраживание на смоле и маркировка ТМТ

  1. Готовят достаточное количество модифицированного раствора трипсина для 6-8 мкг на образец путем солюбилизации его в концентрации 0,5 мкг/мкл в буфере С (см. Таблицу 1) таким образом, чтобы конечный объем позволял составлять не менее 120 мкл на образец. Используя микропипетку, добавьте 120 мкл этого раствора трипсина в образцы и инкубируйте в течение ночи при 37 °C с встряхиванием при 850 об/мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для повышения эффективности пищеварения можно включить дополнительный этап пищеварения на следующий день, удалив раствор трипсина и заменив его свежим раствором, и продолжайте пищеварение в течение 2 ч.
  2. Промыть смолу пять раз при 25 мМ HEPES, рН 7,0; затем следует пять раз 2 M NaCl; затем в пять раз с 80% ACN с 0,1% TFA; затем трижды с 25 мМ HEPES, рН 7,7. Наконец, промыть смолу два раза с помощью 50 мМ триэтиламмонийбикарбонатного буфера (TEAB) и заменить заглушку.
  3. Приготовьте реагенты для маркировки TMT, сначала позволив им нагреться до комнатной температуры, прежде чем ненадолго вращаться с помощью центрифуги при 16 000 × г. Добавьте 150 мкл безводного ACN к каждому флакону реагента для маркировки TMT с помощью микропипетки. Инкубировать флаконы при комнатной температуре на термомиксоре, установленном на 850 об/мин в течение 5 мин, чтобы полностью солюбилизировать реагент. Ненадолго вихрь и вращайтесь вниз на 16 000 × г , чтобы собрать реагент.
  4. Используя микропипетку, добавляют 40 мкл 100 мМ TEAB к промытой смоле, затем добавляют 70 мкл растворенного реагента TMT и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре с встряхиванием при 850 об/мин. Храните оставшийся реагент ТМТ при -80 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обратите внимание на отдельные метки ТМТ, присвоенные каждому биологическому образцу (рисунок 1).
  5. Промыть смолу пять раз с 80% ACN с 0,1% TFA, три раза с буфером бикарбоната аммония (ABC) 100 мМ, рН 8,0 и два раза водой, как описано ранее, и заменить заглушку.

4. Пептидное элюирование

  1. Элюируют меченые пептиды путем добавления 100 мкл 20 мМ DTT в 100 мМ ABC, рН 8,0, в каждую колонку с помощью микропипетки и инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин на термомиксаторе, установленном на 850 об/мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После добавления DTT смола будет слипаться. Смола может быть разрушена наконечником пипетки, чтобы разбить сгустки и обеспечить полное элюирование пептидов.
  2. После этой инкубации поместите колонну на вакуумный коллектор, предназначенный для твердофазной экстракции (SPE), примените вакуум и элюируйте образцы в микроцентрифужную трубку объемом 5 мл. Повторите этот шаг один раз.
  3. Наконец, добавляют 100 мкл 80% ACN с 0,1% TFA, инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре и элюируют в ту же 5 мл центрифужную трубку. Соберите все фракции в одну и ту же микроцентрифужную трубку объемом 5 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для предотвращения потери пробы для элюирования должны использоваться низкосвязующие трубки, а объемы должны поддерживаться на уровне или ниже объема 4,0 мл для одной трубки объемом 5 мл.
  4. Поместите элюированные образцы в вакуумный концентратор до высыхания. Храните сухие пептиды при -80 °C и повторно суспендируйте их позже.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы также могут быть элюированы отдельно, а аликвота может быть удалена и проанализирована SDS-PAGE для анализа на пептидном уровне перед объединением образцов.

5. Пептидное алкилирование и обессоливание/очистка

  1. Повторно суспендируют высушенные пептиды, добавляя небольшой объем 100 мМ ABC буфера, рН 8,0 (не более 500 мкл), используя микропипетку. Используйте повторную обработку ультразвуком в течение 15-30 с за один раз с использованием звукового анализатора ванны с выходом 250 Вт и вихрем для солюбилизации и переноса в трубку объемом 2 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем 100 мМ ABC, pH 8,0 должен быть добавлен на основе объема, необходимого для повторного суспендирования DTT при молярности 150 мМ. Пользователям необходимо будет определить количество DTT, присутствующего в их выборке, на основе того, что было добавлено первоначально на шаге 4.1.
  2. Добавьте достаточно концентрированного исходного раствора (600 мМ) йодоацетамида (IAA), растворенного в ABC с использованием микропипетки, для достижения молярного соотношения DTT:IAA 1:4 и инкубируйте образцы при RT в течение 1 ч с встряхиванием при 850 об/мин.
  3. Подкисляют образцы до рН-< 3 путем добавления концентрированного TFA (10%) с помощью микропипетки и выполняют обессоливание образца с использованием обратнофазной очистки в соответствии с инструкциями производителя.
  4. Поместите чистые пептиды в вакуумный концентратор до высыхания. Хранить сухие пептиды при -80 °C до дальнейшего анализа.

6. Жидкостная хроматография-тандемная масс-спектрометрия

  1. Повторно суспендируют высушенные пептиды повторным ультразвуком в течение 15-30 с за один раз с помощью анализатора ванны с выходом 250 Вт и вихрем в 20-40 мкл воды, содержащей 3% ACN. Определите концентрацию пептида, выполнив анализ BCA в соответствии с протоколом производителя.
  2. Разделите образцы по обратнофазным LC и MS/MS, как описано ранее6, и запишите спектры MS1 в диапазоне m/z 400-2000. Обеспечить использование высокоэнергетической коллизионной диссоциации (HCD) для получения репортерной информации об интенсивности ионов для анализа изобарически меченых пептидов. Более подробную информацию об условиях работы приборов 27,30 и анализе данных MS 27,31 см. в разделах о методах предыдущих отчетов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа образцов пептидов могут использоваться различные системы или настройки LC-MS/MS. Охват и чувствительность идентификации пептидов будут зависеть от конкретной используемой системы и настроек.

Результаты

Завершение протокола приведет к высокоспецифичному обогащению ранее окисленных цистеинсодержащих пептидов, часто со специфичностью >95% 27,35,36. Однако несколько ключевых этапов протокола требуют особого внимания, например, первоначаль...

Обсуждение

Улавливание с помощью смолы использовалось в различных типах образцов и биологических системах для исследования окислительных модификаций остатков цистеина 25,29,30. Этот метод позволяет оценивать образцы на нескольких уровнях и показ?...

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов, финансовых или иных.

Благодарности

Часть работы была поддержана грантами NIH R01 DK122160, R01 HL139335 и U24 DK112349

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
2-(Pyridyldithio)ethylamine hydrochlorideMed Chem ExpressHY-101794Reagent for in-house resin synthesis
2.0 mL LoBind centrifuge tubesEppendorf22431048
5.0 mL LoBind centrifuge tubesEppendorf30108310
5.0 mL round bottom tubesFalcon352054
AcetoneFisher ScientificA949-1
AcetonitrileSigma Aldrich34998
Activated Thiol–Sepharose 4BSigma AldrichT8512Potential replacement for thiol-affinity resin
Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filterMillipore SigmaUFC5010BK
Ammonium bicarbonateSigma Aldrich09830
Bicinchonicic acid (BCA)Thermo Scientific23227Protein Assay Reagent
CentrifugeEppendorf5810R
CentrifugeEppendorf5415R
Dithiothreitol (DTT)Thermo Scientific20291
EDTASigma AldrichE5134
HEPES bufferSigma AldrichH4034
HomogenizerBioSpec Products985370
Iodoacetimide (IAA)Sigma AldrichI1149
N-ethylmaleimideSigma Aldrich4259
NHS-Activated Sepharose 4 Fast FlowCytiva17-0906-01Reagent for in-house resin synthesis
QIAvac 24 Plus vacuum manifoldQiagen19413
Sodium chlorideSigma AldrichS3014
Sodium dodecyl sulfate (SDS)Sigma AldrichL6026
SonicatorBranson1510R-MT
Spin columnsThermo Scientific69705
Strata C18-E reverse phase columnsPhenomenex8B-S001-DAKPeptide desalting
ThermomixerEppendorf5355
Thiopropyl Sepharose 6BGE Healthcare17-0420-01Thiol-affinity resin; *Production of Thiopropyl Sepharose 6B resin has been discontinued by the manufacturer (see protocol for details).
TMT isobaric labels (16 plex)Thermo ScientificA44522Peptide labeling reagent; available in multiple formats
Triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB)Sigma AldrichT7408
Trifluoroacetic acid (TFA)Sigma AldrichT6508
Triton X-100Sigma AldrichT8787
TrypsinPromegaV5820
UreaSigma AldrichU5378
Vacufuge Plus speedvacEppendorf22820001vacuum concentrator
Vortex mixerScientific IndustriesSI-0236

Ссылки

  1. Sies, H., Jones, D. P. Reactive oxygen species (ROS) as pleiotropic physiological signalling agents. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (7), 363-383 (2020).
  2. Adams, L., Franco, M. C., Estevez, A. G. Reactive nitrogen species in cellular signaling. Experimental Biology and Medicine. 240 (6), 711-717 (2015).
  3. Olson, K. R. The biological legacy of sulfur: A roadmap to the future. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 252, 110824 (2021).
  4. Sies, H. Oxidative eustress: on constant alert for redox homeostasis. Redox Biology. 41, 101867 (2021).
  5. Poole, L. B. The basics of thiols and cysteines in redox biology and chemistry. Free Radical Biology & Medicine. 80, 148-157 (2015).
  6. Guo, J., et al. Proteome-wide light/dark modulation of thiol oxidation in cyanobacteria revealed by quantitative site-specific redox proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (12), 3270-3285 (2014).
  7. Shi, X., Qiu, H. Post-translational S-nitrosylation of proteins in regulating cardiac oxidative stress. Antioxidants. 9 (11), 1051 (2020).
  8. Fra, A., Yoboue, E. D., Sitia, R. Cysteines as redox molecular switches and targets of disease. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 167 (2017).
  9. Klomsiri, C., Karplus, P. A., Poole, L. B. Cysteine-based redox switches in enzymes. Antioxidants & Redox Signaling. 14 (6), 1065-1077 (2011).
  10. Go, Y. M., Jones, D. P. The redox proteome. Journal of Biological Chemistry. 288 (37), 26512-26520 (2013).
  11. Bak, D. W., Bechtel, T. J., Falco, J. A., Weerapana, E. Cysteine reactivity across the subcellular universe. Current Opinion in Chemical Biology. 48, 96-105 (2019).
  12. Skryhan, K., et al. The role of cysteine residues in redox regulation and protein stability of Arabidopsis thaliana starch synthase 1. PLoS One. 10 (9), 0136997 (2015).
  13. Su, Z., et al. Global redox proteome and phosphoproteome analysis reveals redox switch in Akt. Nature Communications. 10 (1), 5486 (2019).
  14. Liebthal, M., Schuetze, J., Dreyer, A., Mock, H. -. P., Dietz, K. -. J. Redox conformation-specific protein-protein interactions of the 2-cysteine peroxiredoxin in Arabidopsis. Antioxidants. 9 (6), 515 (2020).
  15. Pace, N. J., Weerapana, E. Zinc-binding cysteines: diverse functions and structural motifs. Biomolecules. 4 (2), 419-434 (2014).
  16. Schwartz, P. A., et al. Covalent EGFR inhibitor analysis reveals importance of reversible interactions to potency and mechanisms of drug resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (1), 173 (2014).
  17. Sevilla, E., Bes, M. T., González, A., Peleato, M. L., Fillat, M. F. Redox-based transcriptional regulation in prokaryotes: revisiting model mechanisms. Antioxidants & Redox Signaling. 30 (13), 1651-1696 (2018).
  18. Topf, U., et al. Quantitative proteomics identifies redox switches for global translation modulation by mitochondrially produced reactive oxygen species. Nature Communications. 9 (1), 324 (2018).
  19. Gao, X. -. H., et al. Discovery of a redox thiol switch: implications for cellular energy metabolism. Molecular & Cellular Proteomics. 19 (5), 852-870 (2020).
  20. Prus, G., Hoegl, A., Weinert, B. T., Choudhary, C. Analysis and interpretation of protein post-translational modification site stoichiometry. Trends in Biochemical Sciences. 44 (11), 943-960 (2019).
  21. Zhang, T., Gaffrey, M. J., Li, X., Qian, W. J. Characterization of cellular oxidative stress response by stoichiometric redox proteomics. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 320 (2), 182-194 (2021).
  22. Jaffrey, S. R., Erdjument-Bromage, H., Ferris, C. D., Tempst, P., Snyder, S. H. Protein S-nitrosylation: a physiological signal for neuronal nitric oxide. Nature Cell Biology. 3 (2), 193-197 (2001).
  23. Alcock, L. J., Perkins, M. V., Chalker, J. M. Chemical methods for mapping cysteine oxidation. Chemical Society Reviews. 47 (1), 231-268 (2018).
  24. Li, R., Kast, J. Biotin switch assays for quantitation of reversible cysteine oxidation. Methods in Enzymology. 585, 269-284 (2017).
  25. Guo, J., et al. Resin-assisted enrichment of thiols as a general strategy for proteomic profiling of cysteine-based reversible modifications. Nature Protocols. 9 (1), 64-75 (2014).
  26. Liu, T., et al. High-throughput comparative proteome analysis using a quantitative cysteinyl-peptide enrichment technology. Analytical Chemistry. 76 (18), 5345-5353 (2004).
  27. Duan, J., et al. Stochiometric quantification of the thiol redox proteome of macrophages reveals subcellular compartmentalization and susceptibility to oxidative perturbations. Redox Biology. 36, 101649 (2020).
  28. Mitchell, A. R., et al. Redox regulation of pyruvate kinase M2 by cysteine oxidation and S-nitrosation. Biochemical Journal. 475 (20), 3275-3291 (2018).
  29. Campbell, M. D., et al. Improving mitochondrial function with SS-31 reverses age-related redox stress and improves exercise tolerance in aged mice. Free Radical Biology & Medicine. 134, 268-281 (2019).
  30. Duan, J., et al. Quantitative profiling of protein S-glutathionylation reveals redox-dependent regulation of macrophage function during nanoparticle-induced oxidative stress. ACS Nano. 10 (1), 524-538 (2016).
  31. Wang, J., et al. Protein thiol oxidation in the rat lung following e-cigarette exposure. Redox Biology. 37, 101758 (2020).
  32. Kramer, P. A., et al. Fatiguing contractions increase protein S-glutathionylation occupancy in mouse skeletal muscle. Redox Biology. 17, 367-376 (2018).
  33. Chiao, Y. A., et al. Late-life restoration of mitochondrial function reverses cardiac dysfunction in old mice. Elife. 9, 55513 (2020).
  34. Forrester, M. T., et al. Site-specific analysis of protein S-acylation by resin-assisted capture. Journal of Lipid Research. 52 (2), 393-398 (2011).
  35. Su, D., et al. Quantitative site-specific reactivity profiling of S-nitrosylation in mouse skeletal muscle using cysteinyl peptide enrichment coupled with mass spectrometry. Free Radical Biology & Medicine. 57, 68-78 (2013).
  36. Su, D., et al. Proteomic identification and quantification of S-glutathionylation in mouse macrophages using resin-assisted enrichment and isobaric labeling. Free Radical Biology & Medicine. 67, 460-470 (2014).
  37. Searle, B. C., Yergey, A. L. An efficient solution for resolving iTRAQ and TMT channel cross-talk. Journal of Mass Spectrometry. 55 (8), 4354 (2020).
  38. Duan, J., Gaffrey, M. J., Qian, W. J. Quantitative proteomic characterization of redox-dependent post-translational modifications on protein cysteines. Molecular BioSystems. 13 (5), 816-829 (2017).
  39. Behring, J. B., et al. Spatial and temporal alterations in protein structure by EGF regulate cryptic cysteine oxidation. Science Signaling. 13 (615), 7315 (2020).
  40. Shakir, S., Vinh, J., Chiappetta, G. Quantitative analysis of the cysteine redoxome by iodoacetyl tandem mass tags. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (15), 3821-3830 (2017).
  41. Gorin, G., Martic, P. A., Doughty, G. Kinetics of the reaction of N-ethylmaleimide with cysteine and some congeners. Archives of Biochemistry and Biophysics. 115 (3), 593-597 (1966).
  42. Hsu, M. -. F., et al. Distinct effects of N-ethylmaleimide on formyl peptide- and cyclopiazonic acid-induced Ca2+ signals through thiol modification in neutrophils. Biochemical Pharmacology. 70 (9), 1320-1329 (2005).
  43. Li, R., Huang, J., Kast, J. Identification of total reversible cysteine oxidation in an atherosclerosis model using a modified biotin switch assay. Journal of Proteome Research. 14 (5), 2026-2035 (2015).
  44. Wang, J., et al. Integrated dissection of cysteine oxidative post-translational modification proteome during cardiac hypertrophy. Journal of Proteome Research. 17 (12), 4243-4257 (2018).
  45. Patra, K. K., Bhattacharya, A., Bhattacharya, S. Molecular dynamics investigation of a redox switch in the anti-HIV protein SAMHD1. Proteins. 87 (9), 748-759 (2019).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

172RACTMTPTM

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены