JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

לחמצון חלבון תיול יש השלכות משמעותיות בתנאים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים רגילים. אנו מתארים את הפרטים של שיטת פרוטאומיקה כמותית של חמצון-חיזור, המשתמשת בלכידה בסיוע שרף, תיוג איזוברי וספקטרומטריית מסה, ומאפשרת זיהוי וכימות ספציפיים לאתר של שאריות ציסטאין מחומצנות באופן הפיך של חלבונים.

Abstract

שינויים חמצוניים הפיכים בתיולים חלבוניים התגלו לאחרונה כמתווכים חשובים של תפקוד התאים. להלן נתאר את ההליך המפורט של שיטת פרוטאומיקה כמותית של חמצון-חיזור המשתמשת בלכידה בסיוע שרף (RAC) בשילוב עם תיוג איזוברי של תג מסה טנדם (TMT) וספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיה נוזלית-טנדם (LC-MS/MS) כדי לאפשר כימות סטוכיומטרי מרובב של תיולים חלבוניים מחומצנים ברמת הפרוטאום. המידע הכמותי הספציפי לאתר על שאריות ציסטאין מחומצן מספק תובנה נוספת לגבי ההשפעות הפונקציונליות של שינויים כאלה.

זרימת העבודה ניתנת להתאמה על פני סוגי דגימות רבים, כולל תאים בתרבית (למשל, יונקים, פרוקריוטים) ורקמות שלמות (למשל, לב, ריאות, שרירים), אשר בתחילה שוכבים/הומוגניים ועם תיולים חופשיים להיות alkylated כדי למנוע חמצון מלאכותי. לאחר מכן, תיול החלבון המחומצן מצטמצם ונלכד על ידי שרף זיקה לתיול, אשר מייעל ומפשט את שלבי זרימת העבודה בכך שהוא מאפשר לבצע את הליכי העיכול, הסימון והשטיפה ללא העברה נוספת של חלבונים/פפטידים. לבסוף, הפפטידים המסומנים עוברים אלוט וניתוח על ידי LC-MS/MS כדי לחשוף שינויים סטויכיומטריים מקיפים הקשורים לחמצון תיול על פני הפרוטאום כולו. שיטה זו משפרת מאוד את ההבנה של התפקיד של ויסות תלוי חמצון-חיזור במצבים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים הקשורים לחמצון חלבון תיול.

Introduction

בתנאים הומאוסטטיים, תאים מייצרים חמצן, חנקן או מיני גופרית תגובתיים המסייעים להקל על תהליכים, כגון חילוף חומרים ואיתות 1,2,3, המגיעים הן לפרוקריוטים והן לאאוקריוטים. רמות פיזיולוגיות של מינים תגובתיים אלה נחוצות לתפקוד תקין של התאים, הידוע גם בשם 'eustress'1,4. לעומת זאת, עלייה במחמצנים שמובילה לחוסר איזון בין מחמצנים לנוגדי חמצון עלולה לגרום לעקה חמצונית, או 'מצוקה'1, שמובילה לפגיעה בתאים. מחמצנים מתמרים אותות למסלולים ביולוגיים על ידי שינוי ביומולקולות שונות, כולל חלבונים, דנ"א, רנ"א ושומנים. בפרט, שאריות ציסטאין של חלבונים הן אתרים תגובתיים מאוד המועדים לחמצון עקב קבוצת התיול על ציסטאין, שהוא תגובתי כלפי סוגים שונים של מחמצנים5. זה יוצר מגוון רחב של שינויים פוסט-טרנסלציוניים הפיכים מבוססי חמצון-חיזור (PTMs) עבור ציסטאין, כולל ניטרוזילציה (SNO), גלוטתיוניל (SSG), סולפנילציה (SOH), פרסולפידציה (SSH), פוליסולפידציה (SSnH), אצילציה ודיסולפידים. צורות בלתי הפיכות של חמצון ציסטאין כוללות סולפינילציה (SO2H) וסולפונילציה (SO3H).

שינויים חמצוניים הפיכים של שאריות ציסטאין עשויים לשמש כמגנים ולמנוע חמצון בלתי הפיך נוסף או לשמש כמולקולות איתות למסלולים תאיים במורד הזרם 6,7. ההפיכות של חלק מה-PTMs של חמצון-חיזור מחדש של תיול מאפשרת לאתרי ציסטאין לתפקד כ"מתגי חמצון-חיזור"8,9, כאשר שינויים במצב חמצון-חיזור של אתרים אלה משנים את תפקוד החלבון כדי לווסת את תפקידם בתהליכים חולפים. ההשפעות המווסתות של PTMs10 של חמצון-חיזור נצפו בהיבטים רבים של תפקוד חלבונים11, כולל קטליזה12, אינטראקציות חלבון-חלבון 13, שינוי קונפורמציה 14, תיאום יוני מתכת 15, או קשירת מעכבים פרמקולוגית 16. בנוסף, PTMs של חמצון-חיזור מעורבים באתרי ציסטאין של חלבונים המווסתים מסלולים כגון שעתוק17, תרגום 18 או חילוף חומרים19. בהתחשב בהשפעה שיש ל-PTMs של חמצון-חיזור על תפקוד חלבונים ותהליכים ביולוגיים, חשוב לכמת את מידת החמצון שעובר אתר ציסטאין בתגובה להפרעה במצב חמצון-חיזור.

הזיהוי של אתרי ציסטאין עם מצבי חמצון-חיזור משתנים מתמקד בהשוואה של מצב החמצון ברמה הספציפית לאתר בין תנאים נורמליים לתנאים מופרעים. מדידות שינוי קיפול משמשות לעתים קרובות כדי לקבוע אילו אתרים משתנים באופן משמעותי מכיוון שזה עוזר למשתמשים לפרש אילו אתרי ציסטאין עשויים להיות משמעותיים מבחינה פיזיולוגית למחקר. לחלופין, מדידות סטויכיומטריות של חמצון תיול הפיך על פני סוג דגימה מסוים נותנות תמונה כללית של המצב הפיזיולוגי ביחס לחמצון התאים, מדידה חשובה שלעתים קרובות מתעלמים ממנה ולא מנצלים אותה. סטויכיומטריה של שינוי מבוססת על כימות אחוז התיול המהונדס כיחס לסך החלבון תיול (שונה ולא שונה)20,21. כתוצאה מכך, מדידות סטויכיומטריות מציעות מדידה מדויקת יותר מאשר שינוי קיפול, במיוחד בעת שימוש בספקטרומטריית מסות. ניתן לברר ביתר קלות את משמעות העלייה בחמצון על ידי שימוש בסטויכיומטריה כדי לקבוע את תפוסת ה- PTM של אתר ציסטאין מסוים. לדוגמה, עלייה של פי 3 בחמצון תיול יכולה לנבוע ממעבר של 1% ל-3% או מגודל של 30% עד 90%. עלייה של פי 3 בחמצון עבור אתר שנמצא בתפוסה של 1% בלבד עשויה להיות בעלת השפעה מועטה על תפקוד החלבון; עם זאת, עלייה של פי 3 עבור אתר עם תפוסה של 30% במצב מנוחה עשויה להיות מושפעת באופן משמעותי יותר. מדידות סטויכיומטריות, כאשר הן מבוצעות בין סך כל התיולים המחומצנים לבין שינויים חמצוניים ספציפיים, כולל חלבון גלוטתיוניל (SSG) וניטרוסילציה (SNO), יכולות לחשוף יחסים ומידע כמותי ביחס לסוגי שינויים ספציפיים.

מאחר שחמצון תיול הפיך הוא בדרך כלל שינוי פוסט-טרנסלציוני בעל שפע נמוך, פותחו גישות רבות להעשרת חלבונים המכילים שינויים אלה מתוך דגימות ביולוגיות. גישה מוקדמת שהומצאה על ידי ג'פרי ואחרים, שנקראה טכניקת מתג הביוטין (BST)22, כוללת שלבים מרובים שבהם תיולים ללא שינוי נחסמים באמצעות אלקילציה, תיולים שעברו שינוי הפיך מצטמצמים לתיולים חופשיים מתהווים, תיולים חופשיים מתהווים מסומנים בביוטין, והחלבונים המסומנים מועשרים על ידי משיכה של זיקה לסטרפטאווידין. טכניקה זו שימשה לפרופיל SNO ו- SSG במחקרים רבים וניתן להתאים אותה כדי לחקור צורות אחרות של חמצון תיול הפיך23,24. בעוד ש-BST נוצל כדי לחקור צורות שונות של חמצון תיול הפיך, אחד החששות בגישה זו הוא שההעשרה מושפעת מהקשירה הלא ספציפית של חלבונים לא ביוטינילטים לסטרפטאבידין. גישה חלופית שפותחה במעבדה שלנו, שנקראת לכידה בסיוע שרף (RAC)25,26 (איור 1), עוקפת את הנושא של העשרת קבוצות תיול באמצעות מערכת ביוטין-סטרפטאווידין.

בעקבות הפחתה של תיולים מחומצנים באופן הפיך, חלבונים עם תיולים חופשיים מתהווים מועשרים על ידי שרף זיקה תיול, אשר לוכד באופן קוולנטי קבוצות תיול חופשי, ומאפשר העשרה ספציפית יותר של חלבונים המכילים ציסטאין מאשר BST. צימוד RAC עם כוח הריבוב של ההתקדמות האחרונה בתיוג איזוברי וספקטרומטריית מסות יוצר זרימת עבודה חזקה ורגישה להעשרה, זיהוי וכימות של שאריות ציסטאין מחומצנות באופן הפיך ברמה הרחבה של פרוטאום. ההתקדמות האחרונה בספקטרומטריית מסות אפשרה פרופיל עמוק הרבה יותר של פרוטאום החיזור של תיול, מה שהגביר את ההבנה של הסיבה והתוצאה של חמצון תיול חלבון27. המידע המתקבל מנתונים כמותיים ספציפיים לאתר מאפשר מחקרים נוספים על ההשפעות המכניסטיות וההשפעות במורד הזרם של שינויים חמצוניים הפיכים28. שימוש בתהליך עבודה זה סיפק תובנה לגבי ההשפעות הפיזיולוגיות של חמצון ציסטאין הפיך ביחס לאירועים פיזיולוגיים נורמליים כגון הזדקנות, שבהם רמות ה- SSG היו שונות ביחס לגיל. השפעות ההזדקנות על SSG התהפכו חלקית באמצעות SS-31 (אלמיפרטיד), פפטיד חדש המשפר את תפקוד המיטוכונדריה ומפחית את רמות ה-SSG בעכברים מבוגרים, מה שגורם להם להיות בעלי פרופיל SSG דומה יותר לעכברים צעירים29.

הודגם כי תנאים פתופיזיולוגיים המיוחסים לחשיפה לננו-חלקיקים מערבים SSG במודל מקרופאגים של עכברים. באמצעות RAC בשילוב עם ספקטרומטריית מסות, החוקרים הראו כי רמות SSG היו בקורלציה ישירה למידת העקה החמצונית ולפגיעה בתפקוד הפאגוציטי של מקרופאגים. הנתונים גם חשפו הבדלים ספציפיים למסלול בתגובה לננו-חומרים מהונדסים שונים הגורמים לדרגות שונות של עקה חמצונית30. השיטה הוכיחה את תועלתה גם במינים פרוקריוטים, שם היא יושמה כדי לחקור את ההשפעות של מחזורים יומיים בציאנובקטריה פוטוסינתטית ביחס לחמצון תיול. נצפו שינויים נרחבים בחמצון תיול במספר תהליכים ביולוגיים מרכזיים, כולל הובלת אלקטרונים, קיבוע פחמן וגליקוליזה. יתר על כן, באמצעות אימות אורתוגונלי, מספר אתרים פונקציונליים מרכזיים אושרו לשינוי, מה שמרמז על תפקידים רגולטוריים של שינויים חמצוניים אלה6.

במאמר זה נתאר את הפרטים של זרימת עבודה מתוקננת (איור 1), המדגימה את התועלת של גישת RAC להעשרת סך כל תיולי ציסטאין מחומצנים של חלבונים ואת התיוג והכימות הסטויכיומטרי שלהם לאחר מכן. תהליך עבודה זה יושם במחקרים של מצב חמצון-חיזור בסוגי דגימות שונים, כולל תרביות תאים27,30 ורקמות שלמות (למשל, שרירי שלד, לב, ריאות)29,31,32,33. למרות שאינו כלול כאן, פרוטוקול RAC מותאם בקלות גם לחקירה של צורות ספציפיות של שינויי חמצון-חיזור הפיכים, כולל SSG, SNO ו-S-acylation, כפי שצוין קודם לכן25,29,34.

Protocol

כל ההליכים המתוארים בפרוטוקול הנוגעים לדגימות/רקמות של בעלי חיים או בני אדם אושרו על ידי ועדת האתיקה למחקר בבני אדם ובבעלי חיים ופעלו על פיה.

1. הומוגניזציה/תזה לדוגמה

  1. דגימות רקמה קפואות
    1. טחינה של רקמה קפואה (~ 30 מ"ג) על מיקרוסקופ זכוכית להחליק על קרח יבש באמצעות סכין גילוח ומלקחיים מראש. מעבירים את הרקמה הטחונה לצינור פוליסטירן בעל תחתית עגולה של 5 מ"ל המכיל 700 μL של חיץ A (ראו טבלה 1) ודוגרים על קרח למשך 30 דקות, מוגנים מפני אור.
    2. לשבש את הרקמה במשך 30 שניות או עד הומוגניות לחלוטין עם הומוגנייזר רקמה ידנית. מניחים את הדגימות על קרח ומניחים לקצף לשקוע עוד 10 דקות.
      הערה: יריעת אפייה מאלומיניום המונחת על קרח יבש מספקת משטח עבודה יציב ופלטפורמה לעיבוד/הטחינה הראשונית של הרקמה.
  2. לחלופין, השתמש בתרביות תאים דביקות במנות תרבית 100 מ"מ כחומר המוצא.
    1. שמור את התאים על קרח והשתמש פיפטה סרולוגית כדי לשטוף את התאים פעמיים עם 10 מ"ל של PBS קר כקרח המכיל 100 mM NEM.
    2. Lyse את התאים על ידי הוספת 1 מ"ל של הומוגניזציה קרה / חיץ lysis וגירוד נמרץ עם מגרד תאים קשיח. העבר את הליזאט לצינור צנטריפוגה של 2 מ"ל באמצעות מיקרופיפט.
      הערה: ניתן לשנות את קנה המידה של מאגר השטיפה ומאגר התסיסה בהתאם לכלי תרבות בגדלים שונים. בדרך כלל, 2-5 מיליון תאים נדרשים; עם זאת, זה משתנה בהתאם ליעילות התזה ולתפוקת החלבון עבור סוגי תאים ספציפיים. ניתן להכין מאגר הומוגניזציה ללא NEM לדגימות המנותחות עבור סך כל התיולים.
  3. העבר את ההומוגנט המתקבל (שלב 1.1.2 או 1.2.2) לצינור צנטריפוגה של 2 מ"ל באמצעות מיקרופיפט, וצנטריפוגה במהירות מלאה (≥16,000 × גרם) ב-4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  4. מעבירים את הסופר-נאטנט (~700 μL או ~1 מ"ל לתרבית תאים) באמצעות מיקרופיפט לצינור מיקרוצנטריפוגה חרוטי של 5 מ"ל ודוגרים במשך 30 דקות ב-55 מעלות צלזיוס בחושך עם רעידות ב-850 סל"ד.
  5. באמצעות פיפטה סרולוגית זכוכית, להוסיף 4 מ"ל של אצטון קר כקרח לדגימות ולדגירה ב -20 מעלות צלזיוס למשך הלילה עבור משקעים של חלבון והסרת עודף N-ethylmaleimide.

2. לכידה בסיוע שרף

  1. יש לשטוף את כדורי החלבון המואצים פעמיים באצטון על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה של 20,500 × גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, תוך נטרול האצטון, הסרת כל האצטון שנותר באמצעות מיקרופיפטה והוספת 3 מ"ל של אצטון טרי וקר כקרח באמצעות פיפטה סרולוגית מזכוכית. הפוך מספר פעמים כדי לערבב. לאחר השטיפה השנייה, אפשרו לכופתיות להתייבש באוויר במשך 1-2 דקות, היזהרו שלא להתייבש יתר על המידה מכיוון שחידוש עלול להיות קשה.
  2. באמצעות מיקרו-פיפטה, הוסיפו 1 מ"ל של חיץ B (ראו טבלה 1) והסגירו את החלבון באמצעות סוניקציה חוזרת במשך 15-30 שניות בכל פעם באמצעות סוניק אמבטיה עם תפוקה של 250 W ומערבולת קצרה. יש למדוד את ריכוז החלבון באמצעות בדיקת חומצה ביסיצ'ונינית (BCA) בהתאם לפרוטוקול היצרן.
  3. כדי לתקנן את ריכוזי החלבון על פני דגימות לעיבוד נוסף ולהבטיח הסרה מלאה של NEM, העבר 500 מיקרוגרם חלבון למסנן צנטריפוגלי של 0.5 מ"ל 10 kDa באמצעות מיקרופיפטה והתאם לנפח סופי של 500 μL עם חיץ resuspension.
  4. צנטריפוגה ב-14,000 × גרם בטמפרטורת החדר עד שהנפח במסנן הצנטריפוגלי קטן מ-100 μL. אסוף את הדגימות על ידי היפוך המסנן בצינור איסוף. צנטריפוגה בנפח 1,000 × גרם למשך 2 דקות והתכווננה לנפח סופי של 500 μL באמצעות מאגר C (ראה טבלה 1).
  5. הפחת את תיול החלבון על ידי הוספת 20 μL של 500 mM dithiothreitol (DTT) באמצעות מיקרופיפט לריכוז סופי של 20 mM ודגירה של הדגימות במשך 30 דקות ב 37 °C תוך ניעור ב 850 סל"ד.
  6. לאחר ההפחתה, העבירו את הדגימות באמצעות מיקרופיפט ל-0.5 מ"ל 10 kDa מסננים צנטריפוגליים וצנטריפוגה למשך 15 דקות ב-14,000 × גרם בטמפרטורת החדר או עד שהנפח במסנן הצנטריפוגלי קטן מ-100 μL. הוסף חיץ D (ראה טבלה 1) כדי להגדיל את הנפח במסנן הצנטריפוגלי ל-500 μL.
    1. חזור על הצנטריפוגה והוסף 500 μL בשלב 2.6 שלוש פעמים, ולאחר הצנטריפוגה הרביעית, אסוף את הדגימות על ידי היפוך המסנן בצינור איסוף וצנטריפוגה ב 1,000 × גרם למשך 2 דקות.
  7. מדוד את ריכוז החלבון באמצעות בדיקת BCA בהתאם לפרוטוקול היצרן.
  8. במהלך חילופי חיץ אלה, הכינו את שרף התיול-זיקה על ידי שקילת כמות השרף המתאימה (30 מ"ג/דגימה) באמצעות מיקרו-איזון והעברתו לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל. לאחר מכן, באמצעות פיפטה סרולוגית, מוסיפים מים לריכוז סופי של שרף 30 מ"ג/מ"ל ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת עם תסיסה להידרציה נכונה של השרף.
    הערה: שרף הזיקה לתיול שהוזכר לעיל הופסק על ידי היצרן. תחליף אפשרי לשרף זיקה תיול זה זמין מסחרית. עם זאת, לתחליף זה יש כמעט פי 5 פחות יכולת כריכה (ראו מידע משלים). לחלופין, ניתן לסנתז את שרף הזיקה לתיול באמצעות אתילאמין הידרוכלוריד 2-(pyridyldithio) ושרף המופעל על-ידי N-הידרוקסיסוקינימיד (ראו מידע משלים).
    1. לאחר הידרציה של שרף, מניחים את עמודי הספין על סעפת ואקום ומעבירים 500 μL של שרף slurry באמצעות micropipette לכל עמודה. החל ואקום להסרת מים; חזור על שלב זה פעם אחת כדי לקבל סך של 30 מ"ג שרף לכל עמודה. לחלופין, צנטריפוגה ב-1,000 × גרם למשך 2 דקות במקום להשתמש בסעפת הוואקום לשם כך ובכל שלבי שטיפת השרף וההמלטה.
      הערה: חיתוך הקצה של קצה פיפטה 1000 μL כדי להגדיל את גודל הבור מסייע בהעברת השרף. חשוב לטרפד בין פיפטינג כדי להבטיח שהשרף יישאר תלוי וכמויות הומוגניות ושוות של שרף מועברות לכל עמודה.
    2. לשטוף את שרף על ידי הוספת 500 μL של מים ultrapure עם micropipette והחלת ואקום להסרת המים; חזור על כך 5 פעמים. לאחר מכן, יש לשטוף את השרף 5 פעמים עם 500 μL של חיץ E (ראה טבלה 1).
      הערה: לחלופין, ניתן להשתמש בצנטריפוגה בגודל 1,000 x גרם למשך 2 דקות במקום סעפת ואקום לכל שלבי השטיפה הבאים. כל שלבי ההדחה המתמשכים מבוצעים בנפח של 500 μL. בעת הוספת מאגרי שטיפה לעמוד, יש להוסיף בזהירות עם מספיק כוח כדי להשהות את השרף במלואו תוך הימנעות מהתזת ואובדן שרף; זה מאפשר שטיפה מלאה ויעילה של שרף.
  9. באמצעות מיקרופיפט, העבר 150 מיקרוגרם חלבון מכל דגימה מופחתת לצינור חדש והתאם לנפח סופי של 120 מיקרוגרם של מאגר C (ראה טבלה 1). מעבירים את תמיסת החלבון באמצעות מיקרופיפטה לעמוד ספין מחובר המכיל את השרף, מניחים את הפקק על העמודה, ודוגרים במשך שעתיים בטמפרטורת החדר עם ניעור ב-850 סל"ד.
  10. לשטוף את שרף חמש פעמים עם 25 mM HEPES, pH 7.0; 8 M אוריאה; ואחריו חמש פעמים עם 2 M NaCl; ואחריו חמש פעמים עם 80% אצטוניטריל (ACN) עם 0.1% חומצה טריפלואורואצטית (TFA); ולבסוף חמש פעמים עם 25 mM HEPES, pH 7.7, כמתואר בשלב 2.8.2 ולהחליף את התקע.
    הערה: ניתן לפרט כאן דגימות לניתוח ברמת החלבון (לדוגמה, אלקטרופורזה של ג'ל SDS-פוליאקרילאמיד (SDS-PAGE), כתם מערבי) כמתואר בשלב 4.1.

3. עיכול טריפטי על שרף ותיוג TMT

  1. הכן מספיק תמיסת טריפסין מותאמת ברמת ריצוף עבור 6-8 מיקרוגרם לדגימה על ידי הפיכתה בריכוז של 0.5 מיקרוגרם/מיקרוL במאגר C (ראה טבלה 1) כך שהנפח הסופי יאפשר לפחות 120 μL לדגימה. באמצעות מיקרופיפט, הוסף 120 μL של תמיסת טריפסין זו לדגימות ודגרה לילה ב 37 מעלות צלזיוס עם רעידות ב 850 סל"ד.
    הערה: כדי להגביר את יעילות העיכול, ניתן לכלול שלב עיכול נוסף למחרת על ידי הסרת תמיסת הטריפסין והחלפתה בתמיסה טרייה, ולהמשיך את העיכול במשך שעתיים.
  2. לשטוף את שרף חמש פעמים עם 25 mM HEPES, pH 7.0; ואחריו חמש פעמים 2 M NaCl; ואחריו חמש פעמים עם 80% ACN עם 0.1% TFA; ואחריו שלוש פעמים עם 25 mM HEPES, pH 7.7. לבסוף, לשטוף את השרף פעמיים עם 50 mM טריאתיל אמוניום ביקרבונט בופר (TEAB) ולהחליף את התקע.
  3. הכינו ריאגנטים לתיוג TMT בכך שתאפשרו להם להתחמם לטמפרטורת החדר לפני שתסתחררו לזמן קצר באמצעות צנטריפוגה במשקל 16,000 × גרם. הוסף 150 μL של ACN נטול מים לכל בקבוקון של מגיב תיוג TMT באמצעות מיקרופיפט. דגירה של הבקבוקונים בטמפרטורת החדר על תרמומיקסר שנקבע ל-850 סל"ד למשך 5 דקות כדי לבודד את המגיב לחלוטין. מערבלים לזמן קצר ומסתובבים ב-16,000 × גרם כדי לאסוף את המגב.
  4. באמצעות מיקרופיפט, הוסיפו 40 μL של 100 mM TEAB לשרף השטוף, ולאחר מכן הוסיפו 70 μL של מגיב TMT מומס ודגרה במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר עם ניעור ב-850 סל"ד. אחסן את כל מגיבי TMT שנותרו בטמפרטורה של -80 °C.
    הערה: שימו לב לתוויות TMT הנפרדות המוקצות לכל דגימה ביולוגית (איור 1).
  5. שטפו את השרף חמש פעמים עם 80% ACN עם 0.1% TFA, שלוש פעמים עם חיץ אמוניום ביקרבונט של 100 mM (ABC), pH 8.0, ופעמיים במים כפי שתואר קודם לכן והחליפו את התקע.

4. אלוטיון פפטידי

  1. שדרגו את הפפטידים המסומנים על ידי הוספת 100 μL של 20 mM DTT ב-100 mM ABC, pH 8.0, לכל עמודה באמצעות מיקרופיפטה ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות על תרמומיקסר שנקבע ל-850 סל"ד.
    הערה: לאחר הוספת DTT, השרף יתגבש. ניתן לשבש את השרף בעזרת קצה פיפטה כדי לשבור גושים ולהבטיח את החמקמקות המלאה של הפפטידים.
  2. לאחר דגירה זו, הניחו את העמודה על סעפת ואקום המיועדת למיצוי פאזה מוצקה (SPE), מרחו ואקום, והכניסו את הדגימות לצינור מיקרוצנטריפוגה של 5 מ"ל. חזור על שלב זה פעם אחת.
  3. לבסוף, הוסיפו 100 μL של 80% ACN עם 0.1% TFA, דגרו במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, והתחמקו לאותו צינור צנטריפוגה של 5 מ"ל. לאסוף את כל השברים באותו צינור microcentrifuge 5 מ"ל.
    הערה: כדי למנוע אובדן דגימה, יש להשתמש בצינורות קשירה נמוכים לצורך חילוט, ויש לשמור נפחים בנפח של 4.0 מ"ל או מתחת לצינור יחיד של 5 מ"ל.
  4. מניחים את הדגימות המלוטשות ברכז ואקום עד לייבוש. יש לאחסן את הפפטידים היבשים בטמפרטורה של -80°C ולהשהות אותם מאוחר יותר.
    הערה: דגימות עשויות גם להיות eluted בנפרד, ו aliquot עשוי להיות מוסר ומנותח על ידי SDS-PAGE לניתוח ברמת הפפטיד לפני שילוב הדגימות.

5. אלקילציה פפטידית והתפלה/ניקוי

  1. השהה את הפפטידים המיובשים על ידי הוספת נפח קטן של 100 mM ABC buffer, pH 8.0 (לא יותר מ 500 μL), באמצעות micropipette. השתמש סוניקציה חוזרת במשך 15-30 שניות בכל פעם באמצעות סוניק אמבטיה עם פלט של 250 W ומערבולת כדי solubilize ולהעביר צינור 2 מ"ל.
    הערה: הנפח של 100 mM ABC, pH 8.0 שיש להוסיף מבוסס על אמצעי האחסון הדרוש כדי להשעות מחדש את ה- DTT בעוצמה של 150 mM. המשתמשים יצטרכו לקבוע את כמות ה- DTT הקיימת במדגם שלהם בהתבסס על מה שנוסף במקור בשלב 4.1.
  2. הוסף מספיק תמיסת מלאי מרוכזת (600 mM) של יודואצטמיד (IAA) מומס ב- ABC באמצעות מיקרופיפט כדי להשיג יחס טוחנות של 1:4 של DTT:IAA ודגירה של הדגימות ב- RT למשך שעה אחת עם רעידות ב- 850 סל"ד.
  3. יש לחמצן את הדגימות ל-pH < 3 על ידי הוספת TFA מרוכז (10%) באמצעות מיקרופיפט ולבצע התפלת דגימות באמצעות ניקוי בפאזה הפוכה בהתאם להוראות היצרן.
  4. הניחו את הפפטידים הנקיים ברכז ואקום עד לייבוש. יש לאחסן את הפפטידים היבשים בטמפרטורה של -80°C עד לניתוח נוסף.

6. ספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיה נוזלית-טנדם

  1. השהה את הפפטידים המיובשים על ידי סוניקציה חוזרת במשך 15-30 שניות בכל פעם באמצעות סוניק אמבטיה עם תפוקה של 250 W ומערבולת ב 20-40 μL של מים המכילים 3% ACN. קבע את ריכוז הפפטידים על ידי ביצוע בדיקת BCA בהתאם לפרוטוקול היצרן.
  2. הפרד את הדגימות על-ידי LC בפאזה הפוכה ו-MS/MS כפי שתואר קודםלכן 6 והקלט את ספקטרום MS1 בטווח m/z של 400-2000. ודא שדיסוציאציה התנגשותית באנרגיה גבוהה (HCD) מנוצלת כדי לקבל מידע על עוצמת היונים המדווחים לניתוח של פפטידים המסומנים באופן איזוברי. עיין בסעיפי השיטות של דוחות קודמים לקבלת פרטים נוספים אודות תנאי הפעלת מכשירים 27,30 וניתוח נתוני MS27,31.
    הערה: ניתן להשתמש במערכות או בהגדרות LC-MS/MS שונות כדי לנתח את דגימות הפפטידים. הכיסוי והרגישות של זיהוי פפטידים יהיו תלויים במערכת ובהגדרות המסוימות שבהן נעשה שימוש.

תוצאות

השלמת הפרוטוקול תביא להעשרה ספציפית ביותר של פפטידים המכילים ציסטאין שחומצנו בעבר, לעתים קרובות עם ספציפיותשל >95% 27,35,36. עם זאת, מספר שלבים מרכזיים בפרוטוקול דורשים תשומת לב מיוחדת, למשל, חסימה ראשונית של תיולים חופשיים לפני ליזיס דגימה / ה...

Discussion

לכידה בסיוע שרף שימשה במגוון סוגי דגימות ומערכות ביולוגיות לחקר שינויים חמצוניים של שאריות ציסטאין25,29,30. שיטה זו מאפשרת הערכה של דגימות ברמות וקריאות מרובות, כולל חלבונים ופפטידים באמצעות SDS-PAGE וניתוח כתמים מערביים, כמו גם אתרי ציסטאין ב?...

Disclosures

המחברים מצהירים על היעדר ניגוד עניינים, כספי או אחר.

Acknowledgements

חלקים מהעבודה נתמכו על ידי מענקי NIH R01 DK122160, R01 HL139335 ו- U24 DK112349

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2-(Pyridyldithio)ethylamine hydrochlorideMed Chem ExpressHY-101794Reagent for in-house resin synthesis
2.0 mL LoBind centrifuge tubesEppendorf22431048
5.0 mL LoBind centrifuge tubesEppendorf30108310
5.0 mL round bottom tubesFalcon352054
AcetoneFisher ScientificA949-1
AcetonitrileSigma Aldrich34998
Activated Thiol–Sepharose 4BSigma AldrichT8512Potential replacement for thiol-affinity resin
Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filterMillipore SigmaUFC5010BK
Ammonium bicarbonateSigma Aldrich09830
Bicinchonicic acid (BCA)Thermo Scientific23227Protein Assay Reagent
CentrifugeEppendorf5810R
CentrifugeEppendorf5415R
Dithiothreitol (DTT)Thermo Scientific20291
EDTASigma AldrichE5134
HEPES bufferSigma AldrichH4034
HomogenizerBioSpec Products985370
Iodoacetimide (IAA)Sigma AldrichI1149
N-ethylmaleimideSigma Aldrich4259
NHS-Activated Sepharose 4 Fast FlowCytiva17-0906-01Reagent for in-house resin synthesis
QIAvac 24 Plus vacuum manifoldQiagen19413
Sodium chlorideSigma AldrichS3014
Sodium dodecyl sulfate (SDS)Sigma AldrichL6026
SonicatorBranson1510R-MT
Spin columnsThermo Scientific69705
Strata C18-E reverse phase columnsPhenomenex8B-S001-DAKPeptide desalting
ThermomixerEppendorf5355
Thiopropyl Sepharose 6BGE Healthcare17-0420-01Thiol-affinity resin; *Production of Thiopropyl Sepharose 6B resin has been discontinued by the manufacturer (see protocol for details).
TMT isobaric labels (16 plex)Thermo ScientificA44522Peptide labeling reagent; available in multiple formats
Triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB)Sigma AldrichT7408
Trifluoroacetic acid (TFA)Sigma AldrichT6508
Triton X-100Sigma AldrichT8787
TrypsinPromegaV5820
UreaSigma AldrichU5378
Vacufuge Plus speedvacEppendorf22820001vacuum concentrator
Vortex mixerScientific IndustriesSI-0236

References

  1. Sies, H., Jones, D. P. Reactive oxygen species (ROS) as pleiotropic physiological signalling agents. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (7), 363-383 (2020).
  2. Adams, L., Franco, M. C., Estevez, A. G. Reactive nitrogen species in cellular signaling. Experimental Biology and Medicine. 240 (6), 711-717 (2015).
  3. Olson, K. R. The biological legacy of sulfur: A roadmap to the future. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 252, 110824 (2021).
  4. Sies, H. Oxidative eustress: on constant alert for redox homeostasis. Redox Biology. 41, 101867 (2021).
  5. Poole, L. B. The basics of thiols and cysteines in redox biology and chemistry. Free Radical Biology & Medicine. 80, 148-157 (2015).
  6. Guo, J., et al. Proteome-wide light/dark modulation of thiol oxidation in cyanobacteria revealed by quantitative site-specific redox proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (12), 3270-3285 (2014).
  7. Shi, X., Qiu, H. Post-translational S-nitrosylation of proteins in regulating cardiac oxidative stress. Antioxidants. 9 (11), 1051 (2020).
  8. Fra, A., Yoboue, E. D., Sitia, R. Cysteines as redox molecular switches and targets of disease. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 167 (2017).
  9. Klomsiri, C., Karplus, P. A., Poole, L. B. Cysteine-based redox switches in enzymes. Antioxidants & Redox Signaling. 14 (6), 1065-1077 (2011).
  10. Go, Y. M., Jones, D. P. The redox proteome. Journal of Biological Chemistry. 288 (37), 26512-26520 (2013).
  11. Bak, D. W., Bechtel, T. J., Falco, J. A., Weerapana, E. Cysteine reactivity across the subcellular universe. Current Opinion in Chemical Biology. 48, 96-105 (2019).
  12. Skryhan, K., et al. The role of cysteine residues in redox regulation and protein stability of Arabidopsis thaliana starch synthase 1. PLoS One. 10 (9), 0136997 (2015).
  13. Su, Z., et al. Global redox proteome and phosphoproteome analysis reveals redox switch in Akt. Nature Communications. 10 (1), 5486 (2019).
  14. Liebthal, M., Schuetze, J., Dreyer, A., Mock, H. -. P., Dietz, K. -. J. Redox conformation-specific protein-protein interactions of the 2-cysteine peroxiredoxin in Arabidopsis. Antioxidants. 9 (6), 515 (2020).
  15. Pace, N. J., Weerapana, E. Zinc-binding cysteines: diverse functions and structural motifs. Biomolecules. 4 (2), 419-434 (2014).
  16. Schwartz, P. A., et al. Covalent EGFR inhibitor analysis reveals importance of reversible interactions to potency and mechanisms of drug resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (1), 173 (2014).
  17. Sevilla, E., Bes, M. T., González, A., Peleato, M. L., Fillat, M. F. Redox-based transcriptional regulation in prokaryotes: revisiting model mechanisms. Antioxidants & Redox Signaling. 30 (13), 1651-1696 (2018).
  18. Topf, U., et al. Quantitative proteomics identifies redox switches for global translation modulation by mitochondrially produced reactive oxygen species. Nature Communications. 9 (1), 324 (2018).
  19. Gao, X. -. H., et al. Discovery of a redox thiol switch: implications for cellular energy metabolism. Molecular & Cellular Proteomics. 19 (5), 852-870 (2020).
  20. Prus, G., Hoegl, A., Weinert, B. T., Choudhary, C. Analysis and interpretation of protein post-translational modification site stoichiometry. Trends in Biochemical Sciences. 44 (11), 943-960 (2019).
  21. Zhang, T., Gaffrey, M. J., Li, X., Qian, W. J. Characterization of cellular oxidative stress response by stoichiometric redox proteomics. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 320 (2), 182-194 (2021).
  22. Jaffrey, S. R., Erdjument-Bromage, H., Ferris, C. D., Tempst, P., Snyder, S. H. Protein S-nitrosylation: a physiological signal for neuronal nitric oxide. Nature Cell Biology. 3 (2), 193-197 (2001).
  23. Alcock, L. J., Perkins, M. V., Chalker, J. M. Chemical methods for mapping cysteine oxidation. Chemical Society Reviews. 47 (1), 231-268 (2018).
  24. Li, R., Kast, J. Biotin switch assays for quantitation of reversible cysteine oxidation. Methods in Enzymology. 585, 269-284 (2017).
  25. Guo, J., et al. Resin-assisted enrichment of thiols as a general strategy for proteomic profiling of cysteine-based reversible modifications. Nature Protocols. 9 (1), 64-75 (2014).
  26. Liu, T., et al. High-throughput comparative proteome analysis using a quantitative cysteinyl-peptide enrichment technology. Analytical Chemistry. 76 (18), 5345-5353 (2004).
  27. Duan, J., et al. Stochiometric quantification of the thiol redox proteome of macrophages reveals subcellular compartmentalization and susceptibility to oxidative perturbations. Redox Biology. 36, 101649 (2020).
  28. Mitchell, A. R., et al. Redox regulation of pyruvate kinase M2 by cysteine oxidation and S-nitrosation. Biochemical Journal. 475 (20), 3275-3291 (2018).
  29. Campbell, M. D., et al. Improving mitochondrial function with SS-31 reverses age-related redox stress and improves exercise tolerance in aged mice. Free Radical Biology & Medicine. 134, 268-281 (2019).
  30. Duan, J., et al. Quantitative profiling of protein S-glutathionylation reveals redox-dependent regulation of macrophage function during nanoparticle-induced oxidative stress. ACS Nano. 10 (1), 524-538 (2016).
  31. Wang, J., et al. Protein thiol oxidation in the rat lung following e-cigarette exposure. Redox Biology. 37, 101758 (2020).
  32. Kramer, P. A., et al. Fatiguing contractions increase protein S-glutathionylation occupancy in mouse skeletal muscle. Redox Biology. 17, 367-376 (2018).
  33. Chiao, Y. A., et al. Late-life restoration of mitochondrial function reverses cardiac dysfunction in old mice. Elife. 9, 55513 (2020).
  34. Forrester, M. T., et al. Site-specific analysis of protein S-acylation by resin-assisted capture. Journal of Lipid Research. 52 (2), 393-398 (2011).
  35. Su, D., et al. Quantitative site-specific reactivity profiling of S-nitrosylation in mouse skeletal muscle using cysteinyl peptide enrichment coupled with mass spectrometry. Free Radical Biology & Medicine. 57, 68-78 (2013).
  36. Su, D., et al. Proteomic identification and quantification of S-glutathionylation in mouse macrophages using resin-assisted enrichment and isobaric labeling. Free Radical Biology & Medicine. 67, 460-470 (2014).
  37. Searle, B. C., Yergey, A. L. An efficient solution for resolving iTRAQ and TMT channel cross-talk. Journal of Mass Spectrometry. 55 (8), 4354 (2020).
  38. Duan, J., Gaffrey, M. J., Qian, W. J. Quantitative proteomic characterization of redox-dependent post-translational modifications on protein cysteines. Molecular BioSystems. 13 (5), 816-829 (2017).
  39. Behring, J. B., et al. Spatial and temporal alterations in protein structure by EGF regulate cryptic cysteine oxidation. Science Signaling. 13 (615), 7315 (2020).
  40. Shakir, S., Vinh, J., Chiappetta, G. Quantitative analysis of the cysteine redoxome by iodoacetyl tandem mass tags. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (15), 3821-3830 (2017).
  41. Gorin, G., Martic, P. A., Doughty, G. Kinetics of the reaction of N-ethylmaleimide with cysteine and some congeners. Archives of Biochemistry and Biophysics. 115 (3), 593-597 (1966).
  42. Hsu, M. -. F., et al. Distinct effects of N-ethylmaleimide on formyl peptide- and cyclopiazonic acid-induced Ca2+ signals through thiol modification in neutrophils. Biochemical Pharmacology. 70 (9), 1320-1329 (2005).
  43. Li, R., Huang, J., Kast, J. Identification of total reversible cysteine oxidation in an atherosclerosis model using a modified biotin switch assay. Journal of Proteome Research. 14 (5), 2026-2035 (2015).
  44. Wang, J., et al. Integrated dissection of cysteine oxidative post-translational modification proteome during cardiac hypertrophy. Journal of Proteome Research. 17 (12), 4243-4257 (2018).
  45. Patra, K. K., Bhattacharya, A., Bhattacharya, S. Molecular dynamics investigation of a redox switch in the anti-HIV protein SAMHD1. Proteins. 87 (9), 748-759 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

172RACTMTPTM

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved