通过BiFC-FRET-FLIM测定MADS盒转录因子和钙传感器蛋白两种单体之间的三方相互作用

摘要

在这里，我们提出了一种通过基于BiFC的FRET-FLIM测定使用荧光标记蛋白可视化三元复合物形成的方法。该方法对于研究 体内蛋白质 - 蛋白质相互作用复合物很有价值。

摘要

蛋白质 - 蛋白质相互作用是细胞中所有生物过程的组成部分，因为它们在调节，维持和修改细胞功能方面起着至关重要的作用。这些相互作用涉及广泛的现象，如信号转导，病原体反应，细胞 - 细胞相互作用，代谢和发育过程。在转录因子的情况下，这些相互作用可能导致亚基的寡聚化，在特定的亚细胞环境中隔离，如细胞核，细胞质等，这反过来又可能对下游基因的表达产生更深远的影响。在这里，我们展示了一种使用基于双分子荧光互补（BiFC）的Förster共振能量转移（FRET）可视化 体内 三方相互作用的方法，涉及荧光寿命成像（FLIM）。为本演示选择的两种蛋白质作为BiFC伙伴相互作用，并且它们重建的荧光活性用于与第三个伙伴测定FRET-FLIM。四到五周龄的生长室生长的 Nicotiana benthamiana 植物已被用作该演示的示范植物系统。

引言

蛋白质 - 蛋白质相互作用（PPI）通过调节各种代谢和发育过程，构成了真核细胞正常运作的基础。一些PPI是稳定的，而另一些则是瞬态的。相互作用可以根据相互作用中成员的数量和类型进行分类，例如二聚体，三聚体，四聚体同聚体和异构体^1。蛋白质相互作用的鉴定和表征可能导致对蛋白质功能和调节网络的更好理解。

转录因子是参与调节功能的蛋白质。它们通过与DNA结合来调节其下游基因的转录速率。有时蛋白质低聚或形成高阶复合物是执行其功能的先决条件^2。植物MADS盒转录因子是同源基因，调节各种过程，如花移，花器官发育，受精，种子发育，衰老和营养发育。已知它们形成与DNA^3，4结合的高阶复合物。研究转录因子及其相互作用者之间的PPI网络可以深入了解转录调控的复杂性。

Nicotiana benthamiana中的瞬时蛋白表达一直是研究体内蛋白质定位或蛋白质 - 蛋白质相互作用的流行方法^5。BiFC和FRET是使用荧光报告系统6在体内研究蛋白质 - 蛋白质相互作用^的方法。这两种技术的组合已被证明可以揭示三种蛋白质之间的相互作用^7。使用受体光漂白，敏化发射和荧光寿命成像（FLIM）技术测量FRET。基于FLIM的FRET测定已成为一种工具，可以根据其荧光寿命为两个分子之间的能量转移测量提供准确的定量和时空特异性⁸。FLIM测量荧光团在发射光子之前保持激发态的时间，并且比仅使用强度测量的技术更好^9，10。除了异源系统，如Nicotiana benthamiana和洋葱表皮皮，最近的报告已经证明使用拟南芥根和年轻的水稻幼苗等，在天然条件下进行蛋白质 - 蛋白质相互作用的体内分析11，12。

除了合适的表达系统外，选择用于BiFC和FRET测定的相互作用伙伴对于该实验的成功也至关重要。在使用FRET实验¹³中的共轭伙伴之前，应使用适当的对照来验证BiFC配置中使用的伙伴之间的PPI。BiFC利用荧光蛋白的N端和C端部分的结构互补。BiFC测定中使用的大多数（如果不是全部）荧光蛋白的一个共同限制是两个衍生的非荧光片段之间的自组装，导致假阳性荧光并降低信噪比（S /^N）14。最近的发展，包括点突变或分裂荧光蛋白的位置，已经产生了具有更高强度，更高特异性，高S / N比^15，16的BiFC对。这些荧光蛋白也可用于进行BiFC，具体取决于实验的适用性。

传统上，CFP和YFP在FRET实验¹⁷中被用作供体和受体对。然而，YFP或m-Citrine被发现是更好的FRET供体（当与RFP一起使用时作为受体使用时），因为在 拟南芥 根系中靶蛋白的天然表达过程中具有高量子产率（QY）。启动子（本构与天然/内源性）和荧光团的选择在设计成功的BiFC-FRET-FLIM实验中也起着至关重要的作用。必须注意的是，FRET供体的效率和FRET对的适宜性往往随着启动子和用于表达的生物系统的变化而变化。荧光团的QY与其亮度有关，取决于pH值，温度和使用的生物系统。我们建议在为FRET实验选择荧光团对之前彻底考虑这些标准。用于该方案的生物系统，启动子和蛋白质与CFP-YFP荧光团一起用于BiFC FRET-FLIM实验。

在本研究中，我们结合FLIM的特征，使用基于BiFC的FRET可视化三个蛋白质分子之间的相互作用。在该技术中，两种蛋白质用分裂的YFP蛋白标记，第三种蛋白质用CFP标记。由于我们有兴趣研究MADS盒蛋白（M）同源二聚体与钙传感器蛋白（C）的相互作用，因此这些蛋白在pSITE-1CA和pSITE-3CA载体¹⁸中用荧光蛋白标记。在该测定中，两个相互作用的伙伴在pSPYNE-35S和pSPYCE-35S载体¹⁹中用YFP的N端和C端部分标记，它们的相互作用导致功能YFP的重建，该功能YFP作为FRET受体到第三个相互作用伙伴，其用CFP标记（作为FRET供体）（图1）).在这种特殊情况下，两个M单体之间以及M和C之间的PPI已经通过在三个不同的系统中执行BiFC以及酵母双杂交系统进行了验证。这些载体通过电穿孔动员成 农杆菌Tumifaciens GV3101菌株。GV3101菌株具有解除武装的Ti质粒pMP90（pTiC58DT-DNA），具有庆大霉素耐药性^20。将p19 农杆菌 菌株与所有浸润一起加入，以防止转基因沉默^21。我们建议这三种蛋白质也应该以相反的构象使用，以验证三方相互作用。

在该技术中，我们采用了FLIM，其中首先，在没有受体的情况下测量供体的荧光寿命（未淬灭的供体寿命）。之后，在受体存在的情况下测量其寿命（淬灭供体寿命）。供体荧光寿命的这种差异用于计算FRET效率，这取决于荧光寿命缩短的光子数量。下面提到的是一个详细的方案，通过瞬时表达 Nicotiana benthamiana 中的荧光标记蛋白并通过BiFC-FRET-FLIM测定它们的相互作用来确定任何三元复合物之间三元复合物的形成。

研究方案

1. 入口和目的地载体中的基因克隆（图2）

1. 通过PCR扩增目标基因（我们的例子中为M和C基因）的编码序列（CDS），并将其克隆到适当的入口载体（例如，pENTR / D-TOPO载体;有关本实验中使用的向量，请参见表1）。
2. 在含有抗生素的平板上培养克隆。通过限制性消化和DNA测序验证在抗生素上选择的克隆^22，23。
3. 将重组的CDS从入口克隆动员到目标载体（pSPYNE-35S，pSPYCE-35S，pSITE-1CA和pSITE-3CA），并通过限制性内切酶消化确认序列从入口到目标载体的转移。
   注:本实验中使用的所有载体均列于 表1中。
4. 最后，通过电穿孔将农杆菌GV3101（pMP90（Gent^R））细胞与目标载体（图3）24。

2. 边莲 植物的生长条件

注意:在控制条件下将 尼古丁植物 种植至4-6叶。

1. 要种植 Nicotiana 植物，通过将市售的土壤混合物与cocopeat和堆肥以2:1:1的比例混合来制备土壤混合物。
2. 在塑料托盘中铺上一层1英寸厚的这种土壤混合物，制成土床并用去离子水浸透。在这个土床上撒上大约200颗种子。
3. 将其转移到装有1厘米积水的较大托盘中。用保鲜膜盖住此托盘以形成防潮室。
4. 将此装置转移到23°C的生长室中，16小时光照和8小时黑暗循环，光强度为150-170μmol/ m²s。
5. 两周后，将幼苗转移到含有水饱和土壤混合物的3-4英寸小花盆中。
6. 将这些花盆放在塑料托盘中，然后将它们转移到生长室中四周。

3. 准备用于农业渗透的细菌菌株

注意:对于农业渗透，细菌菌株需要新鲜传代培养，并以适当的比例与p19农药菌株混合。

1. 制备含有利福平（100μg/ mL），庆大霉素（25μg/ mL）和卡那霉素（50μg/ mL）的2xYT琼脂平板，用于含有pSPYNE-35S和psPYCE-35S载体的农杆菌。对于含有pSITE载体的菌株，使用利福平（100μg/ mL），庆大霉素（25μg/ mL）和大观霉素（50μg/ mL）。
2. 在层流罩中使用无菌接种环对含有这些板上质粒的农杆菌菌株进行条纹。
3. 在黑暗中在28°C下孵育48小时。
4. 通过接种含有适当抗生素（利福平（100μg/ mL），庆大霉素（25μg/ mL），卡那霉素（50μg/ mL））的10 mL2xYT肉汤中的条纹板中接种含有BiFC和FRET构建体的 农杆菌 GV3101菌株（在psPYNE-35S，pSPYCE-35S和pSITE载体中制备）来开始该过程。
5. 此外，通过接种10mL含有利福平（100μg/ mL）和卡那霉素（50μg/ mL）的2xYT肉汤来启动p19农杆菌菌株的培养。
   注意:添加p19菌株以防止转基因沉默。
6. 用铝箔盖住烧瓶，并将其保持在28°C和170rpm的培养箱振荡器中，在黑暗中保持16小时。
7. 过夜生长后，将1mL该培养物转移到一次性比色皿中，以使用分光光度计测量培养物在600nm处的光密度（O.D.）。
8. 混合含有菌株的适当BiFC和FRET伴侣的培养物，使每种培养物的最终外径为0.5，p19的外径为0.3，总体积为2mL。
9. 要达到这些比率，请使用下面提到的公式:
   
   _获得的外径 = 在 600 nm 下测得的培养物的外径
   V_培养 物 = 所需培养物的体积
   _最终OD = 0.5（对于构造）和 0.3（对于 p19）
   V_final = 浸润的最终体积，即 2 mL
   注:本研究中使用的结构组合在 表2中指定。
10. 在室温下以3，000×g离心混合的农杆菌培养物5分钟，并小心地丢弃上清液。将沉淀重悬于2mL新鲜制备的浸润缓冲液（10mM MES，100μM乙酰丝丁酮和10mMMgCl_2）中。使用涡流混合器制成均质的细胞悬浮液。
11. 将含有重悬细胞的管子在室温下在黑暗中孵育3小时。
12. 同时，在每个花盆上贴上将要渗透的构造混合物。对每种渗透混合物使用两个设备。
13. 将1 mL无针注射器与农用细菌混合物填充。轻轻但牢固地将注射器压在完全膨胀的叶子的轴侧，同时从另一侧支撑叶子。轻轻推动柱塞，直到溶液在叶子区域填满，相当于注射器尖端的2-3倍。
14. 每株植物最多浸润一片叶子上的四个斑点和3-4片叶子，如图 4所示。
    注意:更换手套或在样品之间用70%酒精擦拭手套，以防止交叉污染。
15. 将所有花盆转移到托盘中，并在步骤2中提到的相同条件下在生长室中孵育。
16. 使用荧光显微镜在不同时间点检查农业渗透叶片的一小部分。当来自YFP和CFP的荧光在细胞中都可以检测到时，继续进行共聚焦显微镜进行BiFC-FRET FLIM测定。在该实验中，分析是在农业渗透后3天进行的。
    注意:为每个启动子和基因组合单独设置农业渗透后孵育期，以避免BiFC-FRET FLIM测定中使用的嵌合蛋白的过表达。伴侣蛋白的过表达可能导致假阳性相互作用。

4. 准备用于荧光可视化的载玻片

1. 当植物准备好可视化时，将方形叶样品切开，距离渗透伤口5-8毫米，并将其安装在干净的载玻片上的蒸馏水中。
   注意:为了尽量减少背景荧光，请用80%乙醇清洁载玻片，然后用蒸馏水清洁3-4次，风干，并将其保存在吸水片上。
2. 用干净的盖玻片覆盖叶子样品，并用指甲珐琅密封。
3. 在共聚焦激光扫描显微镜下可视化这些样品。

5. 使用共聚焦激光扫描显微镜进行FRET-FLIM分析

注意:在此过程中，确定和量化两种蛋白质之间相互作用的基础是FRET供体伴侣与受体相互作用时荧光寿命的缩短，这用于计算FRET的效率。三方相互作用的复杂性进一步增加，因为在这种情况下，FRET-受体不是单个分子，而是分裂的YFP-BiFC对，它应该首先 在体内 重组，成为功能性FRET受体荧光团。为了进行FRET-FLIM，需要确定供体分子的荧光寿命 - 首先单独使用，然后在FRET伴侣在场的情况下。

1. 在共聚焦激光扫描显微镜中打开FLIM应用程序，启动控制台并使用模式识别光子计数来测量荧光寿命。选择标准的"全光子计数"测量模式。
2. 分析来自两种类型的农业渗透植物的样品:一种仅供体（C-CFP），另一种与供体和受体（C-CFP，以及M-YFP）两者。
   注意:由于M蛋白的相互作用已经使用BiFC和Y2H与C蛋白进行了验证，因此预计这种相互作用对具有良好的FRET效率。
3. 接下来，扫描C-CFP农业浸润叶片，并聚焦于显示良好CFP荧光的细胞。启动激光扫描模式并设置系统以进行CFP可视化和FLIM测量（λ_ex 440 nm脉冲激光，λ_em 480-520 nm通过混合探测器，扫描速度512 x 512像素，400 Hz）。
4. 调整对焦、变焦和智能增益，以对焦于需要捕捉的区域。
5. 以足够的激光功率照亮样品，以实现每脉冲约0.1光子的捕获。对于具有可变荧光强度的样品，捕获50帧以收集寿命测量所需的足够光子。CFP由于其构象适应而表现出两种荧光寿命;因此，使用 n 指数重卷积模型拟合数据，同时保持 n 的值等于 2。
6. 在这些设置下，CFP 显示 1.0 和 3.2 ns 两个生存期。这里较高的3.2 ns，寿命用于所有后续计算^25，26。
7. 要使用FLIM（两种蛋白质之间相互作用程度的度量）计算FRET效率，取与C-CFP和M-YFP共渗透的叶片样品。寻找表达C-CFP和M-YFP的细胞，并使用λ_ex 440 nm脉冲激光器，λ_em 480-520 nm和λ_ex 514 nm白光激光器（λ_em 526-550 nm）激发它们，从而确认它们各自的发射模式。依次扫描并鉴定同时显示CFP和YFP荧光的细胞。
8. 确认两种蛋白质的荧光后，切换到FLIM控制台，使用我们之前用于测量C-CFP寿命的相同设置（步骤5.5）测量CFP的寿命。
   注意:该细胞还表达M-YFP，其可能与C-CFP相互作用并导致C-CFP寿命缩短。
9. 拟合使用 n 指数重卷积模型获得的图，n = 2。观察到CFP寿命从3.2 ns减少到2.6 ns，表明CFP和YFP之间的Förster共振能量转移（图5A）。
10. 现在，在软件中启动 FRET 控制台，并通过在软件中提供的等式中手动输入未淬火供体寿命来计算 FRET 效率。观察到的FRET效率为:56%。
11. 三方互动
    1. 最后，为了可视化三个伙伴之间的相互作用，从与C-CFP，M-YFPn和M-YFPc共渗透的植物中取叶样本。
    2. 扫描叶外植体，寻找同时显示两种M蛋白之间BiFC相互作用发出的CFP和重组YFP荧光的细胞。使用与之前相同的激光和发射波长。
    3. 随后，关闭 514 nm 激光器并移至 FLIM 控制台。
       注意:如果M-YFP二聚体与C-CFP相互作用，人们应该看到C-CFP在与M-YFP相互作用期间观察到的寿命缩短。然而，如果C-CFP未能与M-YFP二聚体相互作用，其荧光寿命应保持在3.2 ns。
    4. 使用上述类似设置，在存在重组的YFP的情况下测量CFP寿命。拟合使用 n 指数重卷积模型获得的图形，n = 2，然后移动到 FRET 控制台。
       注意:CFP 寿命从 3.2 ns 下降到 2.3 ns。如上所述计算 FRET 效率。计算出的 FRET 效率为 55%。供体寿命的缩短和55%的良好FRET效率证实了两种M蛋白与体内C蛋白之间的三方相互作用（见图5B）。

结果

该协议代表了研究植物 体内 三方蛋白质 - 蛋白质相互作用的优化方法。该协议的基本原理是结合两种荧光标记的蛋白质相互作用技术，即BiFC和FRET，以创建一种测定方法来测量三种蛋白质伴侣之间的三元复合物形成。在这里，我们使用FLIM来测量FRET供体伴侣在存在和不存在FRET受体的情况下的荧光寿命。如果两种蛋白质之间存在正相互作用，则预计供体的荧光寿命会缩短。我们从测量供体的...

讨论

本方案展示了使用基于BiFC的FRET-FLIM测定来确定MADS盒蛋白和钙传感器蛋白的两个单体之间形成三元络合物。该协议改编自Y. John Shyu等人的一份报告，他们开发了一种基于BiFC的FRET方法，以可视化Fos-Jun异源二聚体和NFAT或p65之间形成的三元复合物，使用敏化发射方法^7。早些时候，Galperin和同事们在2004^年29年开发了一种三荧光团FRET系统，但它需要六个滤光片，其中包...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml Syringes without needles	Dispovan	-
Acetosyringone	Sigma-Aldrich	D134406
Gateway  LR Clonase II Enzyme mix	Thermo Fischer Scientific	11791020	The vectors used in the study are Gateway based
Gentamycin Sulphate	Himedia	CMS461
Kanamycin Sulphate	Himedia	MB105
MES hydrate	Sigma-Aldrich	M2933
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670
pENTR/D-TOPO Cloning Kit	Thermo Fischer Scientific	K240020	The vectors used in the study are Gateway based
Phusion high fidelity Taq DNA polymerase	Thermo Fischer Scientific	F530-S	Any High fidelity Polymerase can work
Rifampicin	Himedia	CMS1889
SP8 FALCON Confocal laser scanning microscope	Leica	SP8 FALCON	Any CLSM with FLIM capabilities can be used for this analysis
Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate	Himedia	TC034