BiFC-FRET-FLIM Tahlilinde MADS Kutusu Transkripsiyon Faktörünün İki Monomeri ile Kalsiyum Sensör Proteini Arasındaki Üçlü Etkileşimin Belirlenmesi

Özet

Burada, BiFC tabanlı FRET-FLIM test tarafından floresan etiketli proteinler kullanarak üç protein ortağı arasındaki üçlü kompleks oluşumunu görselleştirmek için bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, protein-proteinetkileşim komplekslerini vivo olarak incelemek için değerlidir.

Özet

Protein-protein etkileşimleri hücresel fonksiyonların düzenlenmesinde, sürdürülmesinde ve değiştirilmesinde çok önemli bir rol oynadıkları için hücrelerdeki tüm biyolojik süreçlerin ayrılmaz bir parçasıdır. Bu etkileşimler sinyal transdüksiyon, patojen yanıtı, hücre-hücre etkileşimleri, metabolik ve gelişimsel süreçler gibi çok çeşitli fenomenlerde yer almaktadır. Transkripsiyon faktörleri söz konusu olduğunda, bu etkileşimler alt ünüllerin oligomerizasyonuna, çekirdek, sitoplazma vb. Burada, Floresan Ömür Boyu Görüntülemeyi (FLIM) içeren Bimoleküler Floresan Kompleasyonu (BiFC) tabanlı Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) kullanarak in vivo üçlü etkileşimi görselleştirmek için bir metodoloji sunuyoruz. Bu gösteri için seçilen proteinlerden ikisi BiFC ortağı olarak etkileşime girer ve yeniden inşa edilen floresan aktiviteleri üçüncü ortakla FRET-FLIM'i test etmek için kullanılır. Dört ila beş haftalık büyüme odası tarafından yetiştirilen Nicotiana benthamiana bitkileri bu gösteri için model bitki sistemi olarak kullanılmıştır.

Giriş

Protein-protein etkileşimleri (PPI'ler) çeşitli metabolik ve gelişimsel süreçleri düzenleyerek ökaryotik hücrelerin düzgün çalışmasının temelini oluşturur. Bazı PPI'lar kararlıdır, bazıları ise doğada geçicidir. Etkileşimler, dimerik, trimerik, tetramerik homomerik ve heteromerik¹gibi etkileşimdeki üye sayısına ve türüne göre kategorize edilebilir. Protein etkileşimlerinin tanımlanması ve karakterizasyonu, protein fonksiyonlarının ve düzenleyici ağların daha iyi anlaşılmasına neden olabilir.

Transkripsiyon faktörleri düzenleyici işlevlerde yer alan proteinlerdir. DNA'ya bağlanarak aşağı akış genlerinin transkripsiyon oranını düzenlerler. Bazen proteinler tarafından oligomerizasyon veya daha yüksek sıralı komplekslerin oluşumu, işlevlerini yerine getirmek için bir ön koşuldur². Bitki MADS kutusu transkripsiyon faktörleri çiçek geçişi, çiçek organ gelişimi, gübreleme, tohum gelişimi, senescence ve vejetatif gelişim gibi çeşitli süreçleri düzenleyen homeotik genlerdir. DNA^3,4'e bağlanan daha yüksek sıralı kompleksler oluşturdukları bilinmektedir. Transkripsiyon faktörleri ve etkileşimcileri arasında ÜFE ağlarının incelenmesi, transkripsiyonsal düzenlemenin altında kalan karmaşıklık hakkında içgörüler sağlar.

Nicotiana benthamiana'da geçici protein ekspresyasyonu, protein lokalizasyonunu veya protein-protein etkileşimlerini incelemek için popüler bir yaklaşım^olmuştur 5. BiFC ve FRET, floresan muhabir sistemlerini kullanarak in vivo protein-protein etkileşimlerini incelemek için yöntemlerdir⁶. Bu iki tekniğin bir kombinasyonunun üç protein arasındaki etkileşimi ortaya çıkardığı gösterilmiştir⁷. FRET, kabul edici fotobleaching, duyarlı emisyon ve Floresan Ömür Boyu Görüntüleme (FLIM) tekniği kullanılarak ölçülür. FLIM tabanlı FRET tahlilleri, floresan ömürlerine göre iki molekül arasındaki enerji transferi ölçümlerine doğru nicelik ve mekansal özgüllük sağlayan bir araç olarak ortaya çıkmıştır⁸. FLIM, bir foton yaymadan önce bir flororforun heyecanlı bir durumda kaldığı zamanı ölçen ve sadece yoğunluk ölçümlerini kullanan tekniklerden daha iyidir^9,10. Nicotiana benthamiana ve soğan epidermal peelingleri gibi heterolog sistemlerin yanı sıra, daha yeni raporlar, yerel^koşullaraltında protein-protein etkileşimlerinin in vivo analizi için Arabidopsis köklerinin ve genç pirinç fidelerinin^vb.

Uygun bir ifade sistemi dışında, BiFC ve FRET tahlilleri için etkileşime giren ortakların seçimi de bu deneyin başarısı için çok önemlidir. BiFC yapılandırmasında kullanılan ortaklar arasındaki ÜFE, FRET denemesinde eşleştirilmiş bir ortak olarak kullanılmadan önce uygun denetimler kullanılarak doğrulanmalıdır¹³. BiFC, floresan proteinin N ve C-terminal parçalarının yapısal tamamlayıcısını kullanır. BiFC tahlillerinde kullanılan tüm floresan proteinlerin çoğunda yaygın bir sınırlama, iki türev nonfluoresan parçası arasındaki kendi kendine montaj olmuştur, yanlış-pozitif floresanlara katkıda bulunur ve sinyal-gürültü (S / N) oranını^{azaltır 14}. Nokta mutasyonları veya floresan proteini bölme pozisyonu da dahil olmak üzere son gelişmeler, artan yoğunluk, daha yüksek özgüllük, yüksek S / N oranı^15,16ile BiFC çiftlerine yol açtı. Bu floresan proteinler, deneyin uygunluğuna bağlı olarak BiFC'yi gerçekleştirmek için de kullanılabilir.

Geleneksel olarak, CFP ve YFP, FRET deneylerinde donör ve alıcı çift olarak kullanılmıştır¹⁷. Bununla birlikte, YFP veya m-Sitrin'in Arabidopsis kök sisteminde hedef proteinlerin doğal ekspresyumu sırasında yüksek kuantum verimi (QY) nedeniyle daha iyi FRET donörleri (kabul eden olarak RFP ile kullanıldığında) olduğu bulunmuştur. Organizatörlerin seçimi (konsitutive versus native/endogenous) ve fluorophore da başarılı bir BiFC-FRET-FLIM deneyi tasarlamada çok önemli bir rol oynamaktadır. FRET donörlerinin verimliliğinin ve FRET çiftlerinin uygunluğunun, organizatördeki değişiklik ve ifade için kullanılan biyolojik sistemle değişme eğiliminde olduğunu belirtmek önemlidir. Parlaklığı ile ilgili floroforun QY'si pH'a, sıcaklığa ve kullanılan biyolojik sisteme bağlıdır. FRET deneyi için florofor çiftini seçmeden önce bu kriterlerin iyice dikkate alınmasını öneriyoruz. Bu protokol için kullanılan biyolojik sistem, promotörler ve proteinler BiFC FRET-FLIM deneyi için CFP-YFP floroforları ile iyi çalıştı.

Bu çalışmada, BiFC tabanlı FRET kullanarak üç protein molekülü arasındaki etkileşimi görselleştirmek için FLIM özelliğini birleştiriyoruz. Bu teknikte, iki protein bölünmüş YFP proteini ve üçüncü protein CFP ile etiketlenir. Mads kutusu protein (M) homodimerinin Kalsiyum sensör proteini (C) ile etkileşimini incelemek istediğimizden, bu proteinler pSITE-1CA ve pSITE-3CA vektörlerinde floresan proteinlerle etiketlenmiştir¹⁸. Etkileşime giren ortaklardan ikisi, bu testte, pSPYNE-35S ve pSPYCE-35S vektörlerinde YFP'nin N ve C-terminal parçaları ile etiketlenmiştir ve^{etkileşimleri,}CFP (FRET donörü olarak hareket eden) ile etiketlenen üçüncü etkileşim ortağına FRET kabul edicisi olarak hareket eden işlevsel YFP'nin yeniden birleşmesi ile sonuçlanır (Şekil 1 ). Bu özel durumda, iki M monomeri ile M ve C arasındaki PPI, BiFC'nin maya-iki-hibrid sistemle birlikte üç farklı sistemde gerçekleştirilmesiyle doğrulanmıştır. Bu vektörler elektroporasyon ile Agrobacterium tumifaciens GV3101 suşu içine harekete geçirildi. GV3101 suşu, gentamisin direnci²⁰olan etkisiz hale tedaklı bir Ti plazmid pMP90'a (pTiC58DT-DNA) sahiptir. Transgene susturma önlemek için tüm infiltratyonlarla birlikte bir p19 Agrobacterium suşu eklendi²¹. Üç proteinin üçlü etkileşimleri doğrulamak için zıt konformasyonlarda da kullanılmasını öneririz.

Bu teknikte, ilk olarak, bağışçının floresan ömrünün (söndürülmemiş donör ömrü) bir alıcının yokluğunda ölçüldüğü FLIM'i çalıştırdık. Bundan sonra, ömrü alıcının varlığında ölçülür (söndürülen donör ömrü). Donör floresan ömürlerindeki bu fark, floresan ömründe bir azalma gösteren foton sayısına bağlı olan FRET verimliliğini hesaplamak için kullanılır. Aşağıda, Nicotiana benthamiana'daki floresan etiketli proteinleri geçici olarak ifade ederek ve BiFC-FRET-FLIM ile etkileşimlerini test ederek herhangi bir üç protein arasında üçlü bir kompleks oluşumunu belirlemek için ayrıntılı bir protokol verilmiştir.

Protokol

1. Giriş ve varış vektörlerindeki genlerin klonlatma (Şekil 2)

1. İlgi genlerinin (bizim durumumuzda M ve C genleri) kodlama sırasını (CDS) PCR ile güçlendirin ve uygun giriş vektörlerinde (örneğin, pENTR/D-TOPO vektörü) klonlayın; Bu denemede kullanılan vektörler için Tablo 1'e bakın).
2. Klonları antibiyotik içeren plakalarda yetiştirin. Antibiyotikler üzerinde seçilen klonları,^22,23'üsınırlandırarak ve DNA dizileme yaparak doğrulayın.
3. Yeniden inşa edilen CDS'leri giriş klonlarından hedef vektörlere (pSPYNE-35S, pSPYCE-35S, pSITE-1CA ve pSITE-3CA) harekete geçirin ve dizilerin girişten hedef vektörlere transferini kısıtlama enzim sindirimi ile onaylayın.
   NOT: Bu denemede kullanılan tüm vektörler Tablo 1'de listelenmiştir.
4. Son olarak, Agrobacterium GV3101 (pMP90 (Gent^R))hücrelerini hedef vektörlerle elektroporasyonla dönüştürün (Şekil 3)²⁴.

2. Nicotiana benthamiana bitkileri için büyüme koşulları

NOT: Nicotiana bitkilerini kontrol koşullarında 4-6 yaprak aşamasına kadar yetiştirin.

1. Nicotiana bitkilerini yetiştirmek için, piyasada bulunan toprak karışımlarını 2:1:1 oranında kakao ve kompost ile karıştırarak toprak karışımını hazırlayın.
2. Toprak yatağı yapmak ve deiyonize suyla doyurmak için bu toprak karışımının 1 inç kalınlığında bir tabakasını plastik bir tepsiye yayın. Bu toprak yatağa yaklaşık 200 tohum serpin.
3. 1 cm duran su içeren daha büyük bir tepsiye aktarın. Nem odası oluşturmak için bu tepsiyi plastik sargı ile örtün.
4. Bu seti 16 saat açık ve 8 saat karanlık döngü ile 23 °C'de 150-170 μmol/m²s ışık yoğunluğuna sahip bir büyüme odasına aktarın.
5. İki hafta sonra, genç fideleri suya doymuş toprak karışımı içeren küçük, 3-4 inç saksılara aktarın.
6. Bu saksıları plastik tepsilere yerleştirin ve dört hafta daha büyüme odasına aktarın.

3. Agro-infiltration için bakteriyel suşlar hazırlayın

NOT: Agro-infiltration için bakteriyel suşların taze alt kültüre edilmesi ve uygun oranlarda p19 Agrobacterium suşu ile karıştırılması gerekir.

1. pSPYNE-35S ve pSPYCE-35S vektörü barındıran Agrobacterium için rifampicin (100 μg/mL), gentamisin (25 μg/mL) ve kanamycin (50 μg/mL) içeren 2xYT agar plakaları hazırlayın. Gerinim içeren pSITE vektörü için rifampicin (100 μg/mL), gentamisin (25 μg/mL) ve spektinomisin (50 μg/mL) kullanın.
2. Laminer akış davlumbazında steril aşılama döngüleri kullanarak bu plakalardaki plazmidleri içeren Agrobacterium suşlarını çizgile.
3. Bunları 28 °C'de karanlıkta 48 saat kuluçkaya yatır.
4. BiFC ve FRET yapılarını barındıran Agrobacterium GV3101 suşu aşılayarak bu prosedüre başlayın (pSPYNE-35S'de hazırlanmıştır, pSPYCE-35S ve pSITE vektörleri) uygun antibiyotikler içeren 2xYT suyunun 10 mL'sinde çizgili plakalardan (Rifampicin (100 μg) /mL), gentamisin (25 μg/mL), kanamycin (50 μg/mL) veya spektinomisin (50 μg/mL)).
5. Ek olarak, rifampicin (100 μg/mL) ve kanamycin (50 μg/mL) içeren 10 mL 2xYT et suyu aşılayarak p19 Agrobacteria suşu kültürünü başlatın.
   NOT: Transgene susturma önlemek için p19 suşu eklenir.
6. Matarayı alüminyum bir folyo ile örtün ve karanlıkta 16 saat boyunca 28 °C ve 170 rpm'de ayarlanmış inkübatör çalkalayıcıda tutun.
7. Bir gecede büyümeden sonra, spektrofotometre kullanarak 600 nm'de kültürlerin optik yoğunluğunu (O.D.) ölçmek için bu kültürün 1 mL'lik kısmını tek kullanımlık bir cuvette'e aktarın.
8. Her kültürün son O.D.'si 0,5 ve p19'unki 2 mL'lik toplam hacimde 0,3 olacak şekilde suşlar içeren uygun BiFC ve FRET ortağının kültürlerini karıştırın.
9. Bu oranlara ulaşmak için aşağıda belirtilen formülü kullanın:
   
   Elde_edilen OD = 600 nm olarak ölçülen kültürün O.D.
   V_kültürü = Gereken kültürün hacmi
   OD_finali = yapılar için 0,5 ve p19 için 0,3
   V_finali = 2 mL olan sızma için son hacim
   NOT: Bu çalışmada kullanılan yapı kombinasyonları Tablo 2'de belirtilmiştir.
10. Karışık Agrobacterium kültürlerini oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 3.000 x g'da santrifüj edin ve süpernatantı dikkatlice atın. Peletin 2 mL taze hazırlanmış sızma tamponunda (10 mM MES, 100 μM Asetosyringone ve 10 mM MgCl₂₎yeniden canlandırıldığını. Homojen bir hücre süspansiyonu yapmak için bir girdap karıştırıcı kullanın.
11. Resüspended hücreleri içeren tüpleri oda sıcaklığında 3 saat boyunca inkübte edin.
12. Bu arada, her bitki saksısını içine sızacağı yapı karışımıyla etiketleyin. Her sızma karışımı için iki bitki kullanın.
13. 1 mL iğnesiz şırıngayı agrobakteriyal karışımla doldurun. Şırınnayı tamamen genişletilmiş yaprağın abaksiyel tarafına hafifçe ama sıkıca bastırın ve yaprağı diğer taraftan destekleyin. Çözeltiler şırıng ucunun 2-3 katına eşdeğer yaprak bölgesinde dolana kadar pistonu hafifçe itin.
14. Şekil 4'tegösterildiği gibi, bir yaprak üzerinde dört noktaya ve bitki başına 3-4 yaprak sızın.
    NOT: Çapraz kontaminasyonu önlemek için eldivenleri değiştirin veya numuneler arasında %70 alkol içeren eldivenleri silin.
15. Tüm tencereleri bir tepsiye aktarın ve 2.
16. Agroinfiltrated yaprağın küçük bir kısmını floresan mikroskobu kullanarak farklı zaman noktalarında kontrol edin. Hücrelerde hem YFP hem de CFP floresan tespit edildiğinde, BiFC-FRET FLIM tahlil için konfokal mikroskopa geçin. Bu deneyde, analiz agro-infiltrationdan 3 gün sonra gerçekleştirildi.
    NOT: BiFC-FRET FLIM testinde kullanılan kimerik proteinlerin aşırı ekspresyonunu önlemek için her organizatör ve gen kombinasyonu için kuluçka sonrası dönemi ayrı ayrı ayarlayın. Partner proteinlerin aşırı ekspresyonu yanlış-pozitif etkileşimlere yol açabilir.

4. Floresan görselleştirme için slaytlar hazırlayın

1. Bitkiler görselleştirmeye hazır olduğunda, sızma yarasından 5-8 mm uzakta kare yaprak örneklerini kesin ve temiz slaytlarda damıtılmış suya monte edin.
   NOT: Arka plan floresanını en aza indirmek için, slaytları% 80 etanol ve ardından 3-4 kez damıtılmış su ile temizleyin, havayla kurutun ve emici bir tabaka üzerinde tutun.
2. Yaprak örneğini temiz bir kapakla örtün ve bir tırnak minesi kullanarak mühürleyin.
3. Bu örnekleri konfokal lazer tarama mikroskobu altında görselleştirin.

5. Konfokal lazer tarama mikroskobu kullanılarak FRET-FLIM analizi

NOT: Bu prosedürde, iki protein arasındaki etkileşimi belirlemenin ve ölçmenin temeli, FRET'in verimliliğini hesaplamak için kullanılan kabul edenle etkileşimi üzerine FRET-donör ortağının floresan ömrünün azalmasıdır. Üçlü etkileşim durumunda karmaşıklık daha da artar, çünkü FRET-kabul edici, bu durumda, tek bir molekül değil, işlevsel bir FRET-kabul edici florofor olmak için in vivo olarak yeniden inşa edilmesi gereken bölünmüş bir YFP-BiFC çiftidir. FRET-FLIM'i gerçekleştirmek için, donör molekülün floresan ömrünün tek başına ve daha sonra bir FRET ortağının varlığında belirlenmesi gerekir.

1. FLIM uygulamasını konfokal lazer tarama mikroskobunda açın, konsolu başlatın ve floresan ömrünü ölçmek için desen tanıma foton sayımını kullanın. Standart 'Tüm foton sayımı' ölçüm modunu seçin.
2. İki tür tarıma sızmış bitkiden alınan örnekleri analiz edin: biri sadece donörle (C-CFP) diğeri donör ve alıcı (C-CFP, M-YFP ile birlikte) ile.
   NOT: M proteininin etkileşimi BiFC ve Y2H kullanılarak C proteini ile zaten doğrulandığından, bu etkileşim çifti ile iyi FRET verimliliği beklenmiştir.
3. Ardından, C-CFP agro-infiltrated yaprağı tarayın ve iyi CFP floresan gösteren bir hücreye odaklanın. Lazer tarama modunu başlatın ve CFP görselleştirme ve FLIM ölçümleri için sistemi ayarlayın_{(φ ex} 440 nm darbe lazer, hibrit dedektörler tarafından φ_em 480-520 nm, Tarama hızı 512 x 512 piksel 400 Hz).
4. Yakalanması gereken alana odaklanmak için odağı, yakınlaştırmayı ve akıllı kazancı ayarlayın.
5. Darbe başına yaklaşık 0,1 foton yakalamayı sağlamak için numuneyi yeterli lazer gücüyle aydınlatın. Değişken floresan yoğunluğuna sahip numuneler için, ömür boyu ölçüm için gerekli yeterli fotonları toplamak için 50 kare yakalayın. CFP, konformasyonsal adaptasyonu nedeniyle iki floresan ömrü sergiler; bu nedenle, n değerini 2'ye eşit tutarken n-üstel reconvolution modelini kullanarak verileri sığdırın.
6. Bu ayarlarda CFP, 1.0 ve 3.2 ns'lik iki ömür gösterir. Burada daha yüksek, 3.2 ns, sonraki tüm hesaplamalar için ömür^{kullanılır 25,26}.
7. İki protein arasındaki etkileşim derecesinin ölçüsü olan FLIM kullanarak FRET verimliliğini hesaplamak için, C-CFP ve M-YFP ile birlikte sızmış bir yaprak örneği alın. Hem C-CFP hem de M-YFP'yi ifade eden bir hücre arayın ve φ_ex 440 nm darbe lazeri, φ_em 480-520 nm ve φ_ex 514 nm beyaz ışık lazeri kullanarak heyecanlandırarak ilgili emisyon modellerini onaylayın. Hem CFP hem de YFP floresanını gösteren bir hücreyi sırayla tarayın ve tanımlayın.
8. Her iki proteinden de floresan doğruladıktan sonra, C-CFP'nin ömrünü ölçmek için daha önce kullandığımız ayarları kullanarak CFP'nin ömrünü ölçmek için FLIM konsoluna geçin (adım 5.5).
   NOT: Bu hücre ayrıca C-CFP ile potansiyel olarak etkileşime girebilen ve C-CFP ömründe bir azalmaya neden olabilen M-YFP'yi ifade ediyor.
9. n-üstel rekonsvolution modeli kullanılarak elde edilen grafiği n = 2 ile sığdırın. CFP ve YFP arasında Förster rezonans enerji transferini gösteren CFP ömründe 3,2 ila 2,6 ns arasında bir azalma gözlenmiştir (Şekil 5A).
10. Şimdi yazılımda FRET konsolunu başlatın ve yazılımda sağlanan denkleme söndürülmemiş donör ömrünü manuel olarak girerek FRET verimliliğini hesaplayın. Ve gözlemlenen FRET verimliliği: % 56.
11. Üçlü etkileşim
    1. Son olarak, üç ortak arasındaki etkileşimleri görselleştirmek için, yaprak örneğini C-CFP, M-YFPn ve M-YFPc ile birlikte sızmış bir tesisten alın.
    2. İki M proteini arasındaki BiFC etkileşiminden kaynaklanan hem CFP hem de yeniden inşa edilmiş YFP floresanını gösteren bir hücre için yaprak eksplantını tarayın. Daha önce kullanılan lazer ve emisyon dalga boylarını kullanın.
    3. Ardından, 514 nm lazeri kapatın ve FLIM konsoluna geçin.
       NOT: M-YFP dimer C-CFP ile etkileşime girerse, M-YFP ile etkileşimi sırasında gözlendiği gibi C-CFP ömründe bir azalma görülmelidir. Ancak, C-CFP M-YFP dimer ile etkileşime giremezse, floresan ömrü 3,2 ns'de kalmalıdır.
    4. Yukarıda belirtildiği gibi benzer ayarları kullanarak, cfp ömrünü yeniden inşa edilmiş YFP'nin varlığında ölçün. n-üstel rekonsvolution modeli kullanılarak elde edilen grafiği n = 2 ile takın ve FRET konsoluna geçin.
       NOT: CFP ömründe 3,2 ila 2,3 ns arasında bir düşüş vardır. Yukarıda açıklandığı gibi FRET verimliliğini hesaplayın. Hesaplanan FRET verimliliği% 55'tir. Donör ömründeki azalma ve % 55'lik iyi FRET verimliliği, iki M proteini ile C protein in vivo arasındaki üçlü etkileşimi doğrular (bkz. Şekil 5B).

Sonuçlar

Bu protokol, bitkilerdeki vivo üçlü protein-protein etkileşimlerini incelemek için optimize edilmiş bir yöntemi temsil eder. Protokolün temel ilkesi, üç protein ortağı arasındaki üçlü kompleks oluşumunu ölçmek için bir test oluşturmak için iki floresan etiketli protein etkileşimi tekniğini, yani BiFC ve FRET'i birleştirmektir. Burada FRET bağışçısının varlığında ve yokluğunda FRET donör ortağının floresan ömrünü ölçmek için FLIM'i kullandık. İki protein arasında o...

Tartışmalar

Mevcut protokol, MADS kutu proteininin iki monomeri ile kalsiyum sensör proteini arasında üçlü bir kompleks oluşumunu belirlemek için BiFC tabanlı FRET-FLIM testinin kullanımını göstermektedir. Protokol, Y. John Shyu ve ark. tarafından hazırlanan ve Fos-Jun heterodimers ile NFAT veya p65 arasında oluşturulan üçlü kompleksi hassaslaştırılmış emisyon yöntemi⁷kullanarak görselleştirmek için BiFC tabanlı bir FRET yöntemi geliştirdikleri bir rapordan uyarlanmıştır. Dah...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml Syringes without needles	Dispovan	-
Acetosyringone	Sigma-Aldrich	D134406
Gateway  LR Clonase II Enzyme mix	Thermo Fischer Scientific	11791020	The vectors used in the study are Gateway based
Gentamycin Sulphate	Himedia	CMS461
Kanamycin Sulphate	Himedia	MB105
MES hydrate	Sigma-Aldrich	M2933
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670
pENTR/D-TOPO Cloning Kit	Thermo Fischer Scientific	K240020	The vectors used in the study are Gateway based
Phusion high fidelity Taq DNA polymerase	Thermo Fischer Scientific	F530-S	Any High fidelity Polymerase can work
Rifampicin	Himedia	CMS1889
SP8 FALCON Confocal laser scanning microscope	Leica	SP8 FALCON	Any CLSM with FLIM capabilities can be used for this analysis
Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate	Himedia	TC034