通过共聚焦显微镜成像分析进行细胞外囊泡摄取测定

摘要

细胞外囊泡（EV）有助于细胞生物学和细胞间通讯。需要实际的测定来可视化和量化细胞对EV的摄取。目前的方案提出了EV摄取测定，通过共聚焦显微镜利用三维荧 光成像， 然后通过基于纳滤的微流体装置进行EV分离。

摘要

需要实际的测定来可视化和量化细胞的细胞外囊泡（EV）摄取。EV摄取在各个研究领域的细胞间通讯中发挥作用;癌症生物学，神经科学和药物输送。文献中已经报道了许多EV摄取测定;然而，缺乏实用，详细的实验方法。可以通过荧光标记EV来评估EV的摄取，以检测它们在细胞中的位置。区分细胞内化的EV和细胞上的浅表EV对于准确确定EV摄取是困难的，但至关重要。因此，在这项工作中提出了一种通过三维（3D）荧光共聚焦显微镜有效量化EV摄取的测定方法。使用基于纳滤的微流体装置制备荧光标记的EV，通过3D共聚焦显微镜可视化，然后通过先进的图像处理软件进行分析。该协议为在细胞水平上分析电动汽车提供了一种强大的方法，并为有效分析提供了一种实用的方法。

引言

细胞外囊泡（EV）是纳米大小的脂质膜结合颗粒，按其大小分类:外体（100-500nm）和外泌体（50-150nm）¹。EV含有各种生物分子，如蛋白质、核酸和脂质。这些生物分子起源于细胞，然后被封装为货物并通过^EV1，2，3释放到细胞外空间。

由于其货物的多样性，电动汽车被认为在细胞间通信中发挥着积极作用。细胞释放和摄取EV允许生物分子在细胞之间转移^4，5。将EV货物引入细胞可能会改变受体细胞的功能和稳态^4，5，6。电动汽车通过多种途径内化;然而，确切的机制尚未得到准确证明。

大多数EV摄取测定，如遗传标记，荧光标记单个^EV7。由此产生的信号可以通过微孔板光度计，流式细胞术或显微镜进行测量，每种技术都有很大的局限性。微孔板光度计、流式细胞术或标准二维（2D）显微镜无法区分内化和浅表附着的^EV8，9。此外，这些技术中的每一种的必要样品制备都可能给EV摄取评估带来其他问题。例如，在EV摄取分析之前用胰蛋白酶提升粘附的细胞可能会切割细胞表面的一些表面附着的^EV10，11。胰蛋白酶也可能与细胞表面相互作用，影响细胞和EV表型。此外，胰蛋白酶可能不会完全分离浅表的EV，从而扭曲孤立的人群。

为了用荧光染料准确标记EV，需要额外的洗涤步骤来去除残留的染料⁷。公认的隔离技术也可能导致由于EV隔离期间发生的凝血而导致假阳性信号。例如，连续超速离心（UC）被广泛用于分离EV和去除固定化染料。然而，UC可能会共同沉淀EV，并且残留的染料可能导致假阳性信号^12，13。其他纳滤方法，如基于色谱柱的过滤，也广泛用于非固定化染料去除。EV和染料在柱基质内相互作用的复杂性质可能导致残留染料的不完全去除，因为复合物输入改变了色谱柱的分子截止^14，15，16。

目前的方案提出了一种基于纳米过滤的微流体装置，用于分离和洗涤荧光标记的分离EV。基于纳滤的微流体装置 可以通过 流体辅助分离技术（FAST）^17，18提供有效的过滤。FAST降低了过滤器的压降，从而减少了电动汽车和染料之间的潜在聚集。通过有效去除残留染料，可以提高荧光标记EV的质量和测定的特异性。

共聚焦显微镜可以区分细胞表面内化和浅表附着的EV，并在时空分辨率下全面研究EV摄取的细胞机制^19，20，21，^{22，23，24，25}。例如，Sung等人使用他们开发的活细胞报告器描述了外泌体生命周期的可视化。使用三维（3D）和后图像处理工具中的共聚焦显微镜检测和分析内化EV的位置²⁰。虽然小型EV（40-200nm）的尺寸低于光学显微镜的分辨率极限，但由于光电探测器可以检测到增强的荧光发射，因此可以通过共聚焦显微镜检测荧光标记的EV。因此，通过获取EV和周围细胞器的多个z堆叠图像，可以精确地确定细胞内荧光标记的EV的亚细胞定位。

此外，3D重建和后数据处理可以进一步了解内部化，浅表和自由浮动的电动汽车的定位。通过将这些过程与共聚焦显微镜提供的延时活细胞成像相结合，可以精确评估EV摄取的水平，并且还可以实时跟踪EV摄取。此外，通过评估EV与细胞器的共定位，可以使用共聚焦显微镜进行EV贩运分析，这是确定内化EV如何参与细胞内功能的第一步。该协议描述了使用基于纳滤的微流体装置^17，26，共聚焦显微镜和图像后分析进行EV摄取测定的方法。

研究方案

1. EV分离和片上免疫荧光EV标记

1. 细胞培养基（CCM）的收集和CCM的预处理，用于EV分离
   1. 将PC3细胞以30%汇合度接种在75 cm ² 细胞培养瓶中。允许对照细胞在标准培养基和细胞系特异性补充剂中生长至90%汇合度（约48小时）。
      注意:为了防止含EV的成分影响细胞摄取（即胎儿牛血清），请使用外泌体耗尽的培养基和补充剂。
   2. 收获CCM。
   3. 在室温（RT）下以1000× g 离心CCM10分钟，以沉淀任何未附着的细胞和用培养基收获的大碎片。将上清液转移到新的锥形管中。
   4. 在新管中，在4°C下以10，000× g 离心上清液20分钟，以沉淀留在培养基中的较小碎片和凋亡体。一些较大的电动汽车会颗粒。将上清液转移到新管中。
   5. 通过0.45μm亲水聚偏二氟乙烯（PVDF）膜注射器过滤上清液。
      注:如果不立即处理CCM以进行EV隔离，请将预处理的CCM储存在-80°C直至隔离。如果冻结，请将冻融周期限制为一个。
2. 使用基于纳米滤波的微流体装置从CCM中分离EV
   1. 如果冷冻，在步骤1.2.2之前完全解冻CCM并涡旋30秒。
   2. 将1mL预处理的CCM（步骤1.1）注入基于纳滤的微流体装置的样品室（见 材料表）^17，26。
      注:遵循基于纳滤的微流体装置的标准操作程序^17，26。
   3. 在台式纺纱机（见 材料表）中以3000 rpm旋转10分钟以操作微流体装置。
      注意:如果CCM在初始运行后仍留在样品室中，请执行额外的旋转，直到所有CCM都从样品室中排空。
   4. 通过移液从废物室中取出液体，并重复步骤1.2.1，1.2.2和1.2.3两次。
      注意:总共将处理3 mL CCM以进行EV隔离。
   5. 将1 mL磷酸盐缓冲盐水（PBS）注入样品室以洗涤分离的EV。在台式纺丝机中旋转，用于操作步骤1.2.3中提到的微流体装置。在设备的膜上找到纯电动汽车。
      注:具体而言，通过透射电子显微镜（TEM）、扫描电子显微镜（SEM）、纳米颗粒跟踪分析（NTA）、结构化照明显微镜、酶联免疫吸附测定和实时荧光定量PCR，证实了从基于纳滤的微流体装置中分离出的EV的质量，并与传统的UC方法进行了比较^17，26。
3. 使用基于纳滤的微流体装置对EV进行免疫荧光标记（图1）
   1. 根据测定目的选择EV特异性抗体（见 材料表）。
      注意:某些抗体可能会干扰 EV 摄取途径特有的配体结合位点（即内吞作用）。
   2. 将1μg/ mL的EV特异性抗体注射到含有100μL分离EV的装置的洗脱孔中。
   3. 在室温下在平板振荡器上孵育1小时，以确保抗体在样品中的均匀分布。
   4. 将胶带粘附在洗脱孔上。将1 mL PBS注入样品室以洗出任何残留的抗体。
   5. 以3000 rpm的速度旋转设备，直到样品室为空。通过移液从废物室中取出任何液体。将 1 mL PBS 注入样品室。
      注:荧光标记的EV将位于膜室中。
   6. 将荧光标记的EV（图2）从膜室移液到琥珀管。从光线下挡住，直到使用。

2.用荧光标记的EV孵育细胞用于EV摄取测定

1. 靶向细胞接种和培养在细胞培养兼容培养皿上培养。
   1. 将1 x 10 ⁴ 个PC3细胞接种到微滑8孔板（每个孔9.4 x 10.7mm）中，加入0.2mL培养基或4 x ¹⁰⁴ PC3细胞放入具有1 mL培养基的35mm培养皿中。将细胞平板到由薄盖玻片（厚度:0.18mm）组成的细胞培养相容皿中。
      注:薄盖玻片可最大限度地减少光线的不利散射。
   2. 让细胞在最佳细胞培养条件（37°C，5%CO ₂ 浓度，90%湿度）下粘附过夜。
   3. 用外泌体耗尽的培养基洗涤粘附的细胞两次（在步骤1.1.1中描述）。
2. 用荧光标记的EV孵育细胞。
   1. 通过纳米颗粒跟踪分析（NTA， 补充图1）测量荧光标记EV的浓度（步骤1.3.5）。确定要添加到培养细胞中的荧光标记EV的最佳浓度（步骤2.1.2.）。
   2. 用外泌体耗尽的培养基稀释荧光标记的EV，以匹配步骤2.2.1中测量的所需浓度。（即，在200μL外泌体耗尽培养基中7.80 x ¹⁰⁹ EV（以NTA值计）。
   3. 将稀释的EV（步骤2.2.2）加入到2.1.2制备的粘附靶细胞中。孵育实验时间（即4、8或12小时）。
   4. 用无外泌体培养基洗涤细胞三次，以除去任何未内化的EV。
      注意:可选:洗涤后可以固定细胞。
   5. 用1μg/ mL的CMTMR（（5-（和-6）-（（（4-氯甲基）苯甲酰基）氨基）四甲基罗丹明）标记粘附细胞的细胞质（见 材料表），并在最佳细胞培养条件（37°C，5%_CO2 浓度，90%湿度）下孵育。
      注意:细胞区域染料应与标记的EV分开发出荧光，以帮助确定EV摄取测定期间尖峰EV的空间位置（内化或浅表）。
   6. 用外泌体耗尽的培养基洗涤标记的细胞两次，以除去残留的染料。将新鲜的外泌体耗尽培养基添加到细胞中，为活细胞共聚焦成像做准备。

3. 共聚焦显微镜

1. 要进行活细胞成像，请使用载物台培养箱来维持最佳的细胞培养条件（37°C，5%_CO2 浓度，90%湿度）。
2. 将准备好的细胞置于舞台培养箱中。
3. 根据对照样品设置成像参数。
   注意:建议的对照样品包括:仅荧光标记的EV，荧光标记的细胞，未标记的EV和未标记的细胞。
4. 确定目标像元的深度和 z 方向上的堆叠大小范围，以获取 3D 共聚焦图像。
   注:Z轴堆叠的厚度为1μm。共聚焦3D图像采集持续了2分34秒（每次Z平面图像采集大约需要8秒;总共20张Z轴图像）。
5. 同时将图像采集设置为细胞特异性染料（即红色）和EV特异性染料（即绿色）的多个z堆叠图像（图3 和 图4A）。

4. 图像处理

1. 利用自动图像处理软件分析原始z堆叠共聚焦图像，并确定细胞对EV的摄取（见 材料表）。
2. 将阈值参数设置为细胞和EV特异性染料的荧光信号。构建单元的虚拟表面（图4A，B）。
   1. 要构建单元格的虚拟曲面，请单击" 添加新曲面"按钮。
   2. 选择 "最短距离计算 "作为"算法设置"以使用软件提供的算法，然后单击 下一步:源通道。
   3. 在此实验中，选择 通道 2 - CMTMR 作为"源通道"。
   4. 选择" 平滑 "，然后将适当的值放入"曲面细节"中以进行曲面平滑处理。
      注:本实验为0.57 μm，因为1个像素在原始成像数据中代表0.57 μm。
   5. 选择" 绝对强度 "作为"阈值"。
   6. 要通过提供的算法自动对荧光图像进行阈值设置，请单击 "阈值（绝对强度）":该值是自动设置的。
   7. 选择 "启用 "作为"拆分触摸对象（区域生长）"，并将估计的细胞大小的值放入本实验中的"种子点直径"10.0 μm。然后单击" 下一步: 筛选种子点"。
   8. 要配置虚拟像元表面，请单击 + 添加 按钮，然后选择 质量 作为"过滤器类型"。通过目视检查将下限的适当值（本实验中为 210）和上限的最大值 （1485） 作为阈值，然后单击" 完成 "按钮。
      注意:目视检查意味着研究人员可以从原始荧光图像中区分细胞区域。
   9. 接下来，要构建EV的虚拟点，请单击" 添加新点"按钮。
   10. 选择" 不同光斑尺寸（区域增长） "和 "最短距离计算 "作为"算法设置"，然后单击 "下一步:源通道"。
   11. 在此实验中，选择 通道 1 - Alexa Fluor 488 作为"源通道"。
   12. 将适当的值放入"估计的XY直径"中以进行点检测，在此实验中为 1μm 。然后，单击" 下一步:筛选斑点"。
   13. 要配置虚拟 EV 点，请单击 + 添加 按钮，选择 质量 作为"过滤器类型"，然后通过目视检查将"下限阈值"设置为 100 在此实验中。然后，单击" 下一步:Spot 区域类型" 按钮。
   14. 选择" 绝对强度 "作为"光斑区域类型"，然后单击 "下一步:光斑区域"。
   15. 要对EV点的区域进行阈值，通过目视检查将适当的值放入"区域阈值"中，在此实验中将 100 作为"区域阈值"。
       注意:目视检查意味着研究人员可以将EV区域与原始荧光图像区分开来。
   16. 选择" 区域体积 "作为"直径起始"，然后单击 "完成"。
3. 使用软件提供的算法在步骤4.2中分割构建表面内的分组点（图4C，i-iv）。
   1. 单击构建的 "斑点"，然后进入 "筛选器"。
   2. 单击"+ 添加"按钮，然后选择"到曲面的最短距离曲面 = 曲面 1"作为"滤镜类型"，然后单击"将所选内容复制到新点"按钮。最低限值为 -7.0，上限为适当值 （-0.5）。
      注意:使用 估计的"点"半径设置上限。在该实验中，在步骤4.2.11中将 斑点（即EV点）的估计直径设置为 1μm 。因此，上限可以是 0.5。
4. 细胞内EV的自动计数
   注意:软件将自动计算电池内的EV数量，指示目标电池内部化的数量。
   1. 单击构建的 "点 1"选择 [到曲面的最短距离 = -7.00 和 -0.500 之间的曲面 1]。
   2. 转到 统计信息，然后从"点总数"中导出值
      注意:软件提供的算法将自动计算细胞的数量和体积。
5. 根据上述计算值确定每个潜伏期的EV吸收率（图5）。
   1. 要获取单元格数，请单击构建的 曲面 1，然后转到 统计数据，并从 "总体"中导出"曲面总数"的值。
   2. 转至"详细信息"到"统计信息"以从"详细"导出卷。

结果

使用基于纳米过滤的微流体装置，从PC3 CCM中分离EV并用荧光团偶联的EV特异性（CD63）抗体标记（图1）。标记的EV通过3D共聚焦显微镜成功可视化（图2）。标记的EV与细胞在外泌体耗尽的培养基中孵育数小时。孵育后，用外泌体耗尽的培养基洗涤细胞。其余的EV在孵育期间被内化或粘附在细胞上。已标记单元格区域。内化的EV被可视化为puncta19

讨论

通过共聚焦显微镜进行基于3D荧光成像的EV摄取测定提供了一种有效的方法和灵敏的分析。这种荧光EV标记有助于EV的可视化，并成功执行精确的EV摄取测定。以前用于标记EV和去除残留染料的方法已经通过使用超速离心（UC）去除沉淀来报道;然而，UC可能会共同沉淀EV，并且固定化的染料可能导致假阳性信号^12，13。基于纳米过滤的微流体装置消除了...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 anti-human CD63 Antibody	Biolegend	353038	Fluorescent dye conjugated EV-specific antibody
CellTracker Orange CMTMR Dye	Thermo Fisher Scientific	C2927	Live cell (cytoplasm) fluoresent labeling reagent
CFI Apo Lambda S 40XC WI	Nikon	MRD77400	Objective for confocal imaging, NA=1.25
CFI Plan Apo VC 20X	Nikon	MRD70200	Objective for confocal imaging, NA=0.75
Exodisc	Labspinner Inc.	EX-D1001	A nano-filtration based microfluidic device for EV isolation
ExoDiscovery	Labspinner Inc.	EX-R1001	Operation device for Exodisc
Exosome-depleted FBS	Thermo Fisher Scientific	A2720801	Nutrient of cell culture media for PC3 cell line derived EV collection
Fetal bovine serum (FBS)	VWR	1500-500	Nutrient for cell cultivation
Goat Anti-Mouse IgG H&L preadsorbed	abcam	ab7063	Mouse IgG antibody for negatvie control of EV labeling
Ibidi USA U DISH μ-Dish 35 mm	Ibidi	81156	Culture dish for confocal imaging
Imaris 9.7.1	Oxford Instruments	9.7.1	Post-image processing software
Incubator System+ CO2/O2/N2 gas mixer	Live Cell Instrument	TU-O-20	Incubator system for live cell imaging
Nikon A1 HD25 / A1R HD25 camera	Nikon	NA	Camera for confocal imaging
Nikon Eclipse Ti microscope	Nikon	NA	Inverted microscope for confocal imaging
NIS-Elements AR 4.50.00	Nikon	4.50.00	Image processing software for Nikon microscope
NTA, NanoSight NS500	Malvern Panalytical	NS500	Measurement device for EV concentration
OriginPro 2020	OriginLab	9.7.0.185	Graphing software
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122	Antibiotics for cell cultivation
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	21875034	Cell culture media for PC3 cell line cultivation
SYTO RNASelect Green Fluorescent cell Stain - 5 mM Solution in DMSO	Thermo Fisher Scientific	S32703	RNA staining fluorescent dye for the EV labeling