Test d’absorption des vésicules extracellulaires par analyse d’imagerie au microscope confocal

Résumé

Les vésicules extracellulaires (VE) contribuent à la biologie cellulaire et aux communications intercellulaires. Il est nécessaire de réaliser des tests pratiques pour visualiser et quantifier l’absorption des VE par les cellules. Le protocole actuel propose le test d’absorption ev en utilisant l’imagerie de fluorescence tridimensionnelle par microscopie confocale, après l’isolement EV par un dispositif microfluidique basé sur la nanofiltration.

Résumé

Il est nécessaire de réaliser des tests pratiques pour visualiser et quantifier l’absorption des vésicules extracellulaires (VE) des cellules. L’adoption des VE joue un rôle dans la communication intercellulaire dans divers domaines de recherche; biologie du cancer, neurosciences et administration de médicaments. De nombreux tests d’absorption des VE ont été rapportés dans la littérature; cependant, il y a un manque de méthodologie expérimentale pratique et détaillée. L’absorption des VE peut être évaluée en marquant les VE par fluorescence pour détecter leur emplacement dans les cellules. Il est difficile, mais essentiel, de faire la distinction entre les VE internalisés dans les cellules et les VE superficiels sur les cellules pour déterminer avec précision l’absorption des VE. Par conséquent, un test qui quantifie efficacement l’absorption des VE par microscopie confocale à fluorescence tridimensionnelle (3D) est proposé dans ce travail. Les véhicules électriques marqués par fluorescence ont été préparés à l’aide d’un dispositif microfluidique à base de nanofiltration, visualisés par microscopie confocale 3D, puis analysés à l’aide d’un logiciel de traitement d’image avancé. Le protocole fournit une méthodologie robuste pour l’analyse des véhicules électriques au niveau cellulaire et une approche pratique pour une analyse efficace.

Introduction

Les vésicules extracellulaires (VE) sont des particules de taille nanométrique liées à la membrane lipidique qui sont classées en fonction de leur taille : ectosomes (100-500 nm) et exosomes (50-150 nm)¹. Les VE contiennent diverses biomolécules, telles que des protéines, des acides nucléiques et des lipides. Ces biomolécules proviennent des cellules avant d’être encapsulées sous forme de cargaison et libérées dans l’espace extracellulaire via les ^VE1,2,3.

En raison de la variété de leur cargaison, on pense que les véhicules électriques jouent un rôle actif dans la communication intercellulaire. La libération et l’absorption des VE par les cellules permettent le transfert de biomolécules entre les ^cellules4,5. L’introduction de cargaison de VE dans une cellule peut modifier les fonctions et l’état homéostatique de la cellule réceptrice4,5,6. Les véhicules électriques sont internalisés par de multiples voies; cependant, les mécanismes exacts n’ont pas été démontrés avec précision.

La majorité des tests d’absorption des VE, tels que le marquage génétique, marquent fluorescent les VE ^individuels7. Le signal résultant peut être mesuré par photomètre à microplaques, cytométrie en flux ou microscopie, chaque technologie ayant des limites substantielles. Les photomètres à microplaques, la cytométrie en flux ou la microscopie bidimensionnelle (2D) standard ne peuvent pas faire la distinction entre les VE internalisés et les VE fixés ^{superficiellement8,9}. De plus, la préparation d’échantillons nécessaire pour chacune de ces techniques peut introduire des problèmes supplémentaires dans l’évaluation de l’absorption des VE. Par exemple, soulever des cellules adhérentes avec de la trypsine avant l’analyse de l’absorption des VE peut cliver certains VE fixés superficiellement à la surface de la ^cellule10,11. La trypsine peut également interagir avec la surface de la cellule, affectant le phénotype cellulaire et EV. De plus, la trypsine peut ne pas détacher complètement les VE superficiels, ce qui fausse les populations isolées.

Pour étiqueter avec précision les véhicules électriques avec des colorants fluorescents, des étapes de lavage supplémentaires sont nécessaires pour éliminer le colorant ^résiduel7. Les techniques d’isolement acceptées peuvent également contribuer à des signaux faussement positifs dus à la coagulation qui se produit pendant l’isolement EV. Par exemple, l’ultracentrifugation en série (CU) est largement utilisée pour isoler les véhicules électriques et éliminer le colorant immobilisé. Cependant, la CO peut co-précipiter les VE, et le colorant résiduel peut conduire à un signal ^{faussement positif12,13}. D’autres méthodes de nanofiltration, telles que la filtration sur colonne, sont également largement utilisées pour l’élimination des colorants non immobilisés. La nature complexe des VE et des colorants interagissant dans la matrice de la colonne peut entraîner l’élimination incomplète du colorant résiduel en raison de la coupure moléculaire de la colonne modifiée par l’entrée complexe14,15,16.

Le protocole actuel propose un dispositif microfluidique à base de nanofiltration pour isoler et laver les véhicules électriques isolés marqués par fluorescence. Le dispositif microfluidique à base de nanofiltration peut fournir une filtration efficace grâce à la technologie de séparation assistée par fluide (FAST)^17,18. FAST réduit la perte de charge à travers le filtre, réduisant ainsi l’agrégation potentielle entre les véhicules électriques et les colorants. En éliminant efficacement les colorants résiduels, il est possible d’améliorer la qualité des véhicules électriques marqués par fluorescence et la spécificité du test.

La microscopie confocale permet de distinguer les VE internalisés et superficiellement attachés à la surface de la cellule et d’étudier de manière exhaustive les mécanismes cellulaires de l’absorption des VE dans une résolution spatio-temporelle19,20,21,22,23,24,25. Par exemple, Sung et al. ont décrit la visualisation du cycle de vie des exosomes à l’aide de leur rapporteur de cellules vivantes développé. L’emplacement des VE internalisés a été détecté et analysé à l’aide d’un microscope confocal dans des outils de traitement tridimensionnels (3D) et ^post-image20. Bien que la taille des petits VE (40-200 nm) soit inférieure à la limite de résolution du microscope optique, les VE marqués par fluorescence peuvent être détectés par microscopie confocale puisque le photodétecteur peut détecter l’émission de fluorescence accrue. Par conséquent, la localisation subcellulaire des VE marqués par fluorescence dans une cellule peut être déterminée avec précision en acquérant plusieurs images empilées en Z des VE et des organites cellulaires environnants.

En outre, la reconstruction 3D et le traitement post-données peuvent fournir des informations supplémentaires sur le positionnement des véhicules électriques internalisés, superficiels et flottants. En utilisant ces processus en conjonction avec l’imagerie accélérée des cellules vivantes offerte par la microscopie confocale, le niveau d’absorption des VE peut être évalué avec précision, et le suivi en temps réel de l’absorption des VE est également possible. En outre, l’analyse du trafic de VE peut être effectuée à l’aide de la microscopie confocale en évaluant la colocalisation des VE avec des organites, une première étape pour déterminer comment les VE internalisés sont impliqués dans la fonction intracellulaire. Ce protocole décrit la méthodologie pour effectuer un test d’absorption ev à l’aide du dispositif microfluidique basé sur la ^{nanofiltration17,26}, la microscopie confocale et l’analyse post-image.

Protocole

1. Isolation des VE et marquage immuno-fluorescent ev sur puce

1. Collecte des milieux de culture cellulaire (CCM) et prétraitement du CCM pour l’isolement des VE
   1. Ensemencez des cellules PC3 à 30 % de confluence dans une fiole de culture cellulaire de 75 ^cm2 . Permettre aux cellules témoins de croître jusqu’à 90% de confluence (~ 48 h) dans les milieux standard et les suppléments spécifiques à la lignée cellulaire.
      REMARQUE: Pour empêcher les composants contenant des VE d’affecter l’absorption cellulaire (c.-à-d. le sérum bovin fœtal), utilisez des milieux et des suppléments appauvris en exosomes.
   2. Récoltez le CCM.
   3. Centrifuger le CCM à 1000 x g pendant 10 min à température ambiante (RT) pour granuler les cellules non attachées et les gros débris récoltés avec le média. Transférer le surnageant dans un nouveau tube conique.
   4. Dans le nouveau tube, centrifuger le surnageant à 10 000 x g pendant 20 min à 4 °C pour granuler les débris plus petits et les corps apoptotiques restant dans le milieu. Certains véhicules électriques plus gros vont pelleter. Transférer le surnageant dans un nouveau tube.
   5. Filtrer le surnageant à l’aide d’un filtre à membrane hydrophile de fluorure de polyvinylidène (PVDF) de 0,45 μm.
      REMARQUE: Si vous ne traitez pas immédiatement le CCM pour l’isolation EV, stockez le CCM pré-traité à -80 °C jusqu’à ce que l’isolation soit effectuée. En cas de congélation, limitez les cycles de gel-dégel à un.
2. Isolation EV du CCM à l’aide d’un dispositif microfluidique à base de nanofiltration
   1. En cas de congélation, décongeler complètement le CCM et le vortex pendant 30 s avant l’étape 1.2.2.
   2. Injecter 1 mL de CCM prétraité (étape 1.1) dans la chambre d’échantillonnage du dispositif microfluidique à base de nanofiltration (voir tableau des matériaux)^17,26.
      REMARQUE: Suivez la procédure d’exploitation standard pour le dispositif microfluidique à base de ^{nanofiltration17,26}.
   3. Tourner à 3000 tr/min pendant 10 min dans la machine à filer de paillasse (voir Tableau des matériaux) pour faire fonctionner le dispositif microfluidique.
      REMARQUE : Si le CCM reste sur la chambre d’échantillonnage après l’exécution initiale, effectuez des rotations supplémentaires jusqu’à ce que tout CCM se soit vidé de la chambre d’échantillonnage.
   4. Retirer le fluide de la chambre à déchets par pipetage et répéter les étapes 1.2.1, 1.2.2 et 1.2.3 deux fois.
      REMARQUE: Au total, 3 mL de CCM seront traités pour l’isolation ev.
   5. Injecter 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans la chambre d’échantillonnage pour laver les véhicules électriques isolés. Rotation dans la machine à filer de paillasse pour faire fonctionner le dispositif microfluidique comme mentionné à l’étape 1.2.3. Localisez les véhicules électriques purs sur la membrane de l’appareil.
      REMARQUE: La qualité des VE isolés du dispositif microfluidique basé sur la nanofiltration, en particulier, a été confirmée et comparée à la méthode UC conventionnelle par microscopie électronique à transmission (TEM), microscope électronique à balayage (MEB), analyse de suivi des nanoparticules (NTA), microscopie à illumination structurée, dosage immuno-enzymatique et PCR en temps réel dans la recherche ^{précédente17,26}.
3. Marquage immunofluorescent de l’EV à l’aide d’un dispositif microfluidique à base de nanofiltration (Figure 1)
   1. Sélectionnez un anticorps spécifique à l’EV en fonction de l’objectif du test (voir tableau des matériaux).
      REMARQUE: Certains anticorps peuvent interférer avec les sites de liaison aux ligands spécifiques aux voies d’absorption de la VE (c.-à-d. endocytose).
   2. Injecter 1 μg/mL de l’anticorps spécifique à l’EV dans le trou d’élution du dispositif contenant 100 μL de VE isolés.
   3. Incuber pendant 1 h dans l’obscurité à TA sur un agitateur à plaque pour assurer la répartition uniforme de l’anticorps à travers l’échantillon.
   4. Fixez un ruban adhésif au trou d’élution. Injecter 1 mL de PBS dans la chambre d’échantillonnage pour éliminer les anticorps résiduels.
   5. Faites tourner l’appareil à 3000 tr/min jusqu’à ce que la chambre d’échantillonnage soit vide. Retirez tout fluide de la chambre à déchets par pipetage. Injecter 1 mL de PBS dans la chambre d’échantillonnage.
      REMARQUE: Les véhicules électriques marqués par fluorescence seront situés dans la chambre à membrane.
   6. Pipette les véhicules électriques marqués par fluorescence (Figure 2) de la chambre à membrane vers un tube ambré. Bloquer de la lumière jusqu’à l’utilisation.

2. Incubation des cellules avec des VE marqués par fluorescence pour le test d’absorption ev

1. Cibler l’ensemencement et la culture de cellules sur les plats compatibles avec la culture cellulaire.
   1. Ensemencez 1 x ¹⁰⁴ cellules PC3 dans la plaque microslide à 8 puits (9,4 x 10,7 mm pour chaque puits) avec 0,2 mL de milieu ou 4 x ¹⁰⁴ cellules PC3 dans un plat de 35 mm avec 1 mL de milieu. Plaquer les cellules dans une boîte compatible avec la culture cellulaire composée d’un mince couvercle (épaisseur: 0,18 mm).
      REMARQUE: Le couvercle mince minimise la diffusion défavorable de la lumière.
   2. Permettre aux cellules d’adhérer pendant la nuit dans des conditions optimales de culture cellulaire (37 °C, 5 % de concentration de _CO2 , 90 % d’humidité).
   3. Laver les cellules adhérentes deux fois avec des milieux appauvris en exosomes (décrits à l’étape 1.1.1).
2. Incubation cellulaire avec des VÉHICULES marqués par fluorescence.
   1. Mesurer la concentration des VÉHICULES marqués par fluorescence (étape 1.3.5) par analyse de suivi des nanoparticules (NTA, figure supplémentaire 1). Déterminer la concentration optimale de VE marqués par fluorescence à ajouter aux cellules cultivées (étape 2.1.2.).
   2. Diluer les VE marqués par fluorescence avec un milieu appauvri en exosomes pour correspondre à la concentration souhaitée mesurée à l’étape 2.2.1. (c.-à-d. 7,80 x ¹⁰⁹ VE (en valeur NTA) dans 200 μL de milieux appauvris en exosomes.)
   3. Ajouter les VE dilués (étape 2.2.2) aux cellules cibles adhérentes préparées au point 2.1.2. Incuber pour le temps expérimental (c.-à-d. 4, 8 ou 12 h).
   4. Lavez les cellules trois fois avec des supports sans exosomes pour éliminer les véhicules électriques non internalisés.
      REMARQUE: Facultatif: Les cellules peuvent être fixées après le lavage.
   5. Étiqueter le cytoplasme des cellules adhérentes avec 1 μg/mL de CMTMR ((5-(et-6)-((4-chlorométhyl)benzoyl)amino)tétraméthylrhodamine) (voir tableau des matériaux) et incuber dans des conditions optimales de culture cellulaire (37 °C, concentration de _CO2 à 5 %, humidité de 90 %).
      REMARQUE: Les colorants de la zone cellulaire doivent être fluorescents séparément des véhicules électriques étiquetés pour aider à déterminer l’emplacement spatial (internalisé ou superficiel) des véhicules électriques enrichis pendant le test d’absorption des VE.
   6. Lavez les cellules marquées deux fois avec un milieu appauvri en exosomes pour éliminer le colorant résiduel. Ajouter des milieux frais appauvris en exosomes aux cellules en préparation de l’imagerie confocale des cellules vivantes.

3. Microscopie confocale

1. Pour effectuer l’imagerie de cellules vivantes, utilisez un incubateur sur scène pour maintenir des conditions optimales de culture cellulaire (37 °C, 5 % de concentration de _CO2 , 90 % d’humidité).
2. Placez les cellules préparées dans l’incubateur sur scène.
3. Définissez les paramètres d’imagerie en fonction des échantillons de contrôle.
   REMARQUE : Les échantillons de contrôle suggérés comprennent : les VÉHICULES électriques marqués par fluorescence seulement, les cellules marquées par fluorescence, les véhicules électriques non marqués et les cellules non marquées.
4. Déterminez la profondeur des cellules cibles et la plage de taille d’empilement dans la direction z pour acquérir des images confocales 3D.
   REMARQUE: L’épaisseur d’une pile Z est de 1 μm. L’acquisition d’images 3D confocales a duré 2 min 34 s (chaque acquisition d’image du plan Z a pris environ 8 s; un total de vingt images de la pile Z).
5. Réglez l’acquisition d’images sur plusieurs images empilées en Z de colorant spécifique à la cellule (c.-à-d. rouge) et de colorant spécifique à EV (c.-à-d. vert) simultanément (Figure 3 et Figure 4A).

4. Traitement d’image

1. Utilisez un logiciel de traitement automatique d’images pour analyser les images confocales brutes empilées en Z et déterminer l’absorption des VE par les cellules (voir Tableau des matériaux).
2. Définissez des paramètres de seuil pour le signal fluorescent des cellules et des colorants spécifiques aux VE. Construisez les surfaces virtuelles des cellules (Figure 4A,B).
   1. Pour créer les surfaces virtuelles des cellules, cliquez sur le bouton Ajouter de nouvelles surfaces.
   2. Sélectionnez Calcul de la distance la plus courte comme « Paramètres de l’algorithme » pour utiliser l’algorithme fourni par le logiciel, puis cliquez sur Suivant: Canal source.
   3. Sélectionnez Channel 2 - CMTMR comme « Canal source » dans cette expérience.
   4. Sélectionnez Lisser et placez la valeur appropriée dans « Détails des surfaces » pour le lissage de la surface.
      REMARQUE: 0,57 μm dans cette expérience puisque 1 pixel représente 0,57 μm dans les données d’imagerie brutes.
   5. Sélectionnez Intensité absolue comme « Seuil ».
   6. Pour seuilr automatiquement l’image fluorescente par l’algorithme fourni, cliquez sur Seuil (intensité absolue) : la valeur est automatiquement définie.
   7. Sélectionnez Activer en tant que « Fractionner les objets en contact (croissance de la région) » et placez la valeur de la taille estimée des cellules dans « Diamètre des points d’amorçage », 10,0 μm dans cette expérience. Cliquez ensuite sur Suivant : Filtrer les points d’amorçage.
   8. Pour configurer les surfaces de cellule virtuelle, cliquez sur le bouton + Ajouter , puis sélectionnez Qualité comme « Type de filtre ». Seuilz la valeur appropriée (210 dans cette expérience) pour la limite basse par une inspection visuelle et la valeur maximale (1485) pour la limite supérieure, puis cliquez sur le bouton Terminer .
      REMARQUE: Une inspection visuelle signifie qu’un chercheur peut distinguer la zone cellulaire d’une image fluorescente brute.
   9. Ensuite, pour créer les points virtuels des véhicules électriques, cliquez sur le bouton Ajouter de nouveaux spots.
   10. Sélectionnez Différentes tailles de spot (croissance de la région) et Calcul de la distance la plus courte comme « Paramètres de l’algorithme », puis cliquez sur Suivant: Canal source.
   11. Sélectionnez Channel 1 - Alexa Fluor 488 comme « Canal source » dans cette expérience.
   12. Mettez la valeur appropriée dans « Diamètre XY estimé » pour la détection ponctuelle, 1 μm dans cette expérience. Ensuite, cliquez sur Suivant : Filtrer les spots.
   13. Pour configurer les points EV virtuels, cliquez sur le bouton + Ajouter , sélectionnez Qualité comme « Type de filtre » et définissez « Seuil inférieur » par une inspection visuelle, 100 dans cette expérience. Cliquez ensuite sur le bouton Suivant : Type de région spot .
   14. Sélectionnez Intensité absolue comme « Type de régions ponctuelles », puis cliquez sur Suivant: Régions ponctuelles.
   15. Pour seuilr, la région des points EV, mettre la valeur appropriée dans « Seuil de région » par une inspection visuelle, 100 comme « Seuil de région » dans cette expérience.
       REMARQUE: Une inspection visuelle signifie qu’un chercheur peut distinguer la zone des véhicules électriques d’une image fluorescente brute.
   16. Sélectionnez Volume de la région comme « Diamètre à partir de », puis cliquez sur Terminer.
3. Utilisez les algorithmes fournis par le logiciel pour diviser les points groupés à l’intérieur de la surface construite à l’étape 4.2 (Figure 4C, i-iv).
   1. Cliquez sur les spots générés, puis allez dans Filtres.
   2. Cliquez sur le bouton + Ajouter , puis sélectionnez Distance la plus courte par rapport aux surfaces Surfaces = Surface 1 comme Type de filtre, puis cliquez sur dupliquer la sélection vers le nouveau bouton Spots . Le seuil le plus bas (-7,0 dans cette expérience) pour la limite basse et la valeur appropriée (-0,5) pour la limite supérieure.
      REMARQUE: Définissez la limite supérieure avec le rayon estimé de Spots. Dans cette expérience, le diamètre estimé des taches, c’est-à-dire des points EV, a été fixé à 1 μm à l’étape 4.2.11. ainsi, la limite supérieure peut être de 0,5.
4. Comptage automatique des véhicules électriques à l’intérieur des cellules
   REMARQUE: Le logiciel comptera automatiquement le nombre de véhicules électriques à l’intérieur des cellules, indiquant le nombre internalisé par les cellules cibles.
   1. Cliquez sur la sélection Spots 1 construite [Distance la plus courte par rapport aux surfaces = Surfaces 1 comprises entre -7,00 et -0,500].
   2. Accédez aux statistiques et exportez la valeur de « Nombre total de spots »
      REMARQUE: Les algorithmes fournis par le logiciel calculeront automatiquement le nombre et le volume de cellules.
5. Déterminer le rendement d’absorption des VE par période d’incubation en fonction des valeurs calculées ci-dessus (Figure 5).
   1. Pour obtenir le nombre de cellules, cliquez sur les surfaces 1 générées, puis accédez aux statistiques et exportez la valeur de « Nombre total de surfaces » à partir de l’ensemble.
   2. Accédez à détaillé dans Statistiques pour exporter le volume à partir de Détaillé.

Résultats

À l’aide d’un dispositif microfluidique à base de nanofiltration, les VE ont été isolés du PC3 CCM et marqués avec un anticorps spécifique à l’EV conjugué au fluorophore (CD63) (Figure 1). Les véhicules électriques marqués ont été visualisés avec succès par la microscopie confocale 3D (Figure 2). Les VE marqués ont été incubés avec des cellules pendant plusieurs heures dans des milieux appauvris en exosomes. Après l’incubation, les c...

Discussion

Un test d’absorption EV basé sur l’imagerie par fluorescence 3D via la microscopie confocale fournit une méthodologie efficace et une analyse sensible. Cet étiquetage fluorescent des VE facilite la visualisation des VE et effectue avec succès un test d’absorption précis des VE. Des méthodes antérieures d’étiquetage des véhicules électriques et d’élimination du colorant résiduel ont été rapportées en éliminant les précipitations à l’aide de l’ultracentrifugation (CU); cependant, la...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 anti-human CD63 Antibody	Biolegend	353038	Fluorescent dye conjugated EV-specific antibody
CellTracker Orange CMTMR Dye	Thermo Fisher Scientific	C2927	Live cell (cytoplasm) fluoresent labeling reagent
CFI Apo Lambda S 40XC WI	Nikon	MRD77400	Objective for confocal imaging, NA=1.25
CFI Plan Apo VC 20X	Nikon	MRD70200	Objective for confocal imaging, NA=0.75
Exodisc	Labspinner Inc.	EX-D1001	A nano-filtration based microfluidic device for EV isolation
ExoDiscovery	Labspinner Inc.	EX-R1001	Operation device for Exodisc
Exosome-depleted FBS	Thermo Fisher Scientific	A2720801	Nutrient of cell culture media for PC3 cell line derived EV collection
Fetal bovine serum (FBS)	VWR	1500-500	Nutrient for cell cultivation
Goat Anti-Mouse IgG H&L preadsorbed	abcam	ab7063	Mouse IgG antibody for negatvie control of EV labeling
Ibidi USA U DISH μ-Dish 35 mm	Ibidi	81156	Culture dish for confocal imaging
Imaris 9.7.1	Oxford Instruments	9.7.1	Post-image processing software
Incubator System+ CO2/O2/N2 gas mixer	Live Cell Instrument	TU-O-20	Incubator system for live cell imaging
Nikon A1 HD25 / A1R HD25 camera	Nikon	NA	Camera for confocal imaging
Nikon Eclipse Ti microscope	Nikon	NA	Inverted microscope for confocal imaging
NIS-Elements AR 4.50.00	Nikon	4.50.00	Image processing software for Nikon microscope
NTA, NanoSight NS500	Malvern Panalytical	NS500	Measurement device for EV concentration
OriginPro 2020	OriginLab	9.7.0.185	Graphing software
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122	Antibiotics for cell cultivation
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	21875034	Cell culture media for PC3 cell line cultivation
SYTO RNASelect Green Fluorescent cell Stain - 5 mM Solution in DMSO	Thermo Fisher Scientific	S32703	RNA staining fluorescent dye for the EV labeling