Ensayo de captación de vesículas extracelulares mediante análisis de imágenes con microscopio confocal

Resumen

Las vesículas extracelulares (EV) contribuyen a la biología celular y las comunicaciones intercelulares. Existe la necesidad de ensayos prácticos para visualizar y cuantificar la absorción de EV por las células. El protocolo actual propone el ensayo de captación de EV mediante la utilización de imágenes de fluorescencia tridimensional a través de microscopía confocal, después del aislamiento de EV por un dispositivo microfluídico basado en nanofiltración.

Resumen

Existe la necesidad de ensayos prácticos para visualizar y cuantificar la absorción de vesículas extracelulares (EV) de las células. La absorción de EV juega un papel en la comunicación intercelular en varios campos de investigación; biología del cáncer, neurociencia y administración de fármacos. Muchos ensayos de captación de EV han sido reportados en la literatura; sin embargo, hay una falta de metodología experimental práctica y detallada. La absorción de EV se puede evaluar mediante el etiquetado fluorescente de EV para detectar su ubicación dentro de las células. Distinguir entre los EV internalizados en las células y los EV superficiales en las células es difícil, pero crítico, para determinar con precisión la absorción de EV. Por lo tanto, en este trabajo se propone un ensayo que cuantifica eficientemente la absorción de EV a través de la microscopía confocal de fluorescencia tridimensional (3D). Los EV marcados fluorescentemente se prepararon utilizando un dispositivo microfluídico basado en nanofiltración, visualizados por microscopía confocal 3D y luego analizados a través de un software avanzado de procesamiento de imágenes. El protocolo proporciona una metodología robusta para analizar los vehículos eléctricos a nivel celular y un enfoque práctico para un análisis eficiente.

Introducción

Las vesículas extracelulares (EV) son partículas de tamaño nanométrico unidas a la membrana lipídica que se clasifican por sus tamaños: ectosomas (100-500 nm) y exosomas (50-150 nm)¹. Los EV contienen varias biomoléculas, como proteínas, ácidos nucleicos y lípidos. Estas biomoléculas se originan en las células antes de ser encapsuladas como carga y liberadas en el espacio extracelular a través de ^EV1,2,3.

Debido a la variedad de su carga, se cree que los vehículos eléctricos desempeñan un papel activo en la comunicación intercelular. La liberación y captación de EV por las células permite la transferencia de biomoléculas entre las ^células4,5. La introducción de carga EV en una celda puede alterar las funciones y el estado homeostático de la célula receptora4,5,6. Los evs se internalizan a través de múltiples vías; sin embargo, los mecanismos exactos no se han demostrado con precisión.

La mayoría de los ensayos de captación de EV, como el etiquetado genético, etiquetan fluorescentemente los EV ^{individuales7}. La señal resultante se puede medir mediante fotómetro de microplacas, citometría de flujo o microscopía, y cada tecnología tiene limitaciones sustanciales. Los fotómetros de microplacas, la citometría de flujo o la microscopía bidimensional estándar (2D) no pueden distinguir entre EV internalizados y conectados ^{superficialmente8,9}. Además, la preparación de muestras necesaria para cada una de estas técnicas puede introducir problemas adicionales a la evaluación de la absorción de EV. Por ejemplo, levantar células adheridas con tripsina antes del análisis de captación de EV puede escindir algunos EV adheridos superficialmente en la superficie de la ^célula10,11. La tripsina también puede interactuar con la superficie celular, afectando el fenotipo celular y EV. Además, la tripsina puede no separar por completo los EV superficiales, sesgando las poblaciones aisladas.

Para etiquetar con precisión los EV con tintes fluorescentes, se requieren pasos de lavado adicionales para eliminar el tinte ^residual7. Las técnicas de aislamiento aceptadas también pueden contribuir a las señales falsas positivas debido a la coagulación que ocurre durante el aislamiento de EV. Por ejemplo, la ultracentrifugación en serie (UC) se usa ampliamente para aislar los vehículos eléctricos y eliminar el tinte inmovilizado. Sin embargo, la CU puede co-precipitar los EV, y el tinte residual puede conducir a una señal falsa ^{positiva12,13}. Otros métodos de nanofiltración, como la filtración basada en columnas, también se utilizan ampliamente para la eliminación de colorantes no inmovilizados. La naturaleza compleja de los EV y el tinte que interactúan dentro de la matriz de la columna puede conducir a la eliminación incompleta del tinte residual debido a que el corte molecular de la columna se altera por la entrada compleja14,15,16.

El protocolo actual propone un dispositivo microfluídico basado en nanofiltración para aislar y lavar vehículos eléctricos aislados marcados con fluorescencia. El dispositivo microfluídico basado en nanofiltración puede proporcionar una filtración eficiente a través de la tecnología de separación asistida por fluidos (FAST)^17,18. FAST reduce la caída de presión a través del filtro, reduciendo así la agregación potencial entre los vehículos eléctricos y los tintes. Al eliminar eficientemente el colorante residual, es posible mejorar la calidad de los EV marcados fluorescentemente y la especificidad del ensayo.

La microscopía confocal puede distinguir entre EV internalizados y unidos superficialmente en la superficie celular e investigar exhaustivamente los mecanismos celulares de la absorción de EV en una resolución espaciotemporal19,20,21,22,23,24,25. Por ejemplo, Sung et al. describieron la visualización del ciclo de vida del exosoma utilizando su reportero de células vivas desarrollado. La localización de los EVs internalizados fue detectada y analizada mediante un microscopio confocal en herramientas tridimensionales (3D) y de procesamiento ^{post-imagen20}. Aunque el tamaño de los EV pequeños (40-200 nm) está por debajo del límite de resolución del microscopio óptico, los EV marcados fluorescentemente se pueden detectar mediante microscopía confocal, ya que el fotodetector puede detectar la emisión de fluorescencia mejorada. Por lo tanto, la localización subcelular de los EV marcados fluorescentemente dentro de una célula se puede determinar con precisión mediante la adquisición de múltiples imágenes apiladas en z de los EV y los orgánulos celulares circundantes.

Además, la reconstrucción 3D y el procesamiento posterior a los datos pueden proporcionar más información sobre el posicionamiento de los vehículos eléctricos internalizados, superficiales y flotantes. Al utilizar estos procesos junto con las imágenes de células vivas de lapso de tiempo ofrecidas por la microscopía confocal, el nivel de absorción de EV se puede evaluar con precisión, y también es posible el seguimiento en tiempo real de la captación de EV. Además, el análisis del tráfico de EV se puede realizar utilizando microscopía confocal mediante la evaluación de la colocalización de evs con orgánulos, un primer paso para determinar cómo los EV internalizados están involucrados en la función intracelular. Este protocolo describe la metodología para realizar un ensayo de captación de EV utilizando el dispositivo microfluídico basado en nanofiltración17,26, microscopía confocal y análisis post-imagen.

Protocolo

1. Aislamiento ev y etiquetado EV inmunofluorente en chip

1. Recolección de medios de cultivo celular (MCC) y preprocesamiento de MCP para aislamiento de EV
   1. Semilla de células PC3 al 30% de confluencia en un matraz de cultivo celular de 75 ^cm2 . Permita que las células de control crezcan hasta un 90% de confluencia (~ 48 h) en medios estándar y suplementos específicos de la línea celular.
      NOTA: Para evitar que los componentes que contienen EV afecten la absorción celular (es decir, suero bovino fetal), use medios y suplementos agotados por exosomas.
   2. Cosechar el MCP.
   3. Centrifugue el CCM a 1000 x g durante 10 min a temperatura ambiente (RT) para granular cualquier celda no unida y escombros grandes cosechados con el medio. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo cónico.
   4. En el nuevo tubo, centrifugue el sobrenadante a 10.000 x g durante 20 min a 4 °C para granular los escombros más pequeños y los cuerpos apoptóticos que quedan en el medio. Algunos vehículos eléctricos más grandes se granularán. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo.
   5. Filtre el sobrenadante a través de un filtro de jeringa de membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) hidrófilo de 0,45 μm.
      NOTA: Si no procesa inmediatamente CCM para el aislamiento ev, guarde el CCM preprocesado a -80 °C hasta que se realice el aislamiento. Si está congelado, limite los ciclos de congelación-descongelación a uno.
2. Aislamiento ev de CCM utilizando un dispositivo microfluídico basado en nanofiltración
   1. Si está congelado, descongele completamente CCM y vórtice durante 30 s antes del paso 1.2.2.
   2. Inyectar 1 ml de MCC preprocesado (paso 1.1) en la cámara de muestra del dispositivo microfluídico basado en nanofiltración (ver Tabla de Materiales)^17,26.
      NOTA: Siga el procedimiento operativo estándar para el dispositivo microfluídico basado en nanofiltración17,26.
   3. Gire a 3000 rpm durante 10 minutos en la máquina de hilado de sobremesa (consulte la Tabla de materiales) para operar el dispositivo microfluídico.
      NOTA: Si CCM permanece en la cámara de muestra después de la ejecución inicial, realice giros adicionales hasta que todo CCM se haya vaciado de la cámara de muestra.
   4. Retire el líquido de la cámara de residuos mediante pipeteo y repita los pasos 1.2.1, 1.2.2 y 1.2.3 dos veces.
      NOTA: En total, se procesarán 3 ml de MCP para el aislamiento de EV.
   5. Inyecte 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) en la cámara de muestra para lavar los EV aislados. Gire en la máquina de hilado de sobremesa para operar el dispositivo microfluídico como se menciona en el paso 1.2.3. Localice los vehículos eléctricos puros en la membrana del dispositivo.
      NOTA: La calidad de los EV aislados del dispositivo microfluídico basado en nanofiltración, específicamente, fue confirmada y comparada con el método convencional de UC por microscopía electrónica de transmisión (TEM), microscopio electrónico de barrido (SEM), análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA), microscopía de iluminación estructurada, ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas y PCR en tiempo real en la investigación ^previa17,26.
3. Etiquetado inmunofluorescente de EV utilizando dispositivo microfluídico basado en nanofiltración (Figura 1)
   1. Seleccione un anticuerpo específico ev de acuerdo con el propósito del ensayo (consulte la Tabla de materiales).
      NOTA: Ciertos anticuerpos pueden interferir con los sitios de unión al ligando específicos de las vías de captación de EV (es decir, endocitosis).
   2. Inyecte 1 μg/ml del anticuerpo específico ev en el orificio de elución del dispositivo que contiene 100 μL de EV aislados.
   3. Incubar durante 1 h en la oscuridad a RT en un agitador de placas para garantizar la distribución uniforme del anticuerpo a través de la muestra.
   4. Coloque una cinta adhesiva en el orificio de elución. Inyecte 1 ml de PBS en la cámara de muestra para eliminar los anticuerpos residuales.
   5. Gire el dispositivo a 3000 rpm hasta que la cámara de muestra esté vacía. Retire cualquier fluido de la cámara de residuos mediante pipeteo. Inyecte 1 ml de PBS en la cámara de muestra.
      NOTA: Los evs marcados fluorescentemente se ubicarán en la cámara de membrana.
   6. Pipetear los EV marcados fluorescentemente (Figura 2) de la cámara de membrana a un tubo ámbar. Bloquear la luz hasta su uso.

2. Incubación de las células con EV marcados fluorescentemente para el ensayo de captación de EV

1. Se dirige a la siembra y cultivo de células en los platos compatibles con el cultivo celular.
   1. Sembra 1 x ¹⁰⁴ células PC3 en la placa microslide de 8 pocillos (9.4 x 10.7 mm para cada pozo) con 0.2 mL de medios o 4 x ¹⁰⁴ células PC3 en un plato de 35 mm con 1 mL de medios. Coloque las células en un plato compatible con el cultivo celular que consiste en una cubierta delgada (grosor: 0,18 mm).
      NOTA: El delgado coverslip minimiza la dispersión adversa de la luz.
   2. Permita que las células se adhieran durante la noche en condiciones óptimas de cultivo celular (37 °C, 5% de concentración de _CO2 , 90% de humedad).
   3. Lave las células adheridas dos veces con medios agotados de exosomas (descritos en el paso 1.1.1).
2. Incubación celular con EV marcados fluorescentemente.
   1. Mida la concentración de EV marcados fluorescentemente (paso 1.3.5) mediante análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA, Figura suplementaria 1). Determinar la concentración óptima de EV marcados fluorescentemente que se agregarán a las células cultivadas (paso 2.1.2.).
   2. Diluya los EV marcados fluorescentemente con medios agotados de exosomas para que coincidan con la concentración deseada medida en el paso 2.2.1. (es decir, 7,80 x ¹⁰⁹ EV (en valor NTA) en 200 μL de medios agotados por exosomas.)
   3. Añadir los EV diluidos (Paso 2.2.2) a las células diana adheridas preparadas en el punto 2.1.2. Incubar durante el tiempo experimental (es decir, 4, 8 o 12 h).
   4. Lave las células tres veces con medios libres de exosomas para eliminar cualquier EV no internalizado.
      NOTA: Opcional: Las celdas se pueden fijar después del lavado.
   5. Etiquetar el citoplasma de las células adheridas con 1 μg/mL de CMTMR ((5-(y-6)-((4-clorometil)benzoil)amino) tetrametilrodamina) (ver Tabla de Materiales) e incubar en condiciones óptimas de cultivo celular (37 °C, concentración de _CO2 al 5%, 90% de humedad).
      NOTA: Los colorantes del área celular deben fluorescencia por separado de los EV etiquetados para ayudar a determinar la ubicación espacial (internalizada o superficial) de los EV con picos durante el ensayo de absorción de EV.
   6. Lave las células marcadas dos veces con medios agotados de exosomas para eliminar el tinte residual. Agregue medios frescos agotados por exosomas a las células en preparación para imágenes confocales de células vivas.

3. Microscopía confocal

1. Para realizar imágenes de células vivas, utilice una incubadora en el escenario para mantener condiciones óptimas de cultivo celular (37 ° C, concentración de _CO2 del 5%, 90% de humedad).
2. Coloque las células preparadas en la incubadora en el escenario.
3. Establezca los parámetros de imagen en función de las muestras de control.
   NOTA: Las muestras de control sugeridas incluyen: EV marcados fluorescentemente solamente, células marcadas fluorescentemente, EV sin etiquetar y células no etiquetadas.
4. Determine la profundidad de las celdas de destino y el rango de tamaño de apilamiento en la dirección z para adquirir imágenes confocales 3D.
   NOTA: El grosor de una pila Z es de 1 μm. La adquisición de imágenes 3D confocales duró 2 min 34 s (cada adquisición de imágenes del plano Z tomó aproximadamente 8 s; un total de veinte imágenes de pila Z).
5. Establezca la adquisición de imágenes en múltiples imágenes apiladas en z de tinte específico de la célula (es decir, rojo) y tinte específico de EV (es decir, verde) simultáneamente (Figura 3 y Figura 4A).

4. Procesamiento de imágenes

1. Utilice un software de procesamiento automático de imágenes para analizar las imágenes confocales sin procesar apiladas en z y determinar la absorción de EV por las celdas (consulte la Tabla de materiales).
2. Establezca parámetros de umbral para la señal fluorescente de las células y los colorantes específicos de EV. Construir las superficies virtuales de las celdas (Figura 4A,B).
   1. Para crear las superficies virtuales de las celdas, haga clic en el botón Agregar nuevas superficies.
   2. Seleccione Cálculo de distancia más corta como "Configuración del algoritmo" para usar el algoritmo proporcionado por el software, luego haga clic en Siguiente: Canal de origen.
   3. Seleccione Canal 2 - CMTMR como "Canal de origen" en este experimento.
   4. Seleccione Suavizar y coloque el valor apropiado en "Detalle de superficies" para el alisado de superficies.
      NOTA: 0,57 μm en este experimento, ya que 1 píxel representa 0,57 μm en datos de imágenes sin procesar.
   5. Seleccione Intensidad absoluta como "Umbral".
   6. Para calcular automáticamente el umbral de la imagen fluorescente mediante el algoritmo proporcionado, haga clic en Umbral (intensidad absoluta): el valor se establece automáticamente.
   7. Seleccione Habilitar como "Dividir objetos táctiles (región de crecimiento)" y coloque el valor del tamaño estimado de la celda en "Diámetro de los puntos de semilla", 10,0 μm en este experimento. A continuación, haga clic en Siguiente: Filtrar puntos de semilla.
   8. Para configurar las superficies de celda virtual, haga clic en el botón + Agregar y, a continuación, seleccione Calidad como "Tipo de filtro". Umbral del valor apropiado (210 en este experimento) para el límite bajo mediante una inspección visual y el valor máximo (1485) para el límite superior, luego haga clic en el botón Finalizar .
      NOTA: Una inspección visual significa que un investigador puede discriminar el área celular de una imagen fluorescente en bruto.
   9. A continuación, para crear los puntos virtuales de los vehículos eléctricos, haga clic en el botón Agregar nuevos puntos.
   10. Seleccione Diferentes tamaños de punto (región de crecimiento) y Cálculo de distancia más corta como "Configuración del algoritmo" y, a continuación, haga clic en Siguiente: Canal de origen.
   11. Seleccione canal 1 - Alexa Fluor 488 como "canal de origen" en este experimento.
   12. Ponga el valor apropiado en "Diámetro XY estimado" para la detección de puntos, 1 μm en este experimento. A continuación, haga clic en Siguiente: Filtrar manchas.
   13. Para configurar los puntos EV virtuales, haga clic en el botón + Agregar , seleccione Calidad como "Tipo de filtro" y establezca "Umbral inferior" mediante una inspección visual, 100 en este experimento. A continuación, haga clic en el botón Siguiente: Detectar tipo de región .
   14. Seleccione Intensidad absoluta como "Tipo de regiones puntuales" y, a continuación, haga clic en Siguiente: Regiones de detección.
   15. Para el umbral, la región de los puntos EV, ponga el valor apropiado en "Umbral de región" mediante una inspección visual, 100 como "Umbral de región" en este experimento.
       NOTA: Una inspección visual significa que un investigador puede discriminar el área de EV de una imagen fluorescente en bruto.
   16. Seleccione Volumen de región como "Diámetro desde" y, a continuación, haga clic en Finalizar.
3. Utilice los algoritmos proporcionados por el software para dividir los puntos agrupados dentro de la superficie construida en el paso 4.2 (Figura 4C, i-iv).
   1. Haz clic en los Spots integrados y, a continuación, ve a Filtros.
   2. Haga clic en el botón + Agregar , seleccione Distancia más corta a superficies Superficies = Superficie 1 como Tipo de filtro y, a continuación, haga clic en el botón Duplicar selección a nuevos puntos . El umbral más bajo (-7,0 en este experimento) para el límite bajo y el valor apropiado (-0,5) para el límite superior.
      NOTA: Establezca el límite superior con el radio estimado de Manchas. En este experimento, el diámetro estimado de las manchas, es decir, los puntos EV, se estableció en 1 μm en el paso 4.2.11.; por lo tanto, el límite superior puede ser 0.5.
4. Recuento automático de vehículos eléctricos dentro de las celdas
   NOTA: El software contará automáticamente el número de EV dentro de las celdas, indicando el número internalizado por las celdas de destino.
   1. Haga clic en la selección Puntos 1 incorporados [Distancia más corta a superficies Superficies = Superficies 1 entre -7.00 y -0.500].
   2. Vaya a las Estadísticas y exporte el valor de "Número total de puntos"
      NOTA: Los algoritmos proporcionados por el software calcularán automáticamente el número y el volumen de celdas.
5. Determinar el rendimiento de la absorción de EV por período de incubación en función de los valores calculados anteriormente (Figura 5).
   1. Para obtener el número de celdas, haga clic en superficies 1 integradas, vaya a Estadísticas y exporte el valor de "Número total de superficies" desde General.
   2. Vaya a Detallado en Estadísticas para exportar el volumen desde Detallado.

Resultados

Utilizando un dispositivo microfluídico basado en nanofiltración, los EV se aislaron de PC3 CCM y se etiquetaron con un anticuerpo ev específico conjugado con fluoróforos (CD63) (Figura 1). Los EV etiquetados fueron visualizados con éxito por la microscopía confocal 3D (Figura 2). Los EV marcados se incubaron con células durante varias horas en medios agotados por exosomas. Después de la incubación, las células se lavaron con medios agotados de exosoma...

Discusión

Un ensayo de captación de EV basado en imágenes de fluorescencia 3D a través de microscopía confocal proporciona una metodología eficiente y un análisis sensible. Este etiquetado fluorescente EV facilita la visualización de evs y realiza con éxito un ensayo preciso de captación de EV. Se han notificado métodos anteriores para etiquetar los EV y eliminar el colorante residual mediante la eliminación de la precipitación mediante ultracentrifugación (CU); sin embargo, la CU puede co-precipitar los EV, ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 anti-human CD63 Antibody	Biolegend	353038	Fluorescent dye conjugated EV-specific antibody
CellTracker Orange CMTMR Dye	Thermo Fisher Scientific	C2927	Live cell (cytoplasm) fluoresent labeling reagent
CFI Apo Lambda S 40XC WI	Nikon	MRD77400	Objective for confocal imaging, NA=1.25
CFI Plan Apo VC 20X	Nikon	MRD70200	Objective for confocal imaging, NA=0.75
Exodisc	Labspinner Inc.	EX-D1001	A nano-filtration based microfluidic device for EV isolation
ExoDiscovery	Labspinner Inc.	EX-R1001	Operation device for Exodisc
Exosome-depleted FBS	Thermo Fisher Scientific	A2720801	Nutrient of cell culture media for PC3 cell line derived EV collection
Fetal bovine serum (FBS)	VWR	1500-500	Nutrient for cell cultivation
Goat Anti-Mouse IgG H&L preadsorbed	abcam	ab7063	Mouse IgG antibody for negatvie control of EV labeling
Ibidi USA U DISH μ-Dish 35 mm	Ibidi	81156	Culture dish for confocal imaging
Imaris 9.7.1	Oxford Instruments	9.7.1	Post-image processing software
Incubator System+ CO2/O2/N2 gas mixer	Live Cell Instrument	TU-O-20	Incubator system for live cell imaging
Nikon A1 HD25 / A1R HD25 camera	Nikon	NA	Camera for confocal imaging
Nikon Eclipse Ti microscope	Nikon	NA	Inverted microscope for confocal imaging
NIS-Elements AR 4.50.00	Nikon	4.50.00	Image processing software for Nikon microscope
NTA, NanoSight NS500	Malvern Panalytical	NS500	Measurement device for EV concentration
OriginPro 2020	OriginLab	9.7.0.185	Graphing software
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122	Antibiotics for cell cultivation
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	21875034	Cell culture media for PC3 cell line cultivation
SYTO RNASelect Green Fluorescent cell Stain - 5 mM Solution in DMSO	Thermo Fisher Scientific	S32703	RNA staining fluorescent dye for the EV labeling