공초점 현미경 화상 진찰 분석을 통해 세포외 소포 Uptake 분석

요약

세포 외 소포 (전기)는 세포 생물학 및 세포 간 통신에 기여합니다. 세포에 의한 전기자동차 의 섭취를 시각화하고 정량화하기 위한 실용적인 에세이의 필요성이 있다. 현재 프로토콜은 나노 여과 계 미세 유체 장치에 의한 EV 절연에 따라 공초점 현미경 검사를 통해 3차원 형광 이미징을 활용하여 EV uptake 분석법을 제안합니다.

초록

세포의 세포 외 소포 (EV) 섭취량을 시각화하고 정량화하기 위한 실용적인 에세이가 필요합니다. EV 섭취량은 다양한 연구 분야에서 세포간 통신에 중요한 역할을 합니다. 암 생물학, 신경 과학 및 약물 전달. 많은 EV 섭취량 은 문학에서 보고되었습니다. 그러나 실용적이고 상세한 실험 방법론이 부족합니다. EV 섭취량은 형광 라벨을 부착하여 세포 내의 위치를 감지하여 평가할 수 있습니다. 세포의 내이화 된 전기와 셀의 피상적 인 전기를 구별하는 것은 EV 섭취량을 정확하게 결정하는 것이 어렵지만 중요합니다. 따라서, 3차원(3D) 형광 공초점 현미경을 통해 EV 의 섭취를 효율적으로 정량화하는 분석이 이 작품에서 제안된다. 형광 라벨이 부착된 전기는 나노 여과 계 미세 유체 장치를 사용하여 제조되었으며, 3D 공초점 현미경검사법에 의해 시각화된 다음 고급 이미지 처리 소프트웨어를 통해 분석하였다. 이 프로토콜은 셀룰러 수준에서 전기를 분석하기 위한 강력한 방법론과 효율적인 분석을 위한 실용적인 접근 방식을 제공합니다.

서문

세포외 소포(EV)는 나노 크기의 지질 막 결합 입자로, 이독(100-500 nm) 및 엑소좀(50-150 nm)¹의 크기로 분류된다. 전기 는 단백질, 핵산 및 지질과 같은 다양한 생체 분자를 포함합니다. 이 생체 분자는 화물로 캡슐화 되고 EVs1,2,3을 통해 세포 외 공간으로 방출되기 전에 세포에서 유래합니다.

그들의 화물의 다양성때문에, 전기는 세포 간 통신에 적극적인 역할을 하는 것으로 여겨진다. 세포별 전기자동차의 방출 및 섭취^{는 세포 4,5} 사이의 생체 분자의 전달을 허용한다. 셀에 EV 화물을 도입하면 수신자 셀의 기능 및 근종 상태를 변경할 수 있습니다^4,5,6. 전기 자동차는 여러 경로를 통해 내면화됩니다. 그러나 정확한 메커니즘은 정확하게 입증되지 않았습니다.

유전 적 태깅, 형광 라벨 개별 ^EVs7과 같은 EV 섭취량 소의 대다수. 결과 신호는 마이크로 플레이트 광미터, 유동 세포측정법 또는 현미경 검사법으로 측정할 수 있으며 각 기술은 상당한 한계를 가지고 있습니다. 마이크로 플레이트 광계, 유동 세포측정, 또는 표준 2차원(2D) 현미경 검사는 내재및 피상적으로 부착된 ^EV8,9을 구별할 수 없다. 또한 이러한 각 기술에 필요한 샘플 준비는 EV uptake 평가에 추가 적인 문제를 야기할 수 있습니다. 예를 들어, EV 섭취량 분석 전에 트립신으로 부착된 셀을 리프팅하면 셀 표면에 일부 피상적으로 부착된 EV가 갈라질 수 있습니다^10,11. 트립신은 또한 세포 표면과 상호 작용할 수 있습니다., 세포 및 EV 표현형에 영향을 미치는. 또한 트립신은 피상적 인 전기 를 완전히 분리하여 격리 된 인구를 왜곡하지 않을 수 있습니다.

형광염염으로 전기자동차에 정확하게 라벨을 붙이려면 잔류 염료⁷을 제거하기 위해 추가 세척 단계가 필요합니다. 허용된 격리 기술은 EV 격리 중에 발생하는 응고로 인한 거짓 긍정 신호에도 기여할 수 있습니다. 예를 들어, 직렬 초원심분리(UC)는 널리 전기를 분리하고 고정된 염료를 제거하는 데 사용된다. 그러나, UC는 전기자동차를 공동 침전시킬 수 있으며, 잔류염은 거짓 양성 신호^12,13로 이어질 수 있다. 컬럼 계 여과와 같은 다른 나노 여과 방법도 비 고정 염료 제거에 널리 사용됩니다. 컬럼 매트릭스 내에서 상호 작용하는 전기 및 염료의 복잡한 특성은 복잡한 입력^14,15,16에 의해 변경되는 컬럼의 분자 차단으로 인해 잔류 염료의 불완전한 제거로 이어질 수 있다.

현재 프로토콜은 형광 으로 표시된 절연 된 전기 를 분리하고 세척하기 위해 나노 여과 기반 의 미세 유체 장치를 제안합니다. 나노 여과 기반 의 미세 유체 장치는 유체 보조 분리 기술 (FAST)^17,18을 통해 효율적인 여과를 제공 할 수 있습니다. FAST는 필터 전체의 압력 강하를 줄여 EV와 염료 간의 잠재적 집계를 줄입니다. 잔류 염료를 효율적으로 제거함으로써 형광라벨이 부착된 EV의 품질과 분석의 특이성을 향상시킬 수 있습니다.

공초점 현미경 검사는 세포 표면에 내재화 및 피상적으로 부착된 EV를 구별하고 지각 측량 해상도^{19,20,21,22,23,24,25}에서 EV 섭취량의 세포 메커니즘을 포괄적으로 조사할 수 있다. 예를 들어, Sung et al.은 개발된 라이브 셀 리포터를 사용하여 엑소솜 라이프사이클의 시각화를 설명했습니다. 내부화된 전기자동차의 위치는 공초점 현미경을 3차원(3D) 및 후이미지 처리 툴²⁰으로 검출및 분석하였다. 소형 전기자동차(40-200nm)의 크기는 광학 현미경의 해상도 한계 미만이지만, 광검출기가 향상된 형광 방출을 감지할 수 있기 때문에 형광표시 전기자동차는 공초점 현미경으로 검출될 수 있다. 따라서, 세포 내형 표지된 전기자동차의 세포세포 소중화는 전기자동차와 주변 세포 기관의 여러 z-stacked 이미지를 획득함으로써 정확하게 결정될 수 있다.

또한 3D 재구성 및 사후 데이터 처리는 내부화, 피상적 및 자유 부동 EV의 위치에 대한 추가 통찰력을 제공할 수 있습니다. 공초점 현미경 검사법에 의해 제공되는 시간 경과 라이브 셀 이미징과 함께 이러한 프로세스를 활용하여 EV 섭취량의 수준을 정확하게 평가할 수 있으며 EV 섭취량의 실시간 추적도 가능합니다. 또한, EV 인신 매매 분석은 세포내 기능에 내재된 전기자동차가 어떻게 관여하는지 결정하는 첫 번째 단계인 세포기관과 함께 전기자동차의 공동 국소화를 평가함으로써 공초점 현미경을 사용하여 수행될 수 있다. 이 프로토콜은 나노 여과 계 미세 유체 장치^17,26, 공초점 현미경 검사법 및 사후 이미지 분석을 사용하여 EV 섭취량 분석을 수행하는 방법론을 설명합니다.

프로토콜

1. EV 절연 및 온칩 면역 형광 EV 라벨링

1. EV 절연을 위한 세포 배양 매체(CCM) 및 CCM의 사전 처리
   1. 종자 PC3 세포는 ^75cm2 세포 배양 플라스크에서 30% 합류한다. 제어 세포가 표준 미디어 및 세포 선별 보충제에서 90%의 합류(~48h)로 증가하도록 허용합니다.
      참고: EV 함유 성분이 세포 섭취(즉, 태아 소 혈청)에 영향을 미치지 않도록 하려면 외성 고갈된 미디어와 보충제를 사용하십시오.
   2. CCM을 수확하십시오.
   3. CCM을 실온(RT)에서 10 분 동안 10분 동안 원심분리하여 부착되지 않은 세포와 미디어로 수확한 큰 파편을 펠렛합니다. 상체를 새로운 원식 튜브로 옮는다.
   4. 새로운 튜브에서, 원심 분리는 미디어에 남아있는 작은 파편과 자멸 체를 펠릿4 °C에서 20 분 동안 10,000 x g 에서 상류체를 분리합니다. 일부 더 큰 전기 자동차는 펠릿 것입니다. 상체를 새 튜브로 옮기습니다.
   5. 0.45 μm 수성 소수성 폴리비닐리덴 불소(PVDF) 멤브레인 주사기 필터를 통해 상체를 필터링합니다.
      참고: EV 절연을 위해 CCM을 즉시 처리하지 않을 경우, 격리가 수행될 때까지 미리 처리된 CCM을 -80°C에 저장합니다. 동결된 경우 동결 해동 주기를 하나로 제한합니다.
2. 나노 여과 기반 미세 유체 장치를 사용하여 CCM에서 EV 절연
   1. 동결된 경우 1.2.2단계 전에 CCM및 소용돌이를 30초로 완전히 해동합니다.
   2. 나노 여과 계 미세 유체 장치의 샘플 챔버에 미리 처리 된 CCM (1.1 단계)의 1 mL을 주입 (재료의 표 참조)^17,26.
      참고: 나노 여과 계 미세 유체 장치에 대한 표준 작동 절차를 따르십시오^17,26.
   3. 3000 rpm에서 10분 동안 벤치 탑 방적 기계( 재료 표 참조)에서 미세 유체 장치를 작동시킵니다.
      참고: CCM이 초기 실행 후 샘플 챔버에 남아 있는 경우 모든 CCM이 샘플 챔버에서 비워지때까지 추가 회전을 수행합니다.
   4. 파이프팅을 통해 폐기물 챔버에서 유체를 제거하고 1.2.1, 1.2.2 및 1.2.3 단계를 두 번 반복합니다.
      참고: EV 격리를 위해 총 3mL의 CCM이 처리됩니다.
   5. 1mL 인산염 완충식식염(PBS)을 샘플 챔버에 주입하여 격리된 전기를 세척합니다. 1.2.3 단계에서 언급한 바와 같이 미세 유체 장치를 작동하기 위한 벤치 탑 방적 기계에서 회전하십시오. 장치의 멤브레인에서 순수 한 전기 를 찾습니다.
      참고: 나노 여과 계 미세 유체 장치로부터 분리된 전기의 품질, 구체적으로는 전염 전자 현미경(TEM), 스캐닝 전자 현미경(SEM), 나노 입자 추적 분석(NTA), 구조화된 조명 현미경 검사, 효소-연결된 면역제 분석 및 실시간 PCR^에 의해 종래의 UC 방법과 비교하여 확인되었다.
3. 나노 여과 기반 미세 유체 장치를 사용하여 EV의 면역 형광 라벨링 (도 1)
   1. 분석의 목적에 따라 EV 특이적 항체를 선택 합니다(재료표 참조).
      참고: 특정 항체는 EV-uptake 통로(즉, 내세포증)에 특정한 리간드 결합 부위를 방해할 수 있다.
   2. 절연 된 전기 의 100 μL을 포함하는 장치의 용출 구멍에 EV 특이적 항체의 1 μg /mL을 주입합니다.
   3. 플레이트 셰이커에서 RT에서 어둠 속에서 1h를 배양하여 시료를 가로질러 항체의 균일한 분포를 보장합니다.
   4. 용출 구멍에 접착제 테이프를 부착합니다. 1mL PBS를 샘플 챔버에 주입하여 잔류 항체를 씻어내도록 한다.
   5. 샘플 챔버가 비어 날 때까지 장치를 3000 rpm에서 회전합니다. 파이펫팅을 통해 폐기물 챔버에서 유체를 제거합니다. 샘플 챔버에 1 mL PBS를 주입합니다.
      참고: 형광 표시 된 전기 는 멤브레인 챔버에 위치합니다.
   6. 피펫은 멤브레인 챔버에서 호박색 튜브로 형광 표시 된 전기 자동차 (그림 2)를 피펫. 사용까지 빛에서 차단합니다.

2. EV-uptake 분석에 대한 형광 라벨 이드 EV를 가진 세포의 인큐베이션

1. 세포 배양 호환 접시에 세포 종자 및 배양을 대상으로 합니다.
   1. 종자 1 x ¹⁰⁴ PC3 셀 마이크로 슬라이드 8 웰 플레이트 (각 우물에 대 한 9.4 x 10.7 mm) 와 함께 0.2 mL 미디어 또는 4 x ¹⁰⁴ PC3 셀 35 mm 접시에 1 mL 미디어. 얇은 커버슬립(두께: 0.18mm)으로 구성된 세포 배양 호환 접시에 세포를 플레이트한다.
      참고: 얇은 커버슬립은 빛의 불리한 산란을 최소화합니다.
   2. 세포가 최적의 세포 배양 조건(37°C, 5% _CO2 농도, 습도 90%)에서 하룻밤 동안 부착할 수 있도록 합니다.
   3. 부착된 세포를 외성 고갈 된 매체로 두 번 세척하십시오 (1.1.1 단계에서 설명됨).
2. 형광 라벨이 부착된 전기 를 가진 세포 잠복기.
   1. 나노입자 추적 분석(NTA, 보충도 1)에 의한 형광 표지 된 전기 자동차 (단계 1.3.5)의 농도를 측정합니다. 배양된 세포에 첨가할 형광표지 EV의 최적 농도를 결정한다(단계 2.1.2.).
   2. 2.2.1 단계에서 측정된 원하는 농도에 맞게 형광라벨이 부착된 전기를 외성 고갈된 매체로 희석시켰다. (즉, 외종 고갈 된 미디어의 200 μL에서 7.80 x ¹⁰⁹ EV (NTA 값).
   3. 2.1.2에서 제조된 부착된 표적 셀에 희석된 전기자동차(2.2.2단계)를 추가한다. 실험 시간(예: 4, 8 또는 12h)을 위해 배양합니다.
   4. 세포는 외성 이없는 매체로 세 번 씻어 내면화되지 않은 전기 를 제거합니다.
      참고: 선택 사항: 세척 후 셀을 고정할 수 있습니다.
   5. CMTMR의 1 μg/mL((5-(및-6)-((4-클로로메틸)벤조딘)의 아미노)를 부착한 세포의 세포질에 라벨을 부착하고 최적의 세포 배양 조건(37°C, 5% _CO2 농도, 90%의 습도)에서 배양한다.
      참고: 세포 영역 염료는 EV 섭취량 분석 중에 스파이크 된 EV의 공간 위치 (내부 화 또는 피상적)를 결정하는 데 도움이되기 위해 레이블이 부착 된 전기 와 별도로 형광해야합니다.
   6. 잔류 염료를 제거하기 위해 외성 고갈 된 매체로 두 번 표지 된 세포를 씻으면. 살아있는 세포 공초점 화상 진찰을 위한 준비에 있는 세포에 신선한 엑소좀 고갈된 매체를 추가합니다.

3. 공초점 현미경 검사법

1. 라이브 셀 이미징을 수행하려면 단계별 인큐베이터를 활용하여 최적의 세포 배양 조건(37°C, 5% _CO2 농도, 습도 90%)을 유지합니다.
2. 준비된 셀을 단계 인큐베이터에 놓습니다.
3. 제어 샘플을 기반으로 이미징 매개 변수를 설정합니다.
   참고: 제안된 대조군 샘플은 다음과 같습니다: 형광 표지된 전기 전용, 형광 표시 셀, 라벨이 없는 전기 자동차 및 표지되지 않은 세포.
4. 3D 공초점 이미지를 획득하기 위해 대상 셀의 깊이와 z 방향으로 스태킹 크기 범위를 결정합니다.
   참고: Z 스택의 두께는 1 μm입니다. 공초점 3D 이미지 수집은 2분 34초(각 Z-평면 이미지 수집은 약 8s, 총 20개의 Z 스택 이미지)를 지속했습니다.
5. 셀 별 염료(즉, 빨간색) 및 EV 특이적 염료(즉, 녹색)의 여러 z 스택 이미지로 이미지 수집을 동시에 설정합니다(그림 3 및 도 4A).

4. 이미지 처리

1. 자동 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 원시 z 스택 된 공초점 이미지를 분석하고 셀별 EV 조리를 결정합니다 ( 재료 표 참조).
2. 세포 및 EV 특이적 염료의 형광 신호로 임계값 매개변수를 설정합니다. 셀의 가상 표면을 빌드합니다(그림 4A,B).
   1. 셀의 가상 표면을 빌드하려면 새 Surface를 추가하는 단추를 클릭합니다.
   2. 소프트웨어에서 제공된 알고리즘을 사용하여 "알고리즘 설정"으로 최단 거리 계산 을 선택한 다음 : 소스 채널을 클릭합니다.
   3. 이 실험에서 채널 2 - CMTMR 을 "소스 채널"로 선택합니다.
   4. 매끄럽게 선택하고 적절한 값을 표면 스무딩을 위해 "표면 세부 사항"에 넣습니다.
      참고: 이 실험에서 0.57 μm은 1픽셀 이후 원시 이미징 데이터에서 0.57 μm을 나타낸다.
   5. 절대 강도를 "임계값"으로 선택합니다.
   6. 제공된 알고리즘에 의해 형광 이미지를 자동으로 임계값을 설정하려면 임계값(절대 강도)을 클릭합니다.
   7. "분할 접촉 객체(영역 성장)"로 사용하려면 이 실험에서 추정 셀 크기의 값을 "시드 포인트 직경"에 10.0 μm로 넣습니다. 그런 다음 을 클릭합니다: 시드 포인트를 필터링합니다.
   8. 가상 셀 표면을 구성하려면 버튼을 클릭한 다음 품질을 "필터 유형"으로 선택합니다. 육안 검사에 의해 낮은 제한에 대한 적절한 값(210)과 상한에 대한 최대 값(1485)을 임계값으로 임계값을 정한 다음 완료 단추를 클릭 합니다 .
      참고: 육안 검사는 연구원이 원시 형광 이미지에서 세포 영역을 구별할 수 있음을 의미합니다.
   9. 다음으로, EV의 가상 점을 구축하려면 버튼을 클릭하여 새 스팟 추가를 클릭합니다.
   10. 다른 스팟 크기(영역 증가) 및 최단 거리 계산을 "알고리즘 설정"으로 선택한 다음: 소스 채널을 클릭합니다.
   11. 채널 1선택 - 알렉사 플루어 488을 이 실험에서 "소스 채널"로 선택합니다.
   12. 이 실험에서 현물 검출을 위한 "추정 된 XY 직경 "에 적절한 값을 넣습니다. 그런 다음 다음을 클릭합니다: 반점을 필터링합니다.
   13. 가상 EV 점을 구성하려면 버튼을 클릭하고 품질을 "필터 유형"으로 선택하고 육안으로 검사하여 "낮은 임계값 "을 설정 합니다. 그런 다음 : 스팟 리전 유형 단추를 클릭합니다.
   14. 절대 강도를 "스팟 리전 유형"으로 선택한 다음: 스팟 리전을 클릭합니다.
   15. 임계값에 따라 EV 점 영역은 육안으로 검사하여 적절한 값을 "지역 임계값"에 넣고 100 을 이 실험에서 "지역 임계값"으로 설정합니다.
       참고: 육안 검사는 연구원이 원시 형광 이미지에서 EV 영역을 구별할 수 있음을 의미합니다.
   16. 지역 볼륨을 "직경에서"로 선택한 다음 마무리를 클릭합니다.
3. 소프트웨어의 제공된 알고리즘을 사용하여 4.2단계에서 내장된 표면 내부의 그룹화 된 스팟을 분할합니다(그림 4C, i-iv).
   1. 내장된 스팟을 클릭한 다음 필터로 이동 합니다.
   2. 클릭 + 추가 버튼을 클릭한 다음 표면 표면에 가장 짧은 거리를 선택한 다음 표면 1을 필터 유형으로 선택한 다음 중복 선택을 새 스팟 버튼으로 클릭합니다. 낮은 제한에 대한 최저 임계값(-7.0)과 상한에 대한 적절한 값(-0.5)입니다.
      참고: 스팟의 예상 반지름으로 상한을 설정 합니다. 이 실험에서, 스팟의 추정 직경, 즉, EV 점, 단계 4.2.11에서 1 μm 로 설정되었다. 따라서 상한은 0.5일 수 있다.
4. 셀 내부의 자동 전기 자동차 수
   참고: 소프트웨어는 셀 내부의 전기 자동차 수를 자동으로 계산하여 대상 셀에 의해 내부화된 숫자를 나타냅니다.
   1. 구축된 스팟 1 선택 영역을 클릭합니다[서피스에 대한 가장 짧은 거리 = -7.00과 -0.500 사이의 서피스 1]을 클릭합니다.
   2. 통계로 이동하여 "총 반점 수"에서 값을 내보냅니다.
      참고: 소프트웨어가 제공한 알고리즘은 셀의 수와 볼륨을 자동으로 계산합니다.
5. 위에서 계산한 값에 따라 인큐베이션 기간당 EV 섭취량의 수익률을 결정합니다(그림 5).
   1. 셀 수를 얻으려면 빌드된 Surfaces 1을 클릭한 다음 통계로 이동하여 전체에서 "총 표면 수"의 값을 내보냅니다.
   2. 자세한 통계로 세부으로 이동하여 세부에서 볼륨을 내보냅니다.

결과

나노 여과 계 미세 유체 장치를 사용하여, 전기는 PC3 CCM에서 분리되고 불소 -컨쥬게이트 EV 특이적 (CD63) 항체로 표시되었다 (도 1). 표지된 EV는 3D 공초점 현미경 검사법(그림 2)에 의해 성공적으로 시각화되었습니다. 표지된 전기 는 엑소좀 고갈된 매체에서 몇 시간 동안 세포로 배양되었다. 배양 후, 세포는 엑소좀 고갈된 매체로 세척하였다. 나머지 EV는...

토론

공초점 현미경 검사를 통한 3D 형광 이미징을 기반으로 하는 EV 섭취 분석법은 효율적인 방법론과 민감한 분석을 제공합니다. 이 형광 EV 라벨링은 EV의 시각화를 용이하게 하고 정확한 EV 업테이크 분석기를 성공적으로 수행합니다. EV 라벨링 및 잔류 염료 를 제거하기위한 이전 방법은 초음파 심립분리 (UC)를 사용하여 침전을 제거하여보고되었습니다. 그러나, UC는 전기자동차를 공동 침전시?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 anti-human CD63 Antibody	Biolegend	353038	Fluorescent dye conjugated EV-specific antibody
CellTracker Orange CMTMR Dye	Thermo Fisher Scientific	C2927	Live cell (cytoplasm) fluoresent labeling reagent
CFI Apo Lambda S 40XC WI	Nikon	MRD77400	Objective for confocal imaging, NA=1.25
CFI Plan Apo VC 20X	Nikon	MRD70200	Objective for confocal imaging, NA=0.75
Exodisc	Labspinner Inc.	EX-D1001	A nano-filtration based microfluidic device for EV isolation
ExoDiscovery	Labspinner Inc.	EX-R1001	Operation device for Exodisc
Exosome-depleted FBS	Thermo Fisher Scientific	A2720801	Nutrient of cell culture media for PC3 cell line derived EV collection
Fetal bovine serum (FBS)	VWR	1500-500	Nutrient for cell cultivation
Goat Anti-Mouse IgG H&L preadsorbed	abcam	ab7063	Mouse IgG antibody for negatvie control of EV labeling
Ibidi USA U DISH μ-Dish 35 mm	Ibidi	81156	Culture dish for confocal imaging
Imaris 9.7.1	Oxford Instruments	9.7.1	Post-image processing software
Incubator System+ CO2/O2/N2 gas mixer	Live Cell Instrument	TU-O-20	Incubator system for live cell imaging
Nikon A1 HD25 / A1R HD25 camera	Nikon	NA	Camera for confocal imaging
Nikon Eclipse Ti microscope	Nikon	NA	Inverted microscope for confocal imaging
NIS-Elements AR 4.50.00	Nikon	4.50.00	Image processing software for Nikon microscope
NTA, NanoSight NS500	Malvern Panalytical	NS500	Measurement device for EV concentration
OriginPro 2020	OriginLab	9.7.0.185	Graphing software
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122	Antibiotics for cell cultivation
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	21875034	Cell culture media for PC3 cell line cultivation
SYTO RNASelect Green Fluorescent cell Stain - 5 mM Solution in DMSO	Thermo Fisher Scientific	S32703	RNA staining fluorescent dye for the EV labeling