Extrazellulärer Vesikelaufnahme-Assay mittels konfokaler Mikroskop-Bildgebungsanalyse

Zusammenfassung

Extrazelluläre Vesikel (EVs) tragen zur Zellbiologie und interzellulären Kommunikation bei. Es besteht ein Bedarf an praktischen Assays, um die Aufnahme von Elektrofahrzeugen durch die Zellen zu visualisieren und zu quantifizieren. Das aktuelle Protokoll schlägt den EV-Aufnahmeassay vor, indem eine dreidimensionale Fluoreszenzbildgebung mittels konfokaler Mikroskopie verwendet wird, nachdem die EV-Isolierung durch ein mikrofluidisches Gerät auf Nanofiltrationsbasis erfolgt.

Zusammenfassung

Es besteht ein Bedarf an praktischen Assays, um die extrazelluläre Vesikelaufnahme (EV) der Zellen zu visualisieren und zu quantifizieren. Die Aufnahme von Elektrofahrzeugen spielt eine Rolle bei der interzellulären Kommunikation in verschiedenen Forschungsbereichen; Krebsbiologie, Neurowissenschaften und Arzneimittelabgabe. Viele EV-Aufnahmeassays wurden in der Literatur berichtet; Es fehlt jedoch an einer praktischen, detaillierten experimentellen Methodik. Die EV-Aufnahme kann durch fluoreszierende Markierung von EVs beurteilt werden, um ihre Position in Zellen zu erkennen. Die Unterscheidung zwischen internalisierten EVs in Zellen und den oberflächlichen EVs auf Zellen ist schwierig, aber kritisch, um die EV-Aufnahme genau zu bestimmen. Daher wird in dieser Arbeit ein Assay vorgeschlagen, der die EV-Aufnahme durch dreidimensionale (3D) Fluoreszenz-Konfokalmikroskopie effizient quantifiziert. Fluoreszenzmarkierte EVs wurden mit einem auf Nanofiltration basierenden mikrofluidischen Gerät hergestellt, durch konfokale 3D-Mikroskopie visualisiert und dann durch fortschrittliche Bildverarbeitungssoftware analysiert. Das Protokoll bietet eine robuste Methodik für die Analyse von Elektrofahrzeugen auf zellulärer Ebene und einen praktischen Ansatz für eine effiziente Analyse.

Einleitung

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind nanogroße, lipidmembrangebundene Partikel, die nach ihren Größen kategorisiert werden: Ektosomen (100-500 nm) und Exosomen (50-150 nm)¹. EVs enthalten verschiedene Biomoleküle wie Proteine, Nukleinsäuren und Lipide. Diese Biomoleküle stammen aus den Zellen, bevor sie als Fracht eingekapselt und über EVs in den extrazellulären Raum freigesetzt ^werden1,2,3.

Aufgrund der Vielfalt ihrer Ladung wird angenommen, dass Elektrofahrzeuge eine aktive Rolle in der interzellulären Kommunikation ....

Protokoll

1. EV-Isolierung und On-Chip-Immunfluoreszenz-EV-Markierung

1. Sammlung von Zellkulturmedien (CCM) und Vorverarbeitung von CCM zur EV-Isolierung
   1. Seed PC3-Zellen bei 30% Konfluenz in einem 75 ^cm2 Zellkulturkolben. Lassen Sie Die Kontrollzellen in Standardmedien und zelllinienspezifischen Nahrungsergänzungsmitteln auf 90% Konfluenz (~ 48 h) wachsen.
      HINWEIS: Um zu verhindern, dass EV-haltige Komponenten die zelluläre Aufnahme beeinflussen (z. B. fötales Rinderserum), verwenden Sie exosomenarme Medien und Nahrungsergänzungsmittel.
   2. Ernten Sie das CCM.
   3. Zentrifugieren Sie das CCM bei 1000 x g für 10 min bei Raumtem....

Ergebnisse

Unter Verwendung eines mikrofluidischen Geräts auf Nanofiltrationsbasis wurden EVs aus PC3 CCM isoliert und mit einem fluorophorkonjugierten EV-spezifischen (CD63) Antikörper markiert (Abbildung 1). Die markierten EVs wurden erfolgreich durch die konfokale 3D-Mikroskopie visualisiert (Abbildung 2). Die markierten EVs wurden mehrere Stunden lang mit Zellen in Exosomen-depletierten Medien inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen mit Exosomen-depletierten.......

Diskussion

Ein EV-Aufnahmeassay, der auf 3D-Fluoreszenzbildgebung mittels konfokaler Mikroskopie basiert, bietet eine effiziente Methodik und empfindliche Analyse. Diese fluoreszierende EV-Markierung erleichtert die Visualisierung von Elektrofahrzeugen und führt erfolgreich einen präzisen EV-Aufnahmeassay durch. Frühere Methoden zur Kennzeichnung von Elektrofahrzeugen und zur Entfernung des Restfarbstoffs wurden durch Entfernen der Fällung mittels Ultrazentrifugation (UC) berichtet; UC kann jedoch EVs mitausfällen, un.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 anti-human CD63 Antibody	Biolegend	353038	Fluorescent dye conjugated EV-specific antibody
CellTracker Orange CMTMR Dye	Thermo Fisher Scientific	C2927	Live cell (cytoplasm) fluoresent labeling reagent
CFI Apo Lambda S 40XC WI	Nikon	MRD77400	Objective for confocal imaging, NA=1.25
CFI Plan Apo VC 20X	Nikon	MRD70200	Objective for confocal imaging, NA=0.75
Exodisc	Labspinner Inc.	EX-D1001	A nano-filtration based microfluidic device for EV isolation
ExoDiscovery	Labspinner Inc.	EX-R1001	Operation device for Exodisc
Exosome-depleted FBS	Thermo Fisher Scientific	A2720801	Nutrient of cell culture media for PC3 cell line derived EV collection
Fetal bovine serum (FBS)	VWR	1500-500	Nutrient for cell cultivation
Goat Anti-Mouse IgG H&L preadsorbed	abcam	ab7063	Mouse IgG antibody for negatvie control of EV labeling
Ibidi USA U DISH μ-Dish 35 mm	Ibidi	81156	Culture dish for confocal imaging
Imaris 9.7.1	Oxford Instruments	9.7.1	Post-image processing software
Incubator System+ CO2/O2/N2 gas mixer	Live Cell Instrument	TU-O-20	Incubator system for live cell imaging
Nikon A1 HD25 / A1R HD25 camera	Nikon	NA	Camera for confocal imaging
Nikon Eclipse Ti microscope	Nikon	NA	Inverted microscope for confocal imaging
NIS-Elements AR 4.50.00	Nikon	4.50.00	Image processing software for Nikon microscope
NTA, NanoSight NS500	Malvern Panalytical	NS500	Measurement device for EV concentration
OriginPro 2020	OriginLab	9.7.0.185	Graphing software
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122	Antibiotics for cell cultivation
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	21875034	Cell culture media for PC3 cell line cultivation
SYTO RNASelect Green Fluorescent cell Stain - 5 mM Solution in DMSO	Thermo Fisher Scientific	S32703	RNA staining fluorescent dye for the EV labeling