通过选择性核糖体分析对共翻译相互作用网络进行全局鉴定

摘要

共转化相互作用在新生链修饰，靶向，折叠和组装途径中起着至关重要的作用。在这里，我们描述了选择性核糖体分析，这是一种 体内直接分析真核生物酿酒 酵母模型中这些相互作用的方法。

摘要

近年来，很明显，核糖体不仅可以解码我们的mRNA，还可以引导多肽链进入拥挤的细胞环境。核糖体为膜靶向因子、修饰酶和折叠伴侣的空间和动力学控制结合提供了平台。最近，甚至将组装成高阶低聚物复合物以及蛋白质 - 蛋白质网络形成步骤也被发现与合成相协调。

在这里，我们描述了选择性核糖体分析，这是一种为捕获 体内共翻译相互作用而开发的方法。我们将详细介绍捕获核糖体 - 新生链复合物以及共翻译相互作用物所需的各种亲和纯化步骤，以及以近密码子分辨率破译共翻译相互作用所需的mRNA提取，大小排阻，逆转录，深度测序和大数据分析步骤。

引言

Selective Ribosome Profiling（SeRP）是迄今为止唯一一种在体内以直接方式捕获和表征体内共翻译相互作用的方法^1，2，^{3，4，5，6}。SeRP能够以近密码子分辨率^2，7对任何因子与翻译核糖体的相互作用进行全局分析。

该方法依赖于生长细胞的快速冷冻和保留活性翻译。然后用RNase I处理细胞裂解物以消化细胞中的所有mRNA，除了被称为"核糖体足迹"的核糖体保护的mRNA片段。然后将样品分成两部分;一部分直接用于分离所有细胞核糖体足迹，代表细胞中所有正在进行的翻译。第二部分用于与感兴趣因子相关的核糖体特定子集的亲和纯化，例如:修饰酶，易位因子，折叠伴侣和复合物组装相互作用。亲和纯化的核糖体足迹统称为相互作用组。然后，提取受核糖体保护的mRNA并用于cDNA文库的生成，然后进行深度测序。

对总翻译组和相互作用组样本的比较分析可以识别与目标因子相关的所有 orfs ，以及表征每个 orf 相互作用曲线。该图谱报告了精确的参与开始和终止序列，从中可以推断出解码的密码子和新兴多肽链的各自残基，以及相互作用过程中的核糖体速度变化^7，8。 图1 将协议描述为原理图。

图 1:SeRP 协议概述。 该协议可以在7-10天内完整执行。 请点击此处查看此图的大图。

研究方案

1. 生成用于选择性核糖体分析的菌株

注意: Selective Ribosome Profiling（SeRP）是一种依赖于感兴趣因子的亲和力纯化来评估它们与核糖体 - 新生链复合物的相互作用模式的方法。利用同源重组⁹以及基于CRISPR / Cas9¹⁰ 的方法将各种感兴趣的因素与标签融合在一起以进行亲和力纯化。这些标签是GFP，用于GFP-trap亲和力纯化，TAP标签用于IgG-Sepharose珠子纯化以及由亲和素或链霉亲和素纯化的AVI标签，以列出近年来的一些成功例子。

1. 执行生长或功能测定，以验证标记是否不影响蛋白质功能。应评估 N' 与 C' 终端标记。
   注意:核糖体（rRNA）以及各种因素中的许多核糖体结合结构域具有高电荷，使得高电荷标签（如多组氨酸）无法使用，因为它可能导致错误发现或改变结合模式。

2. 文化成长

1. 在富含液体酵母提取物蛋白胨胨葡萄糖（YPD）的培养基中，或在合成葡萄糖（SD）最小培养基（1.7 g / L酵母氮碱与硫酸铵或1.7 g / L酵母氮碱，不含硫酸铵，1 g / L谷氨酸单钠，2%葡萄糖并补充完整或适当的氨基酸混合物）中培养含有所需标记蛋白质的构建酵母培养物（基于菌株BY4741）。
2. 在适当的培养基中将250-500mL细胞培养物在₃₀ °C下生长至0.5 OD 600（中对数）。

3. 细胞采集和裂解

1. 通过真空过滤在带有玻璃过滤系统的0.45μm硝酸纤维素吸墨膜上真空过滤快速收集细胞（玻璃过滤器支架，带1 L玻璃漏斗，真空底座和盖子，不锈钢筛网，垫圈和弹簧夹，90 mm;研磨接头烧瓶1 L）。
2. 通过用刮刀刮除颗粒状细胞并立即将它们浸入充满液氮的50mL管中，快速冷冻收集的细胞。
   停止点:细胞可以在-80°C下储存长达3-4周。
3. 通过在混合研磨机中低温研磨进行细胞裂解:在30 Hz下两次2分钟，用1mL裂解缓冲液（见 表1）。在研磨之间在液氮中冷却。

试剂	每个样品的量（μL）	最终浓度
10毫克/毫升CHX（环己酰亚胺）	220	0.5毫克/毫升
1M 三盐酸 pH 8.0	88	20 毫米
3M氯化钾	205.7	140 毫米
100万氯化镁2	26.4	6 毫米
100万永久残基	4.4	1 毫米
NP-40	4.4	0.10%
蛋白酶抑制剂	2 片
脱氧核糖核酸酶 I	8.8	0.02 U/毫升
最终卷	4,400

表1:裂解缓冲液预混液的配方。

注意:如果感兴趣的蛋白质非常不稳定，裂解缓冲液可以改变以含有更多的蛋白酶抑制剂（如贝他汀，路易替丁，抑肽酶等），但重要的是要避免EDTA，以保持核糖体在以下步骤中组装的小亚基和大亚基。出于类似的原因，始终在缓冲溶液中保持至少6mM MgCl₂ 。

注意:HCl具有高腐蚀性，PMSF是有毒的。戴上手套，小心处理。

4. 在30，000× g，4°C下离心2分钟以清除裂解物并收集上清液。

4. 核糖体新生链复合物对SeRP的纯化

1. 对于每个实验，将上清液分成两部分;每个在不同的微量离心管中:总RNA样品（〜200μL）和免疫纯化（IP）样品（〜700μL）翻译组样品。
2. 处理总RNA样品
   1. 在4°C下使用10U RNase I消化总RNA样品25分钟;使用旋转混合架以 30 RPM 旋转。
      注意:消化条件可以使用多体分析进行校准，以确保单体峰不会过度或消化不足。
   2. 制备蔗糖缓冲预混液，如 表2所述。

试剂	每个样品的量（μL）	最终浓度
50%蔗糖	200	25%
1M 三盐酸 pH 8.0	8	20 毫米
3M氯化钾	18.7	140 毫米
100万氯化镁2	4	10 毫米
100毫克/毫升血流血酸	0.4	0.1毫克/毫升
蛋白酶抑制剂	1 片
最终卷	400

表2:蔗糖垫预混料的配方。

3. 将样品上样到400μL蔗糖垫上，并在TLA120转子中在245，000× g 和4°C下离心90分钟。
4. 用真空泵快速除去上清液，并用150μL裂解缓冲液覆盖沉淀。通过在4°C和300RPM下振荡1小时重悬沉淀。
5. 通过移液重悬残留的沉淀并转移到新的1.5 mL管中。
   注意:100-200μg总RNA通常足以对总翻译组进行核糖体分析。可以添加rRNA耗竭步骤以减少rRNA污染，这是核糖体 - 新生链复合物亲和力纯化¹¹ 中最常见的污染物（参见讨论以获取更多详细信息）。

3. 处理免疫纯化样品
   1. 用3×1mL裂解缓冲液（不含DNA酶I和蛋白酶抑制剂）洗涤每份样品100-400μL亲和结合基质（70%EtOH中的1:1抗体偶联珠）;将亲和基质重悬于裂解缓冲液中，然后在4°C下用旋转的混合架以30 RPM旋转5分钟。通过在3，000× g，4°C下离心30s沉淀。 丢弃上面的液体。重复三次。
   2. 使用每A260nm单位的RNase I10 U以及亲和结合基质（例如，每个样品100-400μLGFP-TRAP）消化免疫纯化样品。
   3. 在4°C下，用旋转的混合架以30 RPM旋转25分钟，以将蛋白质与亲和基质结合。
   4. 如 表3中所述制备洗涤缓冲液预混液。

试剂	每个样品的量（μL）	最终浓度
10毫克/毫升血红素	50	0.1毫克/毫升
1M 三盐酸 pH 8.0	100	20 毫米
3M氯化钾	233	140 毫米
100万氯化镁2	50	10 毫米
100万永久残基	5	1 毫米
NP-40	0.5	0.01%
蛋白酶抑制剂	2 片
50%甘油	1,000	10%
最终卷	5,000

表3:洗涤缓冲液预混液的配方。

5. 用1mL洗涤缓冲液洗涤亲和结合基质三次，每次约1分钟，在4°C下以30RPM在混合架中旋转。
6. 通过在4°C下以3，000× g 离心30s沉淀。 丢弃上面的液体。
7. 在1mL洗涤缓冲液中再洗涤两次，每次5分钟，在4°C下以30RPM在混合架中旋转。
8. 通过在3，000× g 和4°C下离心30秒沉淀。
9. 使用50μL微球进行蛋白质洗脱，用相同量的2x样品缓冲液。使用其余的磁珠进行RNA提取。
10. 在3，000× g，4°C下离心30秒以沉淀珠子并丢弃上部液体。
11. 在液氮中冷冻并储存在-80°C。 使用这些样品进行后续的RNA提取。
    停止点:样品可以在-80°C下储存过夜或更长时间。这可能是一个停止点。
12. 通过蛋白质印迹或考马斯用等分试样（约10%体积，混合后）染色来评估亲和力纯化步骤的成功与否。始终在未标记的 WT 菌株上使用模拟 IP 作为与亲和矩阵的非特异性绑定的对照。
    注意:高非特异性背景可以通过增加盐/洗涤剂浓度的额外洗涤步骤来克服。瞬态相互作用可以通过各种交联剂处理来稳定，例如，活细胞的多聚甲醛（PFA）处理 - 向生长培养基中加入0.4%-1%PFA2-5分钟，然后甘氨酸（0.3M）淬火3分钟，强烈建议。
    注意:多聚甲醛是一种可疑的致癌物质。由于多聚甲醛蒸发迅速并具有腐蚀性，因此在化学安全罩中工作并戴上两层手套。

5. 用于深度测序的cDNA文库制备

1. 核糖核酸提取
   注意:使用不含 RNase 的不粘 1.5 mL 试管，以防止可能的 RNA 或 DNA 耗竭。
   1. 将步骤4.2.5和4.3.12中的样品在冰上解冻，并将样品重悬于10mM Tris-HCl pH 7.0至最终体积700μL。
      注意:酸性苯酚和氯仿是挥发性和有害的。在化学品安全罩中工作。
   2. 向 0.7 mL 总 RNA 或 IP 洗脱液中加入 40 μL 20% SDS。关闭并反转几次。蛋白质沉淀应使样品变白。
   3. 向样品中加入0.75 mL预热酸 - 苯酚:氯仿。密封管子，并在热混合器中以1，400 RPM和65°C摇动5分钟。 将样品在冰上冷却5分钟。
   4. 离心管从步骤5.1.3。在20，000 x g 下持续 2 分钟。将顶部水层转移到新鲜管中，并向其中加入0.7 mL酸 - 苯酚:氯仿。
   5. 在室温下孵育5分钟，偶尔涡旋。以20，000× g离心2分钟。将顶部水层转移到新鲜管中，并向其添加0.6mL氯仿和涡旋。
   6. 以20，000× g离心1分钟。将顶部水层转移到新管中。
   7. 通过加入78μL3M NaOAc，pH 5.5，2μL糖蓝和0.75mL异丙醇沉淀核酸。彻底涡旋5分钟。在-80°C下孵育至少1小时或在-20°C下孵育16小时。
   8. 在20，000× g 和4°C下离心30分钟，弃去上清液。用冰冷的0.75mL 80%乙醇洗涤沉淀。倒置管子进行彻底清洗。在4°C下以20，000× g 离心5分钟，然后弃去上清液。
   9. 在450× g，4°C下旋转20秒，除去剩余的乙醇并丢弃液体。在65°C下用打开的盖子干燥沉淀5分钟。 按如下方式重悬样品:对于IP重悬样品，在10μL的10mM Tris-HCl中，pH 7.0。对于总翻译组分析，将样品重悬于20μL的10mM Tris-HCl中，pH 7.0。
      停止点:RNA可以在-80°C下储存数月。
2. 通过荧光法定量总RNA浓度
   注意:在准备用于下一代测序的cDNA文库时，以下所有材料和表面都应不含RNase。处理RNA样品时，戴上手套。
   1. 将1μL酸性苯酚提取的总RNA稀释在9μL的10mM三盐酸盐中，pH 7.0。按照制造商网站上的说明，使用荧光计进行定量。
   2. 用10μL的10mM Tris-HCl稀释含有50μgRNA的样品，pH 7.0。
      注意:不要测量IP样本，请在下一步中使用所有内容。
3. 凝胶纯化核糖体保护足迹碎片
   1. 设置15%TBE-尿素聚丙烯酰胺凝胶，并浸没在1x TBE电泳缓冲液中。在样品上样前以200 V运行30分钟。向每个样品中加入20μL2x TBE-尿素样品缓冲液。
      注意:预期波段大小约为 25-35 nt。
   2. 将10 bp DNA分子量标准品在80°C下解冻并使样品变性（不是分子量标准品）2分钟，然后在冰上冷却。将每个样品加载到其他通道上。在200 V下运行凝胶50-70分钟。
   3. 将6μLSYBR金（10，000 x 浓缩物）稀释在60mL 1x TBE缓冲液中并染色，同时在避光盒中摇动15-20分钟。染色凝胶时，在标记的1.5 mL管中准备无菌手术刀和0.5 mL破凝胶管。
   4. 用无菌手术刀切除所需的条带（使用新鲜的手术刀或在样品之间使用清洁孔），并将每个凝胶片放入凝胶破碎管中。
   5. 拍摄凝胶的图像，以确保凝胶中没有样品残留物。
   6. 在4°C下以20，000× g 离心含有切割切片的管5分钟，并将剩余的凝胶片从破凝胶管转移到1.5mL管中。
   7. 加入0.5毫升10毫升三倍，pH 7.0。在热混合器中以1，400 RPM在70°C下摇动10分钟。
   8. 转移到具有宽孔移液器尖端的醋酸纤维素柱中，并在4°C下以20，000× g 离心3分钟。
   9. 将流经物转移到新的 1.5 mL 离心管中，并在冰上冷却。
   10. 为了沉淀核酸，加入:550μLIPA，55μL3M NaOAc和2μL糖蓝和涡旋彻底混合。将样品置于-80°C下至少1小时。
   11. 在20，000× g 和4°C下离心至少1小时，并弃去上清液。用0.75mL冰冷的80%乙醇洗涤沉淀。倒置管子进行彻底洗涤，直到颗粒与底部分离。在4°C下以20，000× g 再次离心5分钟，并弃去上清液。
   12. 在450× g，4°C下旋转20秒，并除去剩余的乙醇。在65°C下用打开的盖子干燥沉淀5分钟。
   13. 加入15μL10mM Tris，pH 7.0并彻底重悬沉淀。在450× g，4°C下旋转20秒，并将样品转移到新的1.5 mL管中。
       停止点:纯化的RNA可以在-80°C下储存几个月。
4. 去磷酸化
   1. 对于每个样品使用以下混合物的3μL:将1μL RNase抑制剂加入2μL10x T4多核苷酸激酶反应缓冲液中，不含ATP。向每个样品中加入2μLT4多核苷酸激酶。轻轻移液至充分混合，并在37°C下孵育2小时，不摇动。
   2. 为了灭活酶，将样品在75°C下孵育10分钟，并在450× g，4°C下旋转20秒。加入0.5mL 10mM Tris，pH 7.0。
   3. 为了沉淀核酸，加入2μL糖蓝，550μLIPA和55μL3M NaOAc。
   4. 涡旋彻底混合并将样品在-80°C下冷却至少1小时。
      停止点:样品可以在-80°C下储存过夜或更长时间。
   5. 重复步骤 5.3.11-5.3.13。
      停止点:去磷酸化的RNA可以在-80°C下储存数月。
5. 使用生物分析仪进行定量
   1. 通过混合1μL样品和4μLDEPC处理过的水，使每个RNA样品的稀释度为1:4。
      注意:DEPC是一种致癌物质。戴上手套，小心工作。
   2. 运行生物分析仪小型RNA芯片/磁带站。遵循制造商的协议。
      注意:预期受核糖体保护的RNA片段大小约为28-30 nt。
6. 连接线 3' 末端，带链接器-1
   1. 用10mM Tris，pH 7.0将5 pmol小RNA片段稀释至10μL。样品在80°C下变性2分钟，并在冰上冷却。
   2. 如 表4 中所述制备预混液，每个样品使用29μL。

试剂	每个样品的量（μL）	最终浓度
50% 无菌过滤 PEG 8000	16	20%
断续器	4	10%
10×T4 RNA连接酶2缓冲液	4	1 倍
超抗酶-在核酸酶抑制剂	2	2 U
10 mM 腺苷酸化接头 3-L1	0.1	25 微米
DEPC处理过的水	2.9
最终卷	29

表4:3'末端连接预混液的配方。

3. 加入1μLT4 RNA连接酶2并轻轻移液以充分混合。在23°C孵育2小时。
4. 为了沉淀核酸，加入:550μLIPA，500μL10mM Tris，pH 7.0，55μL3M NaOAc和2μL糖蓝。涡旋彻底混合，并将样品置于-80°C下至少1小时。
   停止点:将样品储存在-80°C过夜或更长时间。
5. 重复步骤 5.3.2-5.3.12。
6. 将沉淀重悬于6μL的10mM Tris中，pH 7.0。在450× g，4°C下旋转20秒，并将样品转移到新的1.5 mL管中。
   停止点:样品可以在-80°C下储存数月。

7. 3' 链接基底面的凝胶纯化
   1. 设置10%TBE-尿素聚丙烯酰胺凝胶，并浸没在1x TBE电泳缓冲液中。在样品上样前以200 V运行30分钟。向每个样品中加入6μL2x TBE-尿素样品缓冲液。
      注意:预期波段大小约为 71-73 nt。
   2. 重复步骤 5.3.2-5.3.13。
      停止点:样品可以在-80°C下储存数月。
8. 反向转录 3ʹ 链接的足迹片段以生成 ssDNA
   1. 如 表5 中所述制备预混液，每个样品使用3μL。

试剂	每个样品的量（μL）	最终浓度
1000 万吨/肾上腺素酐	1	0.5 毫米
25 μM 链接器 L（rt）	0.5	625 海里
DEPC处理过的水	1.5
最终卷	3

表5:核酸变性前逆转录缓冲液预混液的配方。

2. 涡旋并旋转样品。
3. 将样品在65°C下孵育5分钟。
4. 在冰上冷却样品。
5. 如 表6 中所述准备预混液，每个样品使用6μL。涡旋并旋转样品。向每个样品和移液管中加入1μL上标III，轻轻混合均匀，并在50°C下孵育30分钟。

试剂	每个样品的量（μL）	最终浓度
5× FS 缓冲液	4	1 倍
超抗酶-在核酸酶抑制剂	1	2 U
直径 0.1 米	1	5 毫米
最终卷	6

表6:核酸变性后逆转录缓冲液预混液的配方。

6. 加入2.3μL 1 N NaOH，其水解RNA并淬灭逆转录。
   注意:NaOH具有高度腐蚀性。戴上手套和护目镜。
7. 在95°C下孵育15分钟，直到样品变成粉红色。
8. 设置10%TBE-尿素聚丙烯酰胺凝胶，并浸没在1x TBE电泳缓冲液中。在样品上样前以200 V运行30分钟。向每个样品中加入23μL2x TBE-尿素样品缓冲液。
   注意:预期的DNA条带大小为115-117 nt。
9. 重复步骤 5.3.2-5.3.12。
10. 将沉淀重悬于15μL的10mM Tris中，pH 8.0。在450× g，4°C下旋转20秒，并将样品转移到新的1.5 mL管中。
    停止点:样品可以在-80°C下储存数月。

9. ssDNA 环化
   1. 准备以下预混液，并按 表7所述，每个样品上样4μL。

试剂	每个样品的量（μL）	最终浓度
10×环连接酶II缓冲液	2	1 倍
5 M 甜菜碱 （可选）	1	0.25 米
50 mM 锰2	1	2.5 毫米
最终卷	4

表7:ssDNA环化预混液的配方。

2. 向每个样品中加入1μLCircLigase II ssDNA连接酶，并在60°C下孵育1小时。
   注意:通过在孵育1小时后向每个样品中加入1μLCircLigase II ssDNA连接酶，可以提高该步骤的效率。
3. 通过在80°C下孵育10分钟来灭活酶。
4. 在冰上冷却并继续PCR扩增或储存在-80°C。
   停止点:样品可以在-80°C下储存多年。

10. PCR 扩增
    1. 准备以下PCR预混液，并加载每个样品82μL，详见 表8。

试剂	每个样品的量（μL）	最终浓度
DEPC处理过的水	61.6
5×磷氢HF反应缓冲液	17.6	1 倍
1000 万吨/肾上腺素酐	1.8	200 微米
100 μM PCR 正向引物	0.2	225 海里
HF 磷离子聚合酶	0.8	1.6 U
最终卷	82

表8:PCR扩增预混液配方。

2. 向每个含有预混液的试管中，加入5μL环状DNA。
   注意:将其余的环状DNA样品储存在-80°C。
3. 向每个样品中加入不同的1μL20μM PCR反向条形码引物（见 表9）并涡旋彻底混合。
4. 将每个管等分到四个单独的PCR管中，每个管将用于不同数量的PCR循环。
5. 根据以下程序运行PCR反应，详见 表10。

周期	变性 （98 °C）	退火 （60 °C）	延伸 （72 °C）
1	30 秒
2-16	10 秒	10 秒	5 秒

表10:用于PCR反应的PCR程序。

6. 在第 8、9、10 和 11 周期后，取出 PCR 管（对于 IP 样品，周期范围为 9 至 15），作为第一次尝试。每个周期后，暂停程序，取出一等分试样并将其放在冰上，然后迅速恢复程序。
   注意:循环次数应根据每次反应中环状DNA的数量进行调整。有关示例和进一步说明，请参阅 图 4 。
7. 对于每个17μL反应，加入3.5μL6x DNA上样染料。
8. 解冻10 bp DNA分子量标准。
9. 对于通过凝胶电泳进行尺寸分离，将8%TBE聚丙烯酰胺浸没在1x TBE电泳缓冲液中，并将每个不同循环数的样品加载到相邻孔中，并在180 V下运行凝胶50分钟。
10. 将6μLSYBR金（10，000 x 浓缩物）稀释在60mL 1x TBE缓冲液中并染色，同时在避光盒中摇动15-20分钟。
11. 染色凝胶时，在标记的1.5 mL管中准备无菌手术刀和0.5 mL破凝胶管。
12. 拍摄染色核酸的图像。
13. 用无菌手术刀切割预期条带尺寸为174-176 bp的所需条带，并将凝胶切片放入制备的0.5 mL破凝胶管中（在样品之间彻底清洁并使用RNase灭活剂，或切换到新的刀片）。
14. 在20，000× g 和4°C下离心管5分钟，然后将剩余的凝胶块从0.5mL破凝胶管转移到1.5mL管中。
15. 加入500μL10mM Tris，pH 8.0，并在热混合器中以1，400 RPM振荡10分钟和70°C。
16. 将溶解的凝胶转移到具有宽孔移液器尖端的醋酸纤维素柱上。
17. 将色谱柱在20，000× g 和4°C下离心3分钟，并将流通转移到新的1.5mL管中并在冰上冷却。
18. 为了沉淀核酸，加入:550μLIPA，32μL5M NaCl，1μL 0.5M EDTA和2μL糖蓝和涡旋彻底混合。
19. 将样品在-80°C或-20°C下保存至少1小时过夜。
    停止点:样品可以在-80°C下储存过夜或更长时间。
20. 重复步骤 5.3.11-5.3.12。
21. 重悬于11μL的10mM三聚氰胺中，pH 8.0。在450× g，4°C下旋转20秒，并将样品转移到新的1.5 mL管中。
    停止点:样品可以在-80°C下储存多年。

11. 通过生物分析仪量化尺寸分布
    1. 通过将1μL样品与4μLDEPC处理过的水混合，使每个样品的稀释度为1:4。
    2. 运行生物分析仪小型RNA芯片。遵循制造商的协议。
       注意:预期长度为 175 ± 5 bp。
12. 通过荧光计定量 DNA 浓度
    1. 根据制造商的建议，使用荧光计进行dsDNA高灵敏度浓度检查。
    2. 根据 Illumina 建议对样本进行多路复用和序列化（索引适配器池指南¹²）。

6. 数据分析

1. 执行补充文件中详述的分析。

结果

如该方案的流程图所示（图1），细胞生长至对数相，然后通过过滤迅速收集并通过低温研磨裂解。然后将裂解物分为两部分:一个用于总核糖体保护的mRNA足迹，另一个用于选定的受核糖体保护的mRNA足迹，我们在其上进行亲和纯化以拉低标记的蛋白质 - 核糖体 - 新生链复合物。我们确保了标记蛋白表达和蛋白质印迹分析下拉的成功，如图 2所示。根据系?...

讨论

在这里，方案详细介绍了选择性核糖体分析方法，用于捕获近密码子分辨率中的共翻译相互作用。随着核糖体上升为协调新生链出现在拥挤的细胞质中的中心，这是鉴定和表征确保功能性蛋白质组所需的各种共翻译相互作用以及研究各种疾病的关键方法。迄今为止，SeRP是唯一能够以直接方式在体内捕获和表征这些相互作用的方法^14，15，<...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
3'-Phosphorylated 28 nt RNA control oligonucleotide	IDT	custom order	RNase free HPLC purification; 5'-AUGUAGUCGGAGUCGAGGCGC GACGCGA/3Phos/-3'
Absolute ethanol	VWR	20821
Acid phenol–chloroform	Ambion	AM9722
Antibody: mouse monclonal anti-HA	Merck	11583816001	12CA5
Aprotinin	Roth	A162.3
ATP*	NEB	P0756S	10 mM
Bacto agar	BD	214030
Bacto peptone	BD	211820
Bacto tryptone	BD	211699
Bacto yeast extract	BD	212720
Bestatin hydrochloride	Roth	2937.2
Chloroform	Merck	102445
CircLigase II ssDNA Ligase*	Epicentre	CL9025K	100 U/μL
Colloidal Coomassie staining solution	Roth	4829
cOmplete, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets	Roche Diagnostics	29384100
Cycloheximide	Biological Industries	A0879
DEPC treated and sterile filtered water*	Sigma	95284
D-Glucose anhydrous	Merck	G5767-500G
Diethylpyrocarbonate	Roth	K028
Dimethylsulfoxide*	Sigma-Aldrich	276855
DNA ladder, 10 bp O'RangeRuler*	Thermo Fisher Scientific	SM1313
DNA loading dye*	Thermo Fisher Scientific	R0631	6×
DNase I, recombinant	Roche	4716728001	RNAse free
dNTP solution set*	NEB	N0446S
EDTA*	Roth	8043
Glycerol	VWR	24388.260.
Glycine solution	Sigma-Aldrich	67419-1ML-F	1 M
GlycoBlue	Ambion	AM9516	15 mg/mL
HEPES	Roth	HN78.3
HF Phusion polymerase*	NEB	M0530L
HK from S. cerevisiae	Sigma-Aldrich	H6380-1.5KU
Hydrochloric acid	AppliChem	A1305
Isopropanol	Sigma-Aldrich	33539
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside	Roth	CN08
Kanamycin	Roth	T832.4
KCl	Roth	6781.1
KH2PO4	Roth	3904.1
Leupeptin	Roth	CN33.4
Linker L(rt)	IDT	custom order
Liquid nitrogen
MgCl2	Roth	KK36.3
Na2HPO4	Roth	P030.2
Na2HPO4·2H2O	Roth	T879.3
NaCl*	Invitrogen	AM97606	5 M
NaH2PO4·H2O	Roth	K300.2
NHS-activated Sepharose 4 fast-flow beads	GE Life Sciences	17090601
Nonidet P 40 substitute	Sigma	74385
Pepstatin A	Roth	2936.2
Phenylmethyl sulfonyl fluoride	Roth	6367
Precast gels	Bio-Rad	5671034	10% and 12%
RNase I	Ambion	AM2294
SDS, 20%	Ambion	AM9820	RNase free
Sodium acetate*	Ambion	AM9740	3 M, pH 5.5
Sodium azide	Merck	S8032-100G
Sodium chloride	Roth	9265
Sodium hydroxide*	Sigma	S2770	1 N
Sucrose	Sigma-Aldrich	16104
SUPERase-In RNase Inhibitor	Ambion	AM2694
Superscript III Reverse Transciptase*	Invitrogen	18080-044
SYBR Gold*	Invitrogen	S11494
T4 polynucleotide kinase*	NEB	M0201L
T4 RNA ligase 2*	NEB	M0242L
TBE polyacrylamide gel*	Novex	EC6215BOX	8%
TBE–urea polyacrylamide gel*	Novex	EC68752BOX	10%
TBE–urea polyacrylamide gel*	Novex	EC6885BOX	15%
TBE–urea sample buffer*	Novex	LC6876	2×
Tris	Roth	4855
Tris*	Ambion	AM9851	1 M, pH 7.0
Tris*	Ambion	AM9856	1 M, pH 8.0
UltraPure 10× TBE buffer*	Invitrogen	15581-044
* - for library preparation
gasket and spring clamp , 90 mm,	Millipore	XX1009020
ground joint flask 1 L ,	Millipore	XX1504705