Globale Identifizierung von co-translationalen Interaktionsnetzwerken durch selektives Ribosomenprofiling

Zusammenfassung

Co-translationale Interaktionen spielen eine entscheidende Rolle bei Modifikationen, Targeting-, Faltungs- und Montagepfaden der entstehenden Kette. Hier beschreiben wir Selective Ribosome Profiling, eine Methode zur in vivo, direkten Analyse dieser Wechselwirkungen im Modell Eukaryote Saccharomyces cerevisiae.

Zusammenfassung

In den letzten Jahren hat sich gezeigt, dass Ribosomen nicht nur unsere mRNA entschlüsseln, sondern auch die Entstehung der Polypeptidkette in die überfüllte zelluläre Umgebung leiten. Ribosomen bieten die Plattform für die räumlich und kinetisch kontrollierte Bindung von Membran-Targeting-Faktoren, die Modifikation von Enzymen und die Faltung von Chaperonen. Sogar die Montage zu oligomeren Komplexen höherer Ordnung sowie Protein-Protein-Netzwerkbildungsschritte wurden kürzlich entdeckt, um mit der Synthese koordiniert zu sein.

Hier beschreiben wir das selektive Ribosom-Profiling, eine Methode, die entwickelt wurde, um co-translationale Interaktionen in vivo zu erfassen. Wir werden die verschiedenen Affinitätsreinigungsschritte detailliert beschreiben, die für die Erfassung von Ribosomen-Nascent-Chain-Komplexen zusammen mit co-translationalen Interaktoren erforderlich sind, sowie die mRNA-Extraktions-, Größenausschluss-, Reverse-Transkriptions-, Deep-Sequencing- und Big-Data-Analyseschritte, die erforderlich sind, um co-translationale Interaktionen in nahezu Codon-Auflösung zu entschlüsseln.

Einleitung

Selective RIbosom PRofiling (SeRP) ist die bisher einzige Methode, die co-translationale Interaktionen in vivo auf direkte Weise erfasst und charakterisiert 1,2,3,4,5,6. SeRP ermöglicht die globale Profilerstellung von Wechselwirkungen eines beliebigen Faktors mit der Übersetzung von Ribosomen in nahezu Codon-Auflösung ^2,7.

Die Methode beruht auf dem Einfrieren von Schockzellen und der Erhaltung der aktiven Translation. Zelllysate werden dann mit RNase I behandelt, um die gesamte mRNA in der Zelle mit Ausnahme der Ribosomen-geschützten mRNA-Fragmente, die als "Ribosomen-Fußabdrücke" bezeichnet werden, zu verdauen. Die Probe wird dann in zwei Teile geteilt; Ein Teil wird direkt für die Isolierung aller zellulären ribosomalen Fußabdrücke verwendet, die die gesamte laufende Translation in der Zelle darstellen. Der zweite Teil wird für die Affinitätsreinigung der spezifischen Teilmenge von Ribosomen verwendet, die mit einem interessierenden Faktor assoziiert sind, zum Beispiel: Modifikation von Enzymen, Translokationsfaktoren, faltenden Chaperonen und komplexen Assemblierungsinteraktionen. Die affinitätsgereinigten ribosomalen Fußabdrücke werden zusammenfassend als Interaktom bezeichnet. Dann werden die Ribosomen-geschützten mRNAs extrahiert und für die cDNA-Bibliotheksgenerierung verwendet, gefolgt von einer tiefen Sequenzierung.

Die vergleichende Analyse der gesamten Translatom- und Interaktomproben ermöglicht die Identifizierung aller Orfs, die mit dem interessierenden Faktor assoziiert sind, sowie die Charakterisierung jedes ORF-Interaktionsprofils. Dieses Profil berichtet über die genauen Engagement-Beginn- und Terminierungssequenzen, aus denen man auf die dekodierten Codons und die jeweiligen Reste der entstehenden Polypeptidkette schließen kann, sowie über die Ribosomengeschwindigkeitsschwankungen während der Wechselwirkung ^7,8. Abbildung 1 zeigt das Protokoll als Schaltplan.

Abbildung 1: Eine Übersicht über das SeRP-Protokoll. Dieses Protokoll kann in seiner Gesamtheit innerhalb von 7-10 Tagen durchgeführt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Protokoll

1. Generieren von Stämmen für die selektive Ribosomenprofilierung

HINWEIS: Selektives RIbosom PRofiling (SeRP) ist eine Methode, die auf der Affinitätsreinigung von Faktoren von Interesse beruht, um ihre Art der Interaktion mit Ribosomen-naszierenden Kettenkomplexen zu bewerten. Homologe Rekombination⁹ sowie CRISPR / Cas9^10-basierte Methoden werden verwendet, um verschiedene Faktoren von Interesse mit Tags für Affinitätsreinigungen zu verschmelzen. Solche Tags sind GFP, für GFP-Fallen-Affinitätsreinigungen, TAP-Tag für IgG-Sepharus-Perlenreinigungen sowie AVI-Tag, gereinigt durch Avidin oder Streptavidin, um nur einige erfolgreiche Beispiele aus den letzten Jahren aufzulisten.

1. Führen Sie Wachstums- oder Funktionstests durch, um zu validieren, dass das Tagging die Proteinfunktion nicht beeinträchtigt hat. N' versus C' Terminal Tagging sollte evaluiert werden.
   HINWEIS: Die Ribosomen (rRNA) sowie viele Ribosomenbindungsdomänen in verschiedenen Faktoren sind hoch geladen, was die Verwendung von hochgeladenen Tags (wie Polyhistidin) unbevorzugt macht, da dies zu einer falschen Entdeckung oder einem veränderten Bindungsmodus führen kann.

2. Kulturwachstum

1. Kultivieren Sie die konstruierten Hefenkulturen (basierend auf dem Stamm BY4741), die die gewünschten markierten Proteine enthalten, entweder in flüssigem Hefeextrakt-Pepton-Dextrose (YPD)-reichem Medium oder in synthetischem Dextrose (SD) minimalem Medium (1,7 g/L Hefestickstoffbase mit Ammoniumsulfat oder 1,7 g/L Hefestickstoffbase ohne Ammoniumsulfat mit 1 g/L Mononatriumglutaminsäure, 2% Glucose und ergänzt mit einer vollständigen oder geeigneten Mischung von Aminosäuren).
2. Züchten Sie 250-500 ml Zellkultur auf 0,5 OD₆₀₀ (Mid-Log) bei 30 °C in einem geeigneten Medium.

3. Zellentnahme und Lyse

1. Schnelles Sammeln von Zellen durch Vakuumfiltration auf einer 0,45 μm Nitrocellulose-Löschmembran mit einem Glasfiltersystem (Glasfilterhalter mit 1 L Glastrichter, Vakuumboden und -kappe, Edelstahlsieb, Dichtung und Federklemme, 90 mm; geschliffener Fugenkolben 1 L).
2. Schockgefrieren Sie die gesammelten Zellen, indem Sie die pelletierten Zellen mit einem Spatel abkratzen und sofort in ein mit flüssigem Stickstoff gefülltes 50-ml-Röhrchen tauchen.
   HALTEPUNKT: Die Zellen können bis zu 3-4 Wochen bei -80 °C gelagert werden.
3. Zelllyse durch kryogene Vermahlung in einer Mischermühle: zweimal für 2 min bei 30 Hz, mit 1 ml des Lysepuffers (siehe Tabelle 1). Zwischen den Mühlen in flüssigem Stickstoff abkühlen.

Reagenz	Menge pro Probe (μL)	Endkonzentration
10 mg/ml CHX (Cycloheximid)	220	0,5 mg/ml
1M Tris-HCl pH 8,0	88	20 mM
3 Mio. KCl	205.7	140 mM
1 Mio. mgCl2	26.4	6 mM
1 Mio. PMSF	4.4	1 mM
NP-40	4.4	0.10%
Proteasehemmer	2 Tabletten
DNase I	8.8	0,02 U/ml
Letzter Band	4,400

Tabelle 1: Rezept für den Lysepuffer-Mastermix.

HINWEIS: Der Lysepuffer kann geändert werden, um mehr Proteasehemmer (wie Bestatin, Leupeptin, Aprotinin usw.) zu enthalten, falls das interessierende Protein sehr instabil ist, aber es ist wichtig, EDTA zu vermeiden, um die kleinen und großen Untereinheiten des Ribosoms zu erhalten, die während der folgenden Schritte zusammengesetzt sind. Aus ähnlichen Gründen mindestens 6 mM_MgCl2 in der Pufferlösung halten.

ACHTUNG: HCl ist stark korrosiv und PMSF ist giftig. Tragen Sie Handschuhe und behandeln Sie sie mit Sorgfalt.

4. Zentrifüte für 2 min bei 30.000 x g, 4 °C, um das Lysat zu reinigen und Überstände zu sammeln.

4. Reinigung von Ribosomen-Naszenzketten-Komplexen für SeRP

1. Teilen Sie für jedes Experiment den Überstand in zwei Teile; jeweils in einem anderen Mikrozentrifugenröhrchen: Gesamt-RNA-Probe (~ 200 μL) und Immunreinigungsprobe (IP) (~ 700 μL) Translatomproben.
2. Verarbeitung der gesamten RNA-Probe
   1. Aufschluss der gesamten RNA-Probe unter Verwendung von 10 HE RNase I für 25 min bei 4 °C; Drehen Sie sich mit einem rotierenden Mix-Rack mit 30 U / min.
      HINWEIS: Die Aufschlussbedingungen können mithilfe von Polysomenprofilen kalibriert werden, um sicherzustellen, dass die Monosomenspitze nicht über- oder unterverdaut wird.
   2. Bereiten Sie die Saccharose-Kissen-Mastermischung wie in Tabelle 2 beschrieben vor.

Reagenz	Menge pro Probe (μL)	Endkonzentration
50% Saccharose	200	25%
1M Tris-HCl pH 8,0	8	20 mM
3 Mio. KCl	18.7	140 mM
1 Mio. mgCl2	4	10 mM
100 mg/ml CHX	0.4	0,1 mg/ml
Proteasehemmer	1 Tablette
Letzter Band	400

Tabelle 2: Rezept für Saccharose-Kissen-Mastermix.

3. Laden Sie die Probe auf 400 μL des Saccharosekissens und der Zentrifuge in einem TLA120-Rotor für 90 min bei 245.000 x g und bei 4 °C.
4. Entfernen Sie den Überstand schnell mit einer Vakuumpumpe und überlagern Sie Pellets mit einem 150 μL Lysepuffer. Resuspendieren Sie die Pellets durch Schütteln für 1 h bei 4 °C und bei 300 U / min.
5. Resuspendiert das Restpellet durch Pipettieren und Transfer in ein neues 1,5-ml-Rohr.
   HINWEIS: 100-200 μg Gesamt-RNA sind normalerweise ausreichend für die Ribosomenprofilierung des Gesamttranslatoms. Man kann den rRNA-Depletionsschritt hinzufügen, um die rRNA-Kontamination zu reduzieren, die die häufigste Verunreinigung der Ribosomen-naszierenden Kettenkomplexe Affinitätsreinigungen¹¹ ist (siehe Diskussion für weitere Details).

3. Verarbeitung der Immunreinigungsprobe
   1. Waschen Sie 100-400 μL der affinitätsbindenden Matrix (1:1 Antikörper-konjugierte Kügelchen in 70% EtOH) pro Probe mit 3 x 1 ml Lysepuffer (ohne DNase I und Proteasehemmer); Schwebe die Affinitätsmatrix im Lysepuffer und drehe sie dann bei 30 U/min mit einem rotierenden Mix-Rack bei 4 °C für 5 min. Ausfällung durch Zentrifugation für 30 s bei 3.000 x g, 4 °C. Entsorgen Sie die obere Flüssigkeit. Wiederholen Sie dies dreimal.
   2. Aufschluss von Immunreinigungsproben mit 10 HE pro A260-nm-Einheit RNase I, zusammen mit einer affinitätsbindenden Matrix (z. B. 100-400 μL GFP-TRAP pro Probe).
   3. 25 min bei 30 U/min mit einem rotierenden Mix-Rack drehen, um das Protein bei 4 °C an die Affinitätsmatrix zu binden.
   4. Bereiten Sie die Waschpuffer-Mastermischung wie in Tabelle 3 beschrieben vor.

Reagenz	Menge pro Probe (μL)	Endkonzentration
10 mg/ml CHX	50	0,1 mg/ml
1M Tris-HCl pH 8,0	100	20 mM
3 Mio. KCl	233	140 mM
1 Mio. mgCl2	50	10 mM
1 Mio. PMSF	5	1 mM
NP-40	0.5	0.01%
Proteasehemmer	2 Tabletten
50% Glycerin	1,000	10%
Letzter Band	5,000

Tabelle 3: Rezept für die Waschpuffer-Mastermischung.

5. Waschen Sie die affinitätsbindende Matrix dreimal mit 1 ml Waschpuffer, jedes Mal für ~ 1 min, und drehen Sie sich im Mix-Rack bei 30 U / min bei 4 ° C.
6. Ausfällung durch Zentrifugation bei 3.000 x g für 30 s bei 4 °C. Entsorgen Sie die obere Flüssigkeit.
7. Noch zweimal in 1 ml Waschpuffer waschen, jedes Mal für 5 min, im Mix-Rack bei 30 U / min bei 4 ° C drehen.
8. Ausfällung durch Zentrifugation für 30 s bei 3.000 x g und 4 °C.
9. Verwenden Sie 50 μL Perlen für die Proteinelution mit der gleichen Menge an 2x Probenpuffer. Verwenden Sie den Rest der Perlen für die RNA-Extraktion.
10. Zentrifuge für 30 s bei 3.000 x g, 4 °C, um die Perlen zu pelletieren und die obere Flüssigkeit zu entsorgen.
11. In flüssigem Stickstoff einfrieren und bei -80 °C lagern. Verwenden Sie diese Proben für die anschließende RNA-Extraktion.
    HALTEPUNKT: Proben können über Nacht oder länger bei -80 °C gelagert werden. Dies kann ein Haltepunkt sein.
12. Beurteilen Sie den Erfolg des Affinitätsreinigungsschrittes durch Western Blot oder Coomassie Färbung mit Aliquots (~ 10% nach Volumen, nach dem Mischen) jedes Schrittes. Verwenden Sie immer Mock-IP auf einer nicht getaggten WT-Dehnung als Kontrolle für unspezifische Bindung an die Affinitätsmatrix.
    HINWEIS: Hohe unspezifische Hintergründe können durch zusätzliche Waschschritte mit steigenden Salz-/Waschmittelkonzentrationen überwunden werden. Die transiente Interaktion kann durch die Behandlung verschiedener Vernetzungsmittel stabilisiert werden, z. B. die Behandlung lebender Zellen mit Paraformaldehyd (PFA) - die Zugabe von 0,4% -1% PFA zu den Wachstumsmedien für 2-5 min, gefolgt von Glycin (0,3 M) Abschreckung für 3 min, wird dringend empfohlen.
    ACHTUNG: Paraformaldehyd ist ein mutmaßliches Karzinogen. Da Paraformaldehyd schnell verdunstet und korrosiv ist, arbeiten Sie in einer chemischen Sicherheitshaube und tragen Sie zwei Lagen Handschuhe.

5. Vorbereitung der cDNA-Bibliothek für die Tiefensequenzierung

1. RNA-Extraktion
   HINWEIS: Arbeiten Sie mit RNase-freien Antihaft-1,5-ml-Röhrchen, um eine mögliche RNA- oder DNA-Erschöpfung zu verhindern.
   1. Die Proben aus den Schritten 4.2.5 und 4.3.12 werden auf Eis aufgetaut und die Proben mit 10 mM Tris-HCl pH 7.0 auf ein Endvolumen von 700 μL resuspendiert.
      ACHTUNG: Säurephenol und Chloroform sind flüchtig und schädlich. Arbeiten Sie in einer Chemikaliensicherheitshaube.
   2. Fügen Sie 40 μL 20% SDS zu 0,7 ml Gesamt-RNA- oder IP-Elutions hinzu. Schließen und umkehren Sie einige Male. Die Proteinfällung sollte die Proben weiß machen.
   3. 0,75 ml vorgewärmtes Säurephenol:Chloroform in die Proben geben. Die Rohre dicht verschließen und in einem Thermomischer bei 1.400 U/min 5 min und bei 65 °C schütteln. Proben 5 min auf Eis kühlen.
   4. Das Röhrchen aus Schritt 5.1.3 zentrifugieren. bei 20.000 x g für 2 min. Die oberste wässrige Schicht in ein frisches Röhrchen geben und 0,7 ml Säurephenol:Chloroform hinzufügen.
   5. Inkubieren Sie für 5 Minuten bei Raumtemperatur und wirbeln Sie gelegentlich. Zentrifuge für 2 min bei 20.000 x g. Die oberste wässrige Schicht in ein frisches Rohr geben und 0,6 ml Chloroform und Wirbel hinzufügen.
   6. Zentrifuge für 1 min bei 20.000 x g. Übertragen Sie die obere wässrige Schicht auf ein frisches Röhrchen.
   7. Nukleinsäuren durch Zugabe von 78 μL 3 M NaOAc, pH 5,5, 2 μL GlycoBlue und 0,75 ml Isopropanol ausfallen. Wirbel gründlich für 5 min. Inkubieren Sie mindestens 1 h bei -80 °C oder 16 h bei -20 °C.
   8. 30 min bei 20.000 x g und bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand entsorgen. Waschen Sie die Pellets mit eiskalten 0,75 ml 80% Ethanol. Drehen Sie die Rohre für eine gründliche Wäsche um. Bei 20.000 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren und dann den Überstand verwerfen.
   9. Bei 450 x g, 4 °C für 20 s nach unten drehen und das restliche Ethanol entfernen und die Flüssigkeiten entsorgen. Trocknen Sie das Pellet mit einem offenen Deckel für 5 min bei 65 °C. Resuspendieren Sie die Proben wie folgt: für IP resuspendiert die Probe in 10 μL von 10 mM Tris-HCl, pH 7,0. Für die Gesamttranslatomanalyse wird die Probe in 20 μL von 10 mM Tris-HCl, pH 7,0, resuspendiert.
      HALTEPUNKT: RNA kann monatelang bei -80 °C gelagert werden.
2. Quantifizierung der gesamten RNA-Konzentration durch Fluorometrie
   HINWEIS: Alle folgenden Materialien und Oberflächen sollten RNase-frei sein, während die cDNA-Bibliothek für die Sequenzierung der nächsten Generation vorbereitet wird. Tragen Sie beim Umgang mit RNA-Proben Handschuhe.
   1. Verdünnen Sie 1 μL Säurephenol-extrahierte Gesamt-RNA in 9 μL von 10 mM Tris-HCl, pH 7,0. Quantifizieren Sie mit einem Fluorometer, wie auf der Website des Herstellers angegeben.
   2. Verdünnen Sie die Proben, die 50 μg RNA enthalten, mit 10 μL von 10 mM Tris-HCl, pH 7,0.
      HINWEIS: Messen Sie keine IP-Proben, sondern verwenden Sie alles für den nächsten Schritt.
3. Ribosomen-geschützte Fußabdruckfragmente mit Gelreinigung
   1. Setzen Sie ein 15% TBE-Harnstoff-Polyacrylamid-Gel und tauchen Sie in 1x TBE-Laufpuffer ein. 30 Minuten lang bei 200 V laufen, bevor die Probe geladen wird. Zu jeder Probe fügen Sie 20 μL 2x TBE-Harnstoff-Probenpuffer hinzu.
      HINWEIS: Die erwartete Bandgröße liegt bei 25-35 nt.
   2. Tauen Sie eine 10 bp DNA-Leiter auf und denaturieren Sie Proben (nicht Leiter) bei 80 ° C für 2 Minuten und kühlen Sie dann auf Eis. Laden Sie jede Probe auf jede andere Spur. Lassen Sie das Gel für 50-70 min bei 200 V laufen.
   3. Verdünnen Sie 6 μL SYBR Gold (10.000 x Konzentrat) in 60 ml 1x TBE-Puffer und färben Sie, während Sie in lichtgeschützten Boxen für 15-20 min schütteln. Bereiten Sie beim Färben des Gels ein steriles Skalpell und 0,5 ml Gelbrecherröhrchen in etikettierten 1,5 ml Röhrchen vor.
   4. Entfernen Sie die gewünschten Bänder mit einem sterilen Skalpell (verwenden Sie ein frisches oder reinigen Sie es gut zwischen den Proben) und legen Sie jedes Gelstück in ein Gelbrecherröhrchen.
   5. Machen Sie ein Bild des Gels, um sicherzustellen, dass keine Probenrückstände im Gel verbleiben.
   6. Die Röhrchen mit geschnittenen Scheiben bei 20.000 x g zentrifugieren Sie 5 min bei 4 °C und geben die restlichen Gelstücke aus dem Gelbrecherröhrchen in das 1,5 ml Röhrchen.
   7. Fügen Sie 0,5 ml von 10 mM Tris, pH 7,0 hinzu. In einem Thermomischer bei 1.400 U/min 10 min bei 70 °C schütteln.
   8. Transfer in eine Celluloseacetatsäule mit breiter Pipettenspitze und Zentrifuge bei 20.000 x g für 3 min bei 4 °C.
   9. Übertragen Sie den Durchfluss auf ein neues 1,5-ml-Rohr und kühlen Sie es auf Eis.
   10. Um die Nukleinsäuren auszufällen, fügen Sie hinzu: 550 μL IPA, 55 μL 3 M NaOAc und 2 μL GlycoBlue und Vortex zum gründlichen Mischen. Legen Sie die Proben für mindestens 1 h auf -80 °C.
   11. Zentrifen Sie für mindestens 1 h bei 20.000 x g und 4 °C und entsorgen Sie den Überstand. Waschen Sie die Pellets mit 0,75 ml eiskaltem 80% Ethanol. Drehen Sie die Rohre für eine gründliche Wäsche um, bis sich die Pellets vom Boden trennen. Zentrifugieren Sie erneut bei 20.000 x g für 5 min bei 4 °C und entsorgen Sie den Überstand.
   12. Bei 450 x g, 4 °C für 20 s nach unten drehen und das restliche Ethanol entfernen. Trocknen Sie die Pellets mit einem offenen Deckel für 5 min bei 65 °C.
   13. Fügen Sie 15 μL von 10 mM Tris, pH 7,0 hinzu und resuspendieren Sie die Pellets gründlich. Bei 450 x g, 4 °C für 20 s nach unten drehen und die Probe in ein neues 1,5-ml-Röhrchen überführen.
       HALTEPUNKT: Gereinigte RNA kann einige Monate bei -80 °C gelagert werden.
4. Dephosphorylierung
   1. Verwenden Sie 3 μL der folgenden Mischung für jede Probe: Fügen Sie 1 μL RNase-Inhibitor in 2 μL 10x T4-Polynukleotidkinase-Reaktionspuffer ohne ATP hinzu. Geben Sie 2 μL T4-Polynukleotidkinase zu jeder Probe. Vorsichtig gut vermischen und 2 h bei 37 °C inkubieren, ohne zu schütteln.
   2. Um das Enzym zu inaktivieren, inkubieren Sie die Probe bei 75 °C für 10 min und drehen Sie sie bei 450 x g, 4 °C, für 20 s nach unten. Fügen Sie 0,5 ml von 10 mM Tris, pH 7,0 hinzu.
   3. Um Nukleinsäure auszufällen, fügen Sie 2 μL GlycoBlue, 550 μL IPA und 55 μL 3 M NaOAc hinzu.
   4. Vortex, um die Proben gründlich zu mischen und bei -80 °C für mindestens 1 h zu kühlen.
      HALTEPUNKT: Proben können über Nacht oder länger bei -80 °C gelagert werden.
   5. Wiederholen Sie die Schritte 5.3.11-5.3.13.
      HALTEPUNKT: Dephosphorylierte RNA kann monatelang bei -80 °C gelagert werden.
5. Quantifizierung mit einem Bioanalyzer
   1. Machen Sie eine 1: 4-Verdünnung jeder RNA-Probe, indem Sie 1 μL Probe und 4 μL DEPC-behandeltes Wasser mischen.
      ACHTUNG: DEPC ist ein Karzinogen. Tragen Sie Handschuhe und arbeiten Sie sorgfältig.
   2. Führen Sie einen Bioanalyzer Small RNA Chip/TapeStation aus. Befolgen Sie das Protokoll des Herstellers.
      HINWEIS: Die erwartete Ribosomen-geschützte RNA-Fragmentgröße liegt bei etwa 28-30 nt.
6. Ligate 3' Ende mit Linker-1
   1. Verdünnen Sie 5 pmol kleiner RNA-Fragmente auf 10 μL mit 10 mM Tris, pH 7,0. Denaturieren Sie die Proben bei 80 °C für 2 Minuten und kühlen Sie sie auf Eis.
   2. Bereiten Sie die Mastermischung wie in Tabelle 4 beschrieben vor und verwenden Sie 29 μL pro Probe.

Reagenz	Menge pro Probe (μL)	Endkonzentration
50% sterilfiltriertes PEG 8000	16	20%
DMSO	4	10%
10× T4 RNA Ligase 2 Puffer	4	1x
SUPERase-In RNase-Inhibitor	2	2 HE
10 mM adenylierter Linker 3-L1	0.1	25 μM
DEPC-behandeltes Wasser	2.9
Letzter Band	29

Tabelle 4: Rezept für 3' End Ligation Master Mix.

3. Fügen Sie 1 μL T4-RNA-Ligase 2 hinzu und pipettieren Sie vorsichtig, um gut zu mischen. Bei 23 °C für 2 h inkubieren.
4. Um die Nukleinsäuren auszufällen, fügen Sie hinzu: 550 μL IPA, 500 μL 10 mM Tris, pH 7,0, 55 μL 3 M NaOAc und 2 μL GlycoBlue. Vortex gründlich mischen und die Proben mindestens 1 h bei -80 °C platzieren.
   HALTEPUNKT: Lagern Sie die Proben über Nacht oder länger bei -80 °C.
5. Wiederholen Sie die Schritte 5.3.2-5.3.12.
6. Resuspendiert das Pellet in 6 μL von 10 mM Tris, pH 7,0. Bei 450 x g, 4 °C für 20 s nach unten drehen und die Probe in ein neues 1,5-ml-Röhrchen überführen.
   HALTEPUNKT: Proben können monatelang bei -80 °C gelagert werden.

7. Gelreinigung von 3' verknüpften Fußabdrücken
   1. Setzen Sie ein 10% FSME-Harnstoff-Polyacrylamid-Gel ein und tauchen Sie in 1x TBE-Laufpuffer ein. 30 Minuten lang bei 200 V laufen, bevor die Probe geladen wird. Zu jeder Probe fügen Sie 6 μL 2x TBE-Harnstoff-Probenpuffer hinzu.
      HINWEIS: Die erwartete Bandgröße liegt bei 71-73 nt.
   2. Wiederholen Sie die Schritte 5.3.2-5.3.13.
      HALTEPUNKT: Proben können monatelang bei -80 °C gelagert werden.
8. Reverse Transkribieren von 3ʹ verknüpften Footprint-Fragmenten zur Generierung von ssDNA
   1. Bereiten Sie eine Mastermischung wie in Tabelle 5 beschrieben vor und verwenden Sie 3 μL pro Probe.

Reagenz	Menge pro Probe (μL)	Endkonzentration
10 mM dNTPs	1	0,5 mM
25 μM Linker L(rt)	0.5	625 nM
DEPC-behandeltes Wasser	1.5
Letzter Band	3

Tabelle 5: Rezeptur für die Reverse-Transkriptionspuffer-Mastermischung vor der Denaturierung von Nukleinsäuren.

2. Wirbeln Sie die Probe ein und drehen Sie sie nach unten.
3. Proben bei 65 °C für 5 min inkubieren.
4. Proben auf Eis kühlen.
5. Bereiten Sie eine Mastermischung wie in Tabelle 6 beschrieben vor und verwenden Sie 6 μL pro Probe. Wirbeln Sie die Probe ein und drehen Sie sie nach unten. 1 μL Superscript III in jede Probe geben und vorsichtig pipettieren, um gut zu mischen und 30 min bei 50 °C zu inkubieren.

Reagenz	Menge pro Probe (μL)	Endkonzentration
5× FS-Puffer	4	1x
SUPERase-In RNase-Inhibitor	1	2 HE
DTT 0,1 Mio.	1	5 mM
Letzter Band	6

Tabelle 6: Rezept für den Reverse Transcription Buffer Master Mix nach der Denaturierung von Nukleinsäuren.

6. Fügen Sie 2,3 μL von 1 N NaOH hinzu, wodurch RNA hydrolysiert und die umgekehrte Transkription gelöscht wird.
   ACHTUNG: NaOH ist stark korrosiv. Tragen Sie Handschuhe und Augenschutz.
7. 15 min bei 95 °C inkubieren, bis die Probe rosa wird.
8. Setzen Sie ein 10% FSME-Harnstoff-Polyacrylamid-Gel ein und tauchen Sie in 1x TBE-Laufpuffer ein. 30 Minuten lang bei 200 V laufen, bevor die Probe geladen wird. Zu jeder Probe fügen Sie 23 μL 2x TBE-Harnstoff-Probenpuffer hinzu.
   HINWEIS: Die erwartete DNA-Bandgröße beträgt 115-117 nt.
9. Wiederholen Sie die Schritte 5.3.2-5.3.12.
10. Resuspendiert das Pellet in 15 μL von 10 mM Tris, pH 8,0. Bei 450 x g, 4 °C für 20 s nach unten drehen und die Probe in ein neues 1,5-ml-Röhrchen überführen.
    HALTEPUNKT: Proben können monatelang bei -80 °C gelagert werden.

9. ssDNA-Zirkularisation
   1. Bereiten Sie die folgende Mastermischung vor und laden Sie 4 μL pro Probe, wie in Tabelle 7 beschrieben.

Reagenz	Menge pro Probe (μL)	Endkonzentration
10× CircLigase II Puffer	2	1x
5 M Betain (optional)	1	0,25 m
50 mM MnCl2	1	2,5 mM
Letzter Band	4

Tabelle 7: Rezept für den ssDNA-Zirkularisierungs-Mastermix .

2. 1 μL CircLigase II ssDNA Ligase in jede Probe geben und für 1 h bei 60 °C inkubieren.
   HINWEIS: Die Effizienz dieses Schritts kann durch Zugabe von 1 μL CircLigase II ssDNA Ligase zu jeder Probe nach 1 Stunde Inkubation erhöht werden.
3. Inaktivieren Sie das Enzym durch Inkubation bei 80 °C für 10 min.
4. Auf Eis kühlen und mit der PCR-Verstärkung fortfahren oder bei -80 °C lagern.
   HALTEPUNKT: Proben können jahrelang bei -80 °C gelagert werden.

10. PCR-Verstärkung
    1. Bereiten Sie den folgenden PCR-Master-Mix vor und laden Sie 82 μL pro Probe, wie in Tabelle 8 beschrieben.

Reagenz	Menge pro Probe (μL)	Endkonzentration
DEPC-behandeltes Wasser	61.6
5× Phusion HF Reaktionspuffer	17.6	1x
10 mM dNTPs	1.8	200 μM
100 μM PCR Vorwärtsprimer	0.2	225 nM
HF-Phusionspolymerase	0.8	1,6 HE
Letzter Band	82

Tabelle 8: Rezept für PCR-Verstärkungs-Mastermix.

2. Zu jedem Röhrchen, das die Mastermischung enthält, fügen Sie 5 μL zirkularisierte DNA hinzu.
   HINWEIS: Lagern Sie den Rest der zirkularisierten DNA-Proben bei -80 °C.
3. Fügen Sie jeder Probe (siehe Tabelle 9) einen anderen 1 μL 20 μM PCR-Reverse-Barcode-Primer hinzu (siehe Tabelle 9) und wirbeln Sie, um gründlich zu mischen.
4. Aliquot jede Röhre in vier separate PCR-Röhren, die jeweils für eine unterschiedliche Anzahl von PCR-Zyklen verwendet werden.
5. Führen Sie eine PCR-Reaktion gemäß dem folgenden Programm aus, wie in Tabelle 10 beschrieben.

Zyklus	Denaturierung (98 °C)	Glühen (60 °C)	Ausfahren (72 °C)
1	30 Sek.
2-16	10 s	10 s	5 s

Tabelle 10: PCR-Programm für die PCR-Reaktion.

6. Nach den Zyklen 8, 9, 10 und 11 werden PCR-Röhrchen (bei IP-Proben reichen die Zyklen von 9 bis 15) als ersten Versuch entfernt. Nach jedem Zyklus pausieren Sie das Programm, nehmen Sie ein Aliquot heraus und legen Sie es auf Eis, und setzen Sie das Programm dann schnell fort.
   HINWEIS: Die Anzahl der Zyklen sollte basierend auf der Menge der zirkularisierten DNA in jeder Reaktion angepasst werden. Ein Beispiel und weitere Erläuterungen finden Sie in Abbildung 4.
7. Zu jeder 17-μL-Reaktion fügen Sie 3,5 μL 6x DNA-Belastungsfarbstoff hinzu.
8. Tauen Sie eine 10 bp DNA-Leiter auf.
9. Für die Größentrennung durch Gelelektrophorese tauchen Sie 8% FSME-Polyacrylamid in 1x TBE-Laufpuffer und laden die Proben jeder verschiedenen Zykluszahl in benachbarte Vertiefungen und lassen das Gel für 50 min bei 180 V laufen.
10. Verdünnen Sie 6 μL SYBR Gold (10.000 x Konzentrat) in 60 ml 1x TBE-Puffer und färben Sie, während Sie in lichtgeschützten Boxen für 15-20 min schütteln.
11. Bereiten Sie beim Färben des Gels ein steriles Skalpell und 0,5 ml Gelbrecherröhrchen in etikettierten 1,5 ml Röhrchen vor.
12. Machen Sie ein Bild der gefärbten Nukleinsäuren.
13. Schneiden Sie das gewünschte Band mit einer erwarteten Bandgröße von 174-176 bp mit dem sterilen Skalpell ab und legen Sie die Gelscheibe in das vorbereitete 0,5 ml Gelbrecherröhrchen (reinigen Sie gründlich zwischen den Proben und verwenden Sie RNase-Inaktivierungsmittel oder wechseln Sie zu einer neuen Klinge).
14. Zentrifugieren Sie die Röhrchen für 5 min bei 20.000 x g und 4 °C und übertragen Sie dann die verbleibenden Gelstücke aus dem 0,5 ml Gelbrecherröhrchen in das 1,5 ml Rohr.
15. 500 μL 10 mM Tris, pH 8,0 hinzufügen und in einem Thermomischer bei 1.400 U/min für 10 min und 70 °C schütteln.
16. Übertragen Sie das gelöste Gel auf eine Celluloseacetatsäule mit einer breiten Pipettenspitze.
17. Zentrifugieren Sie die Kolonne für 3 min bei 20.000 x g und 4 °C und übertragen Sie den Durchfluss auf ein neues 1,5-ml-Rohr und kühlen Sie es auf Eis.
18. Um die Nukleinsäure auszufällen, fügen Sie hinzu: 550 μL IPA, 32 μL 5 M NaCl, 1 μL 0,5 M EDTA und 2 μL GlycoBlue und Vortex, um gründlich zu mischen.
19. Bewahren Sie die Proben mindestens 1 h bei -80 °C oder -20 °C über Nacht auf.
    HALTEPUNKT: Proben können über Nacht oder länger bei -80 °C gelagert werden.
20. Wiederholen Sie die Schritte 5.3.11-5.3.12.
21. Resuspend in 11 μL von 10 mM Tris, pH 8,0. Bei 450 x g, 4 °C für 20 s nach unten drehen und die Probe in ein neues 1,5-ml-Röhrchen überführen.
    HALTEPUNKT: Proben können jahrelang bei -80 °C gelagert werden.

11. Quantifizierung der Größenverteilung durch Bioanalyzer
    1. Nehmen Sie eine 1:4-Verdünnung jeder Probe vor, indem Sie 1 μL Probe mit 4 μL DEPC-behandeltem Wasser mischen.
    2. Führen Sie den Bioanalyzer Small RNA Chip aus. Befolgen Sie das Protokoll des Herstellers.
       HINWEIS: Die erwartete Länge beträgt 175 ± 5 bp.
12. Quantifizierung der DNA-Konzentration durch Fluorometer
    1. Führen Sie eine dsDNA-Hochempfindlichkeitskonzentrationsprüfung mit einem Fluorometer gemäß den Empfehlungen des Herstellers durch.
    2. Multiplex- und Sequenzproben gemäß den Illumina-Empfehlungen (Index Adapters Pooling Guide¹²).

6. Datenanalyse

1. Führen Sie die Analyse wie in der Zusatzdatei beschrieben durch.

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Ergebnisse

Wie im Flussdiagramm dieses Protokolls dargestellt (Abbildung 1), wurden Zellen in die Log-Phase gezüchtet und dann schnell durch Filtration gesammelt und durch kryogenes Mahlen lysiert. Das Lysat wurde dann in zwei Teile geteilt: einen für die gesamten Ribosomen-geschützten mRNA-Fußabdrücke und den anderen für ausgewählte Ribosomen-geschützte mRNA-Fußabdrücke, an denen wir eine Affinitätsreinigung durchführten, um die markierten Protein-Ribosomen-naszierenden Kettenkomplexe heru...

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Diskussion

Hier beschreibt das Protokoll den Selective Ribosome Profiling-Ansatz zur Erfassung co-translationaler Interaktionen in nahezu Codon-Auflösung. Da das Ribosom als Drehscheibe für die Koordination der Entstehung der entstehenden Kette in das überfüllte Zytoplasma aufsteigt, ist dies eine entscheidende Methode, um die verschiedenen co-translationalen Wechselwirkungen zu identifizieren und zu charakterisieren, die zur Gewährleistung eines funktionellen Proteoms sowie zur Untersuchung verschiedener Krankheiten erforder...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
3'-Phosphorylated 28 nt RNA control oligonucleotide	IDT	custom order	RNase free HPLC purification; 5'-AUGUAGUCGGAGUCGAGGCGC GACGCGA/3Phos/-3'
Absolute ethanol	VWR	20821
Acid phenol–chloroform	Ambion	AM9722
Antibody: mouse monclonal anti-HA	Merck	11583816001	12CA5
Aprotinin	Roth	A162.3
ATP*	NEB	P0756S	10 mM
Bacto agar	BD	214030
Bacto peptone	BD	211820
Bacto tryptone	BD	211699
Bacto yeast extract	BD	212720
Bestatin hydrochloride	Roth	2937.2
Chloroform	Merck	102445
CircLigase II ssDNA Ligase*	Epicentre	CL9025K	100 U/μL
Colloidal Coomassie staining solution	Roth	4829
cOmplete, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets	Roche Diagnostics	29384100
Cycloheximide	Biological Industries	A0879
DEPC treated and sterile filtered water*	Sigma	95284
D-Glucose anhydrous	Merck	G5767-500G
Diethylpyrocarbonate	Roth	K028
Dimethylsulfoxide*	Sigma-Aldrich	276855
DNA ladder, 10 bp O'RangeRuler*	Thermo Fisher Scientific	SM1313
DNA loading dye*	Thermo Fisher Scientific	R0631	6×
DNase I, recombinant	Roche	4716728001	RNAse free
dNTP solution set*	NEB	N0446S
EDTA*	Roth	8043
Glycerol	VWR	24388.260.
Glycine solution	Sigma-Aldrich	67419-1ML-F	1 M
GlycoBlue	Ambion	AM9516	15 mg/mL
HEPES	Roth	HN78.3
HF Phusion polymerase*	NEB	M0530L
HK from S. cerevisiae	Sigma-Aldrich	H6380-1.5KU
Hydrochloric acid	AppliChem	A1305
Isopropanol	Sigma-Aldrich	33539
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside	Roth	CN08
Kanamycin	Roth	T832.4
KCl	Roth	6781.1
KH2PO4	Roth	3904.1
Leupeptin	Roth	CN33.4
Linker L(rt)	IDT	custom order
Liquid nitrogen
MgCl2	Roth	KK36.3
Na2HPO4	Roth	P030.2
Na2HPO4·2H2O	Roth	T879.3
NaCl*	Invitrogen	AM97606	5 M
NaH2PO4·H2O	Roth	K300.2
NHS-activated Sepharose 4 fast-flow beads	GE Life Sciences	17090601
Nonidet P 40 substitute	Sigma	74385
Pepstatin A	Roth	2936.2
Phenylmethyl sulfonyl fluoride	Roth	6367
Precast gels	Bio-Rad	5671034	10% and 12%
RNase I	Ambion	AM2294
SDS, 20%	Ambion	AM9820	RNase free
Sodium acetate*	Ambion	AM9740	3 M, pH 5.5
Sodium azide	Merck	S8032-100G
Sodium chloride	Roth	9265
Sodium hydroxide*	Sigma	S2770	1 N
Sucrose	Sigma-Aldrich	16104
SUPERase-In RNase Inhibitor	Ambion	AM2694
Superscript III Reverse Transciptase*	Invitrogen	18080-044
SYBR Gold*	Invitrogen	S11494
T4 polynucleotide kinase*	NEB	M0201L
T4 RNA ligase 2*	NEB	M0242L
TBE polyacrylamide gel*	Novex	EC6215BOX	8%
TBE–urea polyacrylamide gel*	Novex	EC68752BOX	10%
TBE–urea polyacrylamide gel*	Novex	EC6885BOX	15%
TBE–urea sample buffer*	Novex	LC6876	2×
Tris	Roth	4855
Tris*	Ambion	AM9851	1 M, pH 7.0
Tris*	Ambion	AM9856	1 M, pH 8.0
UltraPure 10× TBE buffer*	Invitrogen	15581-044
* - for library preparation
gasket and spring clamp , 90 mm,	Millipore	XX1009020
ground joint flask 1 L ,	Millipore	XX1504705