Identificazione globale delle reti di interazione co-traslazionale mediante profilazione selettiva dei ribosomi

Riepilogo

Le interazioni co-traslazionali svolgono un ruolo cruciale nelle modifiche della catena nascente, nel targeting, nella piegatura e nei percorsi di assemblaggio. Qui, descriviamo il Selective Ribosome Profiling, un metodo per l'analisi diretta in vivo di queste interazioni nel modello eucariota Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

Negli ultimi anni, è diventato evidente che i ribosomi non solo decodificano il nostro mRNA, ma guidano anche l'emergere della catena polipeptidica nell'ambiente cellulare affollato. I ribosomi forniscono la piattaforma per il legame controllato spazialmente e cineticamente di fattori di targeting della membrana, enzimi modificanti e chaperoni pieghevoli. Anche l'assemblaggio in complessi oligomerici di alto ordine, così come le fasi di formazione della rete proteina-proteina, sono stati recentemente scoperti per essere coordinati con la sintesi.

Qui, descriviamo il Selective Ribosome Profiling, un metodo sviluppato per catturare le interazioni co-traduzionali in vivo. Descriveremo in dettaglio le varie fasi di purificazione dell'affinità necessarie per catturare complessi ribosomi-catena nascente insieme agli interattori co-traduzionali, nonché l'estrazione dell'mRNA, l'esclusione delle dimensioni, la trascrizione inversa, il sequenziamento profondo e le fasi di analisi dei big data, necessarie per decifrare le interazioni co-traduzionali nella risoluzione quasi codone.

Introduzione

Selective Ribosome Profiling (SeRP) è l'unico metodo, ad oggi, che cattura e caratterizza le interazioni co-traslazionali, in vivo, in modo diretto ^1,2,3,4,5,6. SeRP consente la profilazione globale delle interazioni di qualsiasi fattore con la traduzione dei ribosomi nella risoluzione vicino al codone ^2,7.

Il metodo si basa sul congelamento flash delle cellule in crescita e sulla conservazione della traduzione attiva. I lisati cellulari vengono quindi trattati con RNasi I per digerire tutto l'mRNA nella cellula ad eccezione dei frammenti di mRNA protetti dai ribosomi chiamati "impronte di ribosomi". Il campione viene quindi diviso in due parti; una parte viene utilizzata direttamente per l'isolamento di tutte le impronte ribosomiali cellulari, rappresentando tutta la traduzione in corso nella cellula. La seconda parte viene utilizzata per l'affinità-purificazione del sottoinsieme specifico di ribosomi associati a un fattore di interesse, ad esempio: modifica di enzimi, fattori di traslocazione, chaperoni di piegatura e interazioni complesso-assemblaggio. Le impronte ribosomiali purificate dall'affinità sono collettivamente chiamate interattoma. Quindi, gli mRNA protetti dai ribosomi vengono estratti e utilizzati per la generazione di librerie di cDNA, seguiti dal sequenziamento profondo.

L'analisi comparativa dei campioni totali di translatome e interactome consente l'identificazione di tutti gli orfs che si associano al fattore di interesse, nonché la caratterizzazione di ciascun profilo di interazione orf. Questo profilo riporta le precise sequenze di insorgenza e terminazione dell'incarico da cui si possono dedurre i codoni decodificati e i rispettivi residui della catena polipeptidica emergente, nonché sulle variazioni di velocità del ribosoma durante l'interazione ^7,8. La Figura 1 illustra il protocollo come schematico.

Figura 1: Panoramica del protocollo SeRP. Questo protocollo può essere eseguito nella sua interezza entro 7-10 giorni. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocollo

1. Generazione di ceppi per la profilazione selettiva dei ribosomi

NOTA: Selective Ribosome Profiling (SeRP) è un metodo che si basa sulla purificazione dell'affinità dei fattori di interesse, per valutare la loro modalità di interazione con i complessi di catene ribosomi-nascenti. La ricombinazione omologa⁹ e i metodi basati su CRISPR / Cas9¹⁰ vengono utilizzati per fondere vari fattori di interesse con tag per purificazioni di affinità. Tali tag sono GFP, per le purificazioni di affinità GFP-trap, TAP-tag per le purificazioni di perline IgG-Sepharose e AVI-Tag purificato da avidina o streptavidina, per elencare alcuni esempi di successo degli ultimi anni.

1. Eseguire test di crescita o funzionali per convalidare che il tagging non abbia avuto un impatto sulla funzione delle proteine. Il tagging terminale N' versus C' dovrebbe essere valutato.
   NOTA: I ribosomi (rRNA), così come molti domini di legame dei ribosomi in vari fattori, sono altamente carichi, rendendo i tag altamente carichi (come la poliistidina) non prefaducibili da usare, poiché possono portare a false scoperte o modalità di legame alterata.

2. Crescita della cultura

1. Coltivare le colture di lievito costruite (basate sul ceppo BY4741), contenenti le proteine marcate desiderate, in un mezzo liquido ricco di estratto di lievito-peptone-destrosio (YPD) o in un mezzo minimo di destrosio sintetico (SD) (1,7 g/L di base di azoto di lievito con solfato di ammonio o 1,7 g/L di lievito a base di azoto senza solfato di ammonio con 1 g/L di acido glutammico monosodico, 2% di glucosio e integrato con una miscela completa o appropriata di aminoacidi).
2. Coltivare 250-500 mL di coltura cellulare fino a 0,5 OD₆₀₀ (mid-log), a 30 °C, in un mezzo appropriato.

3. Raccolta e lisi cellulare

1. Raccogliere rapidamente le celle mediante filtrazione sotto vuoto su una membrana di blotting nitrocellulosa da 0,45 μm con un sistema di filtraggio in vetro (portafiltro in vetro con imbuto di vetro da 1 L, base e tappo sottovuoto, schermo in acciaio inossidabile, guarnizione e morsetto a molla, 90 mm; pallone giunto rettificato 1 L).
2. Flash congelare le cellule raccolte, raschiando le cellule pellettate con una spatola e immergendole immediatamente in un tubo da 50 ml pieno di azoto liquido.
   PUNTO DI ARRESTO: Le cellule possono essere conservate a -80 °C per un massimo di 3-4 settimane.
3. Eseguire la lisi cellulare mediante macinazione criogenica in un mulino miscelatore: due volte per 2 minuti a 30 Hz, con 1 mL del tampone di lisi (vedere Tabella 1). Raffreddare in azoto liquido tra le fresature.

Reagente	Quantità per campione (μL)	Concentrazione finale
10 mg/mL CHX (cicloeximide)	220	0,5 mg/mL
1M Tris-HCl pH 8,0	88	20 mM
3M KCl	205.7	140 metri quadrati
1M MgCl2	26.4	6 mM
1 milione di PMSF	4.4	1 mM
NP-40 ·	4.4	0.10%
Inibitore della proteasi	2 compresse
DNasi I	8.8	0,02 U/mL
Volume finale	4,400

Tabella 1: Ricetta per la miscela master del buffer di lisi.

NOTA: Il tampone di lisi può essere modificato per contenere più inibitori della proteasi (come bestatina, leupeptina, aprotinina, ecc.) nel caso in cui la proteina di interesse sia molto instabile, ma è importante evitare l'EDTA per mantenere le piccole e grandi subunità del ribosoma assemblate durante i passaggi successivi. Per ragioni simili, mantenere sempre almeno 6 mM MgCl₂ nella soluzione tampone.

ATTENZIONE: HCl è altamente corrosivo e PMSF è tossico. Indossare guanti e manico con cura.

4. Centrifugare per 2 min a 30.000 x g, 4 °C per eliminare il lisato e raccogliere il surnatante.

4. Purificazione di complessi ribosomi-catene nascenti per SeRP

1. Per ogni esperimento, dividere il surnatante in due parti; ciascuno in una diversa provetta di microcentrifuga: campione totale di RNA (~ 200 μL) e campione di immunopurificazione (IP) (~ 700 μL) campioni di translatoma.
2. Elaborazione del campione totale di RNA
   1. Digerire il campione totale di RNA utilizzando 10 U di RNasi I per 25 minuti a 4 °C; ruotare a 30 RPM con un rack di miscelazione rotante.
      NOTA: le condizioni di digestione possono essere calibrate utilizzando la profilatura dei polisomi per garantire che non ci sia sovra o sottodigestione del picco dei monosomi.
   2. Preparare la miscela principale del cuscino di saccarosio come descritto nella Tabella 2.

Reagente	Quantità per campione (μL)	Concentrazione finale
50% Saccarosio	200	25%
1M Tris-HCl pH 8,0	8	20 mM
3M KCl	18.7	140 metri quadrati
1M MgCl2	4	10 mM
100 mg/ml di CHX	0.4	0,1 mg/mL
Inibitore della proteasi	1 compressa
Volume finale	400

Tabella 2: Ricetta per il master mix di cuscini di saccarosio.

3. Caricare il campione su 400 μL del cuscino di saccarosio e della centrifuga in un rotore TLA120 per 90 minuti a 245.000 x g e a 4 °C.
4. Rimuovere rapidamente il surnatante con una pompa per vuoto e sovrapporre i pellet con un tampone di lisi da 150 μL. Risospese il pellet agitando per 1 ora a 4 °C e a 300 giri/min.
5. Risospesso il pellet residuo mediante pipettaggio e trasferimento in un nuovo tubo da 1,5 ml.
   NOTA: 100-200 μg di RNA totale sono solitamente sufficienti per la profilazione del ribosoma del translatoma totale. Si può aggiungere la fase di deplezione dell'rRNA al fine di ridurre la contaminazione da rRNA, che è il contaminante più diffuso dei complessi ribosomi-catene nascenti purificazioni di affinit๹ (vedi discussione per ulteriori dettagli).

3. Elaborazione del campione di immunopurazione
   1. Lavare 100-400 μL della matrice legante l'affinità (perline coniugate con anticorpi 1:1 in EtOH al 70%) per campione con tampone di lisi 3 x 1 mL (senza DNasi I e inibitori della proteasi); risospesere la matrice di affinità nel buffer di lisi e quindi ruotare a 30 RPM con un rack di miscelazione rotante a 4 °C per 5 minuti. Precipitato per centrifugazione per 30 s a 3.000 x g, 4 °C. Scartare il liquido superiore. Ripeti tre volte.
   2. Digerire i campioni di immunopurificazione utilizzando 10 U per unità A260 nm di RNasi I, insieme alla matrice di legame di affinità (ad esempio, 100-400 μL di GFP-TRAP per campione).
   3. Ruotare per 25 minuti a 30 RPM con un rack di miscelazione rotante per legare la proteina alla matrice di affinità, a 4 °C.
   4. Preparare la miscela principale del tampone di lavaggio come descritto nella Tabella 3.

Reagente	Quantità per campione (μL)	Concentrazione finale
10 mg/mL CHX	50	0,1 mg/mL
1M Tris-HCl pH 8,0	100	20 mM
3M KCl	233	140 metri quadrati
1M MgCl2	50	10 mM
1 milione di PMSF	5	1 mM
NP-40 ·	0.5	0.01%
Inibitore della proteasi	2 compresse
50% Glicerolo	1,000	10%
Volume finale	5,000

Tabella 3: Ricetta per il mix master del tampone di lavaggio.

5. Lavare la matrice legante l'affinità tre volte con 1 mL di tampone di lavaggio, ogni volta per ~ 1 min, ruotando nel rack di miscelazione a 30 RPM, a 4 °C.
6. Precipitare per centrifugazione a 3.000 x g per 30 s a 4 °C. Scartare il liquido superiore.
7. Lavare altre due volte in 1 mL di tampone di lavaggio, ogni volta per 5 minuti, ruotando nel rack di miscelazione a 30 RPM, a 4 °C.
8. Precipitato per centrifugazione per 30 s a 3.000 x g e 4 °C.
9. Utilizzare 50 μL di perline per l'eluizione proteica con la stessa quantità di 2x tampone campione. Utilizzare il resto delle perline per l'estrazione dell'RNA.
10. Centrifugare per 30 s a 3.000 x g, 4 °C per pellettizzare le perline ed scartare il liquido superiore.
11. Congelare in azoto liquido e conservare a -80 °C. Utilizzare questi campioni per la successiva estrazione dell'RNA.
    PUNTO DI ARRESTO: I campioni possono essere conservati a -80 °C durante la notte o più a lungo. Questo può essere un punto di arresto.
12. Valutare il successo della purificazione dell'affinità passo per western blot o colorazione Coomassie con aliquote (~ 10% in volume, dopo la miscelazione) di ogni fase. Utilizzare sempre l'IP fittizio su un ceppo WT non contrassegnato come controllo per il legame non specifico alla matrice di affinità.
    NOTA: l'elevato background non specifico può essere superato con ulteriori fasi di lavaggio con l'aumentare delle concentrazioni di sale / detersivo. L'interazione transitoria può essere stabilizzata da vari trattamenti con agenti reticolanti, ad esempio il trattamento con paraformaldeide (PFA) delle cellule viventi - l'aggiunta dello 0,4% -1% di PFA ai mezzi di crescita per 2-5 minuti, seguita da spegnimento della glicina (0,3 M) per 3 minuti, è altamente raccomandata.
    ATTENZIONE: La paraformaldeide è un sospetto cancerogeno. Poiché la paraformaldeide evapora rapidamente ed è corrosiva, lavorare in una cappa di sicurezza chimica e indossare due strati di guanti.

5. Preparazione della libreria cDNA per il sequenziamento profondo

1. Estrazione dell'RNA
   NOTA: Lavorare con tubi antiaderenti da 1,5 mL privi di RNasi per prevenire possibili deplezioni di RNA o DNA.
   1. Scongelare i campioni dai passaggi 4.2.5 e 4.3.12 sul ghiaccio e risospese i campioni con 10 mM Tris-HCl pH 7.0 a un volume finale di 700 μL.
      ATTENZIONE: L'acido-fenolo e il cloroformio sono volatili e dannosi. Lavora in una cappa di sicurezza chimica.
   2. Aggiungere 40 μL di SDS al 20% a 0,7 mL di RNA totale o eluizioni IP. Chiudi e inverti un paio di volte. La precipitazione delle proteine dovrebbe rendere i campioni bianchi.
   3. Aggiungere 0,75 ml di acido-fenolo preriscaldato:cloroformio ai campioni. Sigillare saldamente i tubi e agitare in un miscelatore termico a 1.400 giri/min per 5 minuti e a 65 °C. Raffreddare i campioni sul ghiaccio per 5 minuti.
   4. Centrifugare il tubo dal punto 5.1.3. a 20.000 x g per 2 min. Trasferire lo strato acquoso superiore in un tubo fresco e aggiungere ad esso 0,7 ml di acido-fenolo:cloroformio.
   5. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente, occasionalmente vorticosamente. Centrifuga per 2 min a 20.000 x g. Trasferire lo strato acquoso superiore in un tubo fresco e aggiungere ad esso 0,6 ml di cloroformio e vortice.
   6. Centrifuga per 1 min a 20.000 x g. Trasferire lo strato acquoso superiore in un tubo fresco.
   7. Precipitare gli acidi nucleici aggiungendo 78 μL di 3 M NaOAc, pH 5,5, 2 μL di GlycoBlue e 0,75 mL di isopropanolo. Vortice completo per 5 min. Incubare per almeno 1 ora a -80 °C o 16 ore a -20 °C.
   8. Centrifugare per 30 min a 20.000 x g e a 4 °C ed eliminare il surnatante. Lavare il pellet con 0,75 ml ghiacciati di etanolo all'80%. Invertire i tubi per un lavaggio accurato. Centrifugare a 20.000 x g per 5 minuti a 4 °C, quindi scartare il surnatante.
   9. Girare verso il basso a 450 x g, 4 °C per 20 s e rimuovere l'etanolo rimanente ed eliminare i liquidi. Asciugare il pellet con un coperchio aperto per 5 minuti a 65 °C. Sospendere i campioni come segue: per IP risospese il campione in 10 μL di 10 mM Tris-HCl, pH 7.0. Per l'analisi del trasloma totale, risospesare il campione in 20 μL di 10 mM Tris-HCl, pH 7,0.
      PUNTO DI ARRESTO: L'RNA può essere conservato a -80 °C per mesi.
2. Quantificare la concentrazione totale di RNA mediante fluorometria
   NOTA: tutti i seguenti materiali e superfici devono essere privi di RNasi durante la preparazione della libreria di cDNA per il sequenziamento di nuova generazione. Durante la manipolazione di campioni di RNA, indossare guanti.
   1. Diluire 1 μL di RNA totale estratto da fenolo acido in 9 μL di 10 mM Tris-HCl, pH 7,0. Quantificare utilizzando un fluorometro, come indicato sul sito Web del produttore.
   2. Diluire i campioni contenenti 50 μg di RNA con 10 μL di 10 mM Tris-HCl, pH 7,0.
      NOTA: non misurare campioni IP, utilizzare tutto per il passaggio successivo.
3. Frammenti di impronta protetta dal ribosoma purificante in gel
   1. Impostare un gel di poliacrilammide TBE-urea al 15% e immergerlo in 1x TBE running buffer. Eseguire per 30 minuti a 200 V prima del caricamento del campione. A ciascun campione, aggiungere 20 μL di 2x tbe-urea tampone campione.
      NOTA: la dimensione della banda prevista è di circa 25-35 nt.
   2. Scongelare una scala di DNA da 10 bp e denaturare i campioni (non la scala) a 80 °C per 2 minuti, quindi raffreddare sul ghiaccio. Carica ogni campione su ogni altra corsia. Eseguire il gel per 50-70 minuti a 200 V.
   3. Diluire 6 μL di SYBR Gold (10.000 x concentrato) in 60 mL di 1x tbE tampone e macchiare mentre si agita in scatole protette dalla luce per 15-20 min. Durante la colorazione del gel, preparare un bisturi sterile e tubi rompi gel da 0,5 ml in tubi etichettati da 1,5 ml.
   4. Asportare le fasce desiderate con un bisturi sterile (usarne uno fresco o pulire bene tra i campioni) e posizionare ogni pezzo di gel in un tubo rompi-gel.
   5. Scatta un'immagine del gel per assicurarti che nel gel non rimangano residui di campioni.
   6. Centrifugare i tubi contenenti fette tagliate a 20.000 x g per 5 minuti a 4 °C e trasferire i restanti pezzi di gel dal tubo rompi gel al tubo da 1,5 ml.
   7. Aggiungere 0,5 mL di 10 mM Tris, pH 7,0. Agitare in un miscelatore termico a 1.400 giri/min per 10 minuti a 70 °C.
   8. Trasferire su una colonna di acetato di cellulosa con punta a pipetta a foro largo e centrifugare a 20.000 x g per 3 minuti a 4 °C.
   9. Trasferire il flusso attraverso un nuovo tubo da 1,5 ml e raffreddare su ghiaccio.
   10. Per precipitare gli acidi nucleici, aggiungere: 550 μL di IPA, 55 μL di 3 M NaOAc e 2 μL di GlycoBlue e vortice per mescolare accuratamente. Posizionare i campioni a -80 °C per almeno 1 ora.
   11. Centrifugare per almeno 1 ora a 20.000 x g e 4 °C ed eliminare il surnatante. Lavare il pellet con 0,75 ml di etanolo all'80% ghiacciato. Capovolgere i tubi per un lavaggio accurato fino a quando i pellet non si separano dal fondo. Centrifugare nuovamente a 20.000 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante.
   12. Girare verso il basso a 450 x g, 4 °C per 20 s e rimuovere l'etanolo rimanente. Asciugare il pellet con un coperchio aperto per 5 minuti a 65 °C.
   13. Aggiungere 15 μL di 10 mM Tris, pH 7,0 e risospescire accuratamente il pellet. Girare verso il basso a 450 x g, 4 °C per 20 s e trasferire il campione in un nuovo tubo da 1,5 ml.
       PUNTO DI ARRESTO: L'RNA purificato può essere conservato a -80 °C per alcuni mesi.
4. Defosforilazione
   1. Utilizzare 3 μL della seguente miscela per ciascun campione: Aggiungere 1 μL di inibitore della RNasi in 2 μL di 10x T4 tampone di reazione polinucleotide chinasi senza ATP. Aggiungere 2 μL di polinucleotide chinasi T4 a ciascun campione. Pipettare delicatamente per mescolare bene e incubare a 37 °C per 2 ore, senza agitare.
   2. Per inattivare l'enzima, incubare il campione a 75 °C per 10 minuti e ruotare verso il basso a 450 x g, 4 °C, per 20 s. Aggiungere 0,5 mL di 10 mM Tris, pH 7,0.
   3. Per precipitare l'acido nucleico, aggiungere 2 μL di GlycoBlue, 550 μL di IPA e 55 μL di 3 M NaOAc.
   4. Vortice per mescolare accuratamente e raffreddare i campioni a -80 °C per almeno 1 ora.
      PUNTO DI ARRESTO: I campioni possono essere conservati a -80 °C durante la notte o più a lungo.
   5. Ripetere i passaggi 5.3.11-5.3.13.
      PUNTO DI ARRESTO: L'RNA defosforilato può essere conservato a -80 °C per mesi.
5. Quantificazione mediante bioanalizzatore
   1. Effettuare una diluizione 1:4 di ciascun campione di RNA mescolando 1 μL di campione e 4 μL di acqua trattata con DEPC.
      ATTENZIONE: DEPC è cancerogeno. Indossare guanti e lavorare con attenzione.
   2. Eseguire un Bioanalyzer Small RNA Chip/TapeStation. Seguire il protocollo del produttore.
      NOTA: La dimensione prevista del frammento di RNA protetto da ribosomi è di circa 28-30 nt.
6. Ligate 3' fine con Linker-1
   1. Diluire 5 pmol di piccoli frammenti di RNA a 10 μL con 10 mM Tris, pH 7,0. Denaturare i campioni a 80 °C per 2 minuti e raffreddare su ghiaccio.
   2. Preparare la miscela principale come descritto nella Tabella 4 e utilizzare 29 μL per campione.

Reagente	Quantità per campione (μL)	Concentrazione finale
50% PEG 8000 con filtro sterile	16	20%
DMSO	4	10%
10× T4 RNA ligasi 2 tampone	4	1x
Inibitore della RNasi SUPERase-In	2	2 U
10 mM linker adenilato 3-L1	0.1	25 μM
Acqua trattata con DEPC	2.9
Volume finale	29

Tabella 4: Ricetta per 3' end ligation master mix.

3. Aggiungere 1 μL di T4 RNA ligasi 2 e pipettare delicatamente per mescolare bene. Incubare a 23 °C per 2 ore.
4. Per precipitare gli acidi nucleici, aggiungere: 550 μL di IPA, 500 μL di 10 mM Tris, pH 7,0, 55 μL di 3 M NaOAc e 2 μL di GlycoBlue. Vortice per mescolare accuratamente e posizionare i campioni a -80 °C per almeno 1 ora.
   PUNTO DI ARRESTO: Conservare i campioni a -80 °C durante la notte o più a lungo.
5. Ripetere i passaggi 5.3.2-5.3.12.
6. Risospendare il pellet in 6 μL di 10 mM Tris, pH 7.0. Girare verso il basso a 450 x g, 4 °C per 20 s, e trasferire il campione in un nuovo tubo da 1,5 ml.
   PUNTO DI ARRESTO: I campioni possono essere conservati a -80 °C per mesi.

7. Purificazione in gel di impronte collegate a 3'
   1. Impostare un gel di poliacrilammide TBE-urea al 10% e immergerlo in 1x TBE running buffer. Eseguire per 30 minuti a 200 V prima del caricamento del campione. A ciascun campione, aggiungere 6 μL di 2x tbe-urea tampone campione.
      NOTA: la dimensione della banda prevista è di circa 71-73 nt.
   2. Ripetere i passaggi 5.3.2-5.3.13.
      PUNTO DI ARRESTO: I campioni possono essere conservati a -80 °C per mesi.
8. Trascrivere inversamente frammenti di footprint collegati a 3ʹ per generare ssDNA
   1. Preparare una miscela principale come descritto nella Tabella 5 e utilizzare 3 μL per campione.

Reagente	Quantità per campione (μL)	Concentrazione finale
10 mM dNTPs	1	0,5 mM
25 μM Linker L(rt)	0.5	625 nM
Acqua trattata con DEPC	1.5
Volume finale	3

Tabella 5: Ricetta per la miscela master del buffer di trascrizione inversa prima della denaturazione degli acidi nucleici.

2. Vortice e rotazione verso il basso del campione.
3. Incubare i campioni a 65 °C per 5 min.
4. Raffreddare i campioni sul ghiaccio.
5. Preparare una miscela principale come descritto nella Tabella 6 e utilizzare 6 μL per campione. Vortice e rotazione verso il basso del campione. Aggiungere 1 μL di Apice III a ciascun campione e pipettare delicatamente per mescolare bene e incubare per 30 minuti a 50 °C.

Reagente	Quantità per campione (μL)	Concentrazione finale
5× Buffer FS	4	1x
Inibitore della RNasi SUPERase-In	1	2 U
DTT 0,1 M	1	5 mM
Volume finale	6

Tabella 6: Ricetta per il master mix del buffer di trascrizione inversa dopo la denaturazione degli acidi nucleici.

6. Aggiungere 2,3 μL di 1 N NaOH, che idrolizza l'RNA e spegne la trascrizione inversa.
   ATTENZIONE: NaOH è altamente corrosivo. Indossare guanti e protezione per gli occhi.
7. Incubare per 15 minuti a 95 °C, fino a quando il campione diventa rosa.
8. Impostare un gel di poliacrilammide TBE-urea al 10% e immergerlo in 1x TBE running buffer. Eseguire per 30 minuti a 200 V prima del caricamento del campione. A ciascun campione, aggiungere 23 μL di 2x tbe-urea tampone campione.
   NOTA: la dimensione prevista della banda del DNA è 115-117 nt.
9. Ripetere i passaggi 5.3.2-5.3.12.
10. Risospendare il pellet in 15 μL di 10 mM Tris, pH 8,0. Girare verso il basso a 450 x g, 4 °C per 20 s e trasferire il campione in un nuovo tubo da 1,5 ml.
    PUNTO DI ARRESTO: I campioni possono essere conservati a -80 °C per mesi.

9. Circolarizzazione ssDNA
   1. Preparare la seguente miscela principale e caricare 4 μL per campione, come descritto nella Tabella 7.

Reagente	Quantità per campione (μL)	Concentrazione finale
10× Tampone CircLigase II	2	1x
5 M Betaina (opzionale)	1	0,25 m
50 mM MnCl2	1	2,5 mM
Volume finale	4

Tabella 7: Ricetta per il master mix di circolarizzazione ssDNA.

2. Aggiungere 1 μL di CircLigase II ssDNA ligasi a ciascun campione e incubare per 1 ora a 60 °C.
   NOTA: L'efficienza di questa fase può essere aumentata aggiungendo 1 μL di CircLigase II ssDNA ligasi a ciascun campione dopo 1 ora di incubazione.
3. Inattivare l'enzima incubando a 80 °C per 10 min.
4. Raffreddare su ghiaccio e continuare ad amplificare PCR o conservare a -80 °C.
   PUNTO DI ARRESTO: I campioni possono essere conservati a -80 °C per anni.

10. Amplificazione PCR
    1. Preparare la seguente miscela master PCR e caricare 82 μL per campione, come dettagliato nella Tabella 8.

Reagente	Quantità per campione (μL)	Concentrazione finale
Acqua trattata con DEPC	61.6
5× Tampone di reazione Phusion HF	17.6	1x
10 mM dNTPs	1.8	200 μM
Primer anteriore PCR da 100 μM	0.2	225 nM
HF Phusion polimerasi	0.8	1,6 U
Volume finale	82

Tabella 8: Ricetta per il master mix di amplificazione PCR.

2. Ad ogni tubo contenente miscela master, aggiungere 5 μL di DNA circolarizzato.
   NOTA: Conservare il resto dei campioni di DNA circolarizzati a -80 °C.
3. Aggiungere un diverso primer per codice a barre inverso PCR da 1 μL da 20 μM a ciascun campione (vedere Tabella 9) e un vortice per mescolare accuratamente.
4. Aliquotare ogni tubo in quattro tubi PCR separati, ciascuno dei quali sarà utilizzato per un diverso numero di cicli pcr.
5. Eseguire una reazione PCR secondo il seguente programma, come dettagliato nella Tabella 10.

Ciclo	Denaturazione (98 °C)	Ricottura (60 °C)	Estensione (72 °C)
1	30 anni
2-16	10 s	10 s	5 s

Tabella 10: Programma PCR per la reazione PCR.

6. Dopo i cicli 8, 9, 10 e 11 rimuovere i tubi PCR (per i campioni IP, i cicli vanno da 9 a 15) come primo tentativo. Dopo ogni ciclo, metti in pausa il programma, togli un'aliquota e mettila sul ghiaccio, quindi riprendi rapidamente il programma.
   NOTA: Il numero di cicli deve essere regolato in base alla quantità di DNA circolarizzato in ogni reazione. Fare riferimento alla Figura 4 per un esempio e ulteriori chiarimenti.
7. Ad ogni reazione da 17 μL, aggiungere 3,5 μL di colorante a carico di DNA 6x.
8. Scongelare una scala del DNA da 10 bp.
9. Per la separazione dimensionale mediante elettroforesi su gel, immergere l'8% di poliacrilammide TBE in 1x TBE running buffer e caricare i campioni di ogni diverso numero di ciclo in pozzi adiacenti ed eseguire il gel per 50 minuti a 180 V.
10. Diluire 6 μL di SYBR Gold (10.000 x concentrato) in 60 mL di 1x tbE tampone e macchiare mentre si agita in scatole protette dalla luce per 15-20 min.
11. Durante la colorazione del gel, preparare un bisturi sterile e tubi rompi gel da 0,5 ml in tubi etichettati da 1,5 ml.
12. Scatta un'immagine degli acidi nucleici colorati.
13. Tagliare la fascia desiderata con una dimensione prevista della banda di 174-176 bp con il bisturi sterile e posizionare la fetta di gel nel tubo gel-breaker preparato da 0,5 ml (pulire accuratamente tra i campioni e utilizzare l'agente inattivante RNase o passare a una nuova lama).
14. Centrifugare i tubi per 5 minuti a 20.000 x g e 4 °C, quindi trasferire i restanti pezzi di gel dal tubo rompi gel da 0,5 mL al tubo da 1,5 ml.
15. Aggiungere 500 μL di 10 mM Tris, pH 8,0 e agitare in un miscelatore termico a 1.400 RPM per 10 min e 70 °C.
16. Trasferire il gel disciolto su una colonna di acetato di cellulosa con una punta a pipetta a foro largo.
17. Centrifugare la colonna per 3 minuti a 20.000 x g e 4 °C e trasferire il flusso attraverso un nuovo tubo da 1,5 ml e raffreddare su ghiaccio.
18. Per precipitare l'acido nucleico, aggiungere: 550 μL di IPA, 32 μL di 5 M NaCl, 1 μL di 0,5 M EDTA e 2 μL di GlycoBlue e vortice per mescolare accuratamente.
19. Conservare i campioni per almeno 1 ora a -80 °C o -20 °C durante la notte.
    PUNTO DI ARRESTO: I campioni possono essere conservati a -80 °C durante la notte o più a lungo.
20. Ripetere i passaggi 5.3.11-5.3.12.
21. Risospeso in 11 μL di 10 mM Tris, pH 8,0. Girare verso il basso a 450 x g, 4 °C per 20 s e trasferire il campione in un nuovo tubo da 1,5 ml.
    PUNTO DI ARRESTO: I campioni possono essere conservati a -80 °C per anni.

11. Quantificare la distribuzione dimensionale mediante Bioanalyzer
    1. Effettuare una diluizione 1:4 di ciascun campione mescolando 1 μL di campione con 4 μL di acqua trattata con DEPC.
    2. Esegui il Bioanalyzer Small RNA Chip. Seguire il protocollo del produttore.
       NOTA: la lunghezza prevista è di 175 ± 5 bp.
12. Quantificare la concentrazione di DNA mediante fluorometro
    1. Eseguire un controllo della concentrazione ad alta sensibilità del dsDNA con un fluorometro secondo le raccomandazioni del produttore.
    2. Multiplex e campioni di sequenza secondo le raccomandazioni Illumina (Index Adapters Pooling Guide¹²).

6. Analisi dei dati

1. Eseguire l'analisi come dettagliato nel file supplementare.

Risultati

Come illustrato nel diagramma di flusso di questo protocollo (Figura 1), le cellule sono state coltivate fino alla fase di log, e poi raccolte rapidamente per filtrazione e lisate mediante macinazione criogenica. Il lisato è stato poi diviso in due: uno per le impronte totali di mRNA protette dai ribosomi e l'altro per impronte di mRNA protette da ribosomi selezionate, su cui abbiamo eseguito la purificazione dell'affinità per abbattere i complessi di catene proteiche-ribosomi-nascenti mar...

Discussione

Qui, il protocollo descrive in dettaglio l'approccio Selective Ribosome Profiling per l'acquisizione di interazioni co-traslazionali in risoluzione quasi codone. Mentre il ribosoma sale come hub per coordinare l'emergenza della catena nascente nel citoplasma affollato, questo è un metodo cruciale per identificare e caratterizzare le varie interazioni co-traduzionali necessarie per garantire un proteoma funzionale, nonché per studiare varie malattie. Ad oggi, la SeRP è l'unico metodo in grado di catturare e caratteriz...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
3'-Phosphorylated 28 nt RNA control oligonucleotide	IDT	custom order	RNase free HPLC purification; 5'-AUGUAGUCGGAGUCGAGGCGC GACGCGA/3Phos/-3'
Absolute ethanol	VWR	20821
Acid phenol–chloroform	Ambion	AM9722
Antibody: mouse monclonal anti-HA	Merck	11583816001	12CA5
Aprotinin	Roth	A162.3
ATP*	NEB	P0756S	10 mM
Bacto agar	BD	214030
Bacto peptone	BD	211820
Bacto tryptone	BD	211699
Bacto yeast extract	BD	212720
Bestatin hydrochloride	Roth	2937.2
Chloroform	Merck	102445
CircLigase II ssDNA Ligase*	Epicentre	CL9025K	100 U/μL
Colloidal Coomassie staining solution	Roth	4829
cOmplete, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets	Roche Diagnostics	29384100
Cycloheximide	Biological Industries	A0879
DEPC treated and sterile filtered water*	Sigma	95284
D-Glucose anhydrous	Merck	G5767-500G
Diethylpyrocarbonate	Roth	K028
Dimethylsulfoxide*	Sigma-Aldrich	276855
DNA ladder, 10 bp O'RangeRuler*	Thermo Fisher Scientific	SM1313
DNA loading dye*	Thermo Fisher Scientific	R0631	6×
DNase I, recombinant	Roche	4716728001	RNAse free
dNTP solution set*	NEB	N0446S
EDTA*	Roth	8043
Glycerol	VWR	24388.260.
Glycine solution	Sigma-Aldrich	67419-1ML-F	1 M
GlycoBlue	Ambion	AM9516	15 mg/mL
HEPES	Roth	HN78.3
HF Phusion polymerase*	NEB	M0530L
HK from S. cerevisiae	Sigma-Aldrich	H6380-1.5KU
Hydrochloric acid	AppliChem	A1305
Isopropanol	Sigma-Aldrich	33539
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside	Roth	CN08
Kanamycin	Roth	T832.4
KCl	Roth	6781.1
KH2PO4	Roth	3904.1
Leupeptin	Roth	CN33.4
Linker L(rt)	IDT	custom order
Liquid nitrogen
MgCl2	Roth	KK36.3
Na2HPO4	Roth	P030.2
Na2HPO4·2H2O	Roth	T879.3
NaCl*	Invitrogen	AM97606	5 M
NaH2PO4·H2O	Roth	K300.2
NHS-activated Sepharose 4 fast-flow beads	GE Life Sciences	17090601
Nonidet P 40 substitute	Sigma	74385
Pepstatin A	Roth	2936.2
Phenylmethyl sulfonyl fluoride	Roth	6367
Precast gels	Bio-Rad	5671034	10% and 12%
RNase I	Ambion	AM2294
SDS, 20%	Ambion	AM9820	RNase free
Sodium acetate*	Ambion	AM9740	3 M, pH 5.5
Sodium azide	Merck	S8032-100G
Sodium chloride	Roth	9265
Sodium hydroxide*	Sigma	S2770	1 N
Sucrose	Sigma-Aldrich	16104
SUPERase-In RNase Inhibitor	Ambion	AM2694
Superscript III Reverse Transciptase*	Invitrogen	18080-044
SYBR Gold*	Invitrogen	S11494
T4 polynucleotide kinase*	NEB	M0201L
T4 RNA ligase 2*	NEB	M0242L
TBE polyacrylamide gel*	Novex	EC6215BOX	8%
TBE–urea polyacrylamide gel*	Novex	EC68752BOX	10%
TBE–urea polyacrylamide gel*	Novex	EC6885BOX	15%
TBE–urea sample buffer*	Novex	LC6876	2×
Tris	Roth	4855
Tris*	Ambion	AM9851	1 M, pH 7.0
Tris*	Ambion	AM9856	1 M, pH 8.0
UltraPure 10× TBE buffer*	Invitrogen	15581-044
* - for library preparation
gasket and spring clamp , 90 mm,	Millipore	XX1009020
ground joint flask 1 L ,	Millipore	XX1504705