Ko-Translasyonel Etkileşim Ağlarının Seçici Ribozom Profilleme ile Küresel Tanımlanması

Özet

Ko-translasyonel etkileşimler, yeni zincir modifikasyonlarında, hedeflemede, katlamada ve montaj yollarında çok önemli bir rol oynamaktadır. Burada, ökaryot Saccharomyces cerevisiae modelinde bu etkileşimlerin in vivo, doğrudan analizi için bir yöntem olan Seçici Ribozom Profillemeyi açıklıyoruz.

Özet

Son yıllarda, ribozomların sadece mRNA'mızın şifresini çözmekle kalmayıp, aynı zamanda polipeptit zincirinin kalabalık hücresel ortama ortaya çıkmasına rehberlik ettiği de ortaya çıkmıştır. Ribozomlar, membran hedefleme faktörlerinin uzamsal ve kinetik olarak kontrol edilen bağlanması, enzimlerin modifiye edilmesi ve şaperonların katlanması için platform sağlar. Yüksek dereceli oligomerik komplekslere ve protein-protein ağı oluşum adımlarına montajın bile sentezle koordine edildiği yakın zamanda keşfedilmiştir.

Burada, in vivo olarak eş-translasyonel etkileşimleri yakalamak için geliştirilmiş bir yöntem olan Seçici Ribozom Profillemeyi açıklıyoruz. Ribozom-nazen-zincir komplekslerini ko-translasyonel interaktörlerle birlikte yakalamak için gereken çeşitli afinite saflaştırma adımlarını ve ayrıca kodona yakın çözünürlükte ko-translasyonel etkileşimleri deşifre etmek için gereken mRNA ekstraksiyonu, boyut dışlama, ters transkripsiyon, derin dizileme ve büyük veri analizi adımlarını detaylandıracağız.

Giriş

Selective Ribozom Profiling (SeRP), bugüne kadar, ko-translasyonel etkileşimleri, in vivo, doğrudan bir şekilde 1,2,3,4,5,6 olarak yakalayan ve karakterize eden tek yöntemdir. SeRP, ribozomların ^2,7'ye yakın çözünürlükte çevrilmesiyle herhangi bir faktörün etkileşimlerinin global profillenmesini sağlar.

Yöntem, büyüyen hücrelerin flaş dondurulmasına ve aktif çevirinin korunmasına dayanır. Hücre lizatları daha sonra "ribozom ayak izleri" olarak adlandırılan ribozom korumalı mRNA fragmanları hariç hücredeki tüm mRNA'yı sindirmek için RNaz I ile muamele edilir. Numune daha sonra iki bölüme ayrılır; Bir kısım doğrudan tüm hücresel ribozomal ayak izlerinin izolasyonu için kullanılır ve hücrede devam eden tüm translasyonu temsil eder. İkinci bölüm, bir ilgi faktörü ile ilişkili ribozomların spesifik alt kümesinin afinite saflaştırılması için kullanılır, örneğin: enzimleri değiştirmek, translokasyon faktörleri, şaperonları katlamak ve karmaşık montaj etkileşimleri. Afinite saflaştırılmış ribozomal ayak izleri topluca interaktom olarak adlandırılır. Daha sonra, ribozom korumalı mRNA'lar ekstrakte edilir ve cDNA kütüphanesi üretimi için kullanılır, ardından derin dizileme yapılır.

Toplam translatom ve interaktom örneklerinin karşılaştırmalı analizi, ilgi faktörü ile ilişkili tüm orfların tanımlanmasına ve her bir orf etkileşim profilinin karakterizasyonuna izin verir. Bu profil, kodu çözülmüş kodonları ve ortaya çıkan polipeptit zincirinin ilgili kalıntılarını ve ayrıca etkileşim ^7,8 sırasındaki ribozom hız değişimlerini çıkarabileceğiniz kesin katılım başlangıcı ve sonlandırma dizilerini rapor eder. Şekil 1'de protokol şematik olarak gösterilmektedir.

Şekil 1: SeRP protokolüne genel bakış. Bu protokol 7-10 gün içinde bütünüyle gerçekleştirilebilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Protokol

1. Seçici Ribozom Profilleme için suşların oluşturulması

NOT: Selective Ribozom Profiling (SeRP), ribozom-yeni ortaya çıkan zincir kompleksleri ile etkileşim tarzlarını değerlendirmek için ilgi faktörlerinin afinite saflaştırılmasına dayanan bir yöntemdir. Homolog rekombinasyon⁹ ve CRISPR / Cas9¹⁰ tabanlı yöntemler, çeşitli ilgi çekici faktörleri afinite saflaştırmaları için etiketlerle birleştirmek için kullanılır. Bu tür etiketler, GFP-tuzak afinite saflaştırmaları için GFP, IgG-Sepharose boncuk saflaştırmaları için TAP etiketi ve avidin veya streptavidin tarafından saflaştırılmış AVI-Tag'dir.

1. Etiketlemenin proteinlerin işlevini etkilemediğini doğrulamak için büyüme veya fonksiyonel testler yapın. N' ve C' terminal etiketlemesi değerlendirilmelidir.
   NOT: Ribozomlar (rRNA) ve çeşitli faktörlerdeki birçok ribozom bağlayıcı etki alanı yüksek oranda yüklüdür, bu da yanlış keşfe veya değiştirilmiş bağlanma moduna yol açabileceğinden, yüksek yüklü etiketlerin (polihistidin gibi) kullanılmasını tercih edilmez hale getirir.

2. Kültür gelişimi

1. İstenilen etiketli proteinleri içeren inşa edilmiş maya kültürlerini (BY4741 suşuna dayanarak), sıvı maya-ekstrakt-pepton-dekstroz (YPD) bakımından zengin ortamda veya sentetik dekstroz (SD) minimal ortamda (amonyum sülfatlı 1.7 g / L maya azot baz veya 1 g / L monosodyum glutamik asit, % 2 glikoz ile amonyum sülfat içermeyen 1.7 g / L maya azot bazı, tam veya uygun bir amino asit karışımı ile desteklenmiş) yetiştirin.
2. 250-500 mL hücre kültürünü, uygun bir ortamda,₃₀ ° C'de 0.5 OD 600'e (orta log) büyütün.

3. Hücre toplama ve lizis

1. Cam filtreleme sistemli 0,45 μm nitroselüloz lekeleme membranı (1 L cam hunili cam filtre tutucu, vakum tabanı ve kapak, paslanmaz çelik elek, conta ve yay kelepçesi, 90 mm; zemin derzi şişesi 1 L) üzerinde vakum filtrasyonu ile hücreleri hızla toplayın.
2. Pelet edilmiş hücreleri bir spatula ile kazıyarak ve hemen sıvı azot dolu 50 mL'lik bir tüpe batırarak toplanan hücreleri dondurun.
   DURMA NOKTASI: Hücreler -80 °C'de 3-4 haftaya kadar saklanabilir.
3. Bir karıştırıcı değirmeninde kriyojenik öğütme ile hücre lizisini gerçekleştirin: lizis tamponunun 1 mL'si ile 30 Hz'de 2 dakika boyunca iki kez (bkz. Tablo 1). Frezelemeler arasında sıvı azotta soğutun.

Reaktif	Numune başına miktar (μL)	Son konsantrasyon
10 mg/mL CHX (sikloheksimid)	220	0.5 mg/mL
1M Tris-HCl pH 8,0	88	20 mM
3M KCl	205.7	140 mM
1M MgCl2	26.4	6 mM
1 milyon PMSF	4.4	1 mM
NP-40 Serisi	4.4	0.10%
Proteaz inhibitörü	2 tablet
DNase I	8.8	0,02 U/mL
Son cilt	4,400

Tablo 1: Lizis tamponu ana karışımı için tarif.

NOT: Lizis tamponu, ilgilenilen proteinin çok kararsız olması durumunda daha fazla proteaz inhibitörü (bestatin, leupeptin, aprotinin vb. gibi) içerecek şekilde değiştirilebilir, ancak ribozomun aşağıdaki adımlar sırasında monte edilen küçük ve büyük alt birimlerini korumak için EDTA'dan kaçınmak önemlidir. Benzer nedenlerden dolayı, tampon çözeltisinde daima en az 6 mM MgCl₂ bulundurun.

DİKKAT: HCl oldukça aşındırıcıdır ve PMSF toksiktir. Eldiven giyin ve dikkatli kullanın.

4. Lisatı temizlemek ve süpernatan toplamak için 30.000 x g, 4 °C'de 2 dakika santrifüj yapın.

4. SeRP için ribozom-nazen-zincir komplekslerinin saflaştırılması

1. Her deney için, süpernatantı iki bölüme ayırın; her biri farklı bir mikrosantrifüj tüpünde: toplam RNA örneği (~200 μL) ve immünopurifikasyon (IP) numunesi (~700 μL) translatom örnekleri.
2. Toplam RNA örneğinin işlenmesi
   1. Toplam RNA örneğini 4 ° C'de 25 dakika boyunca 10 U RNaz I kullanarak sindirin; dönen bir karışım rafı ile 30 RPM'de döndürün.
      NOT: Sindirim koşulları, monozomların aşırı veya az sindiriminin pik olmadığından emin olmak için polizom profilleme kullanılarak kalibre edilebilir.
   2. Sakkaroz yastığı ana karışımını Tablo 2'de açıklandığı gibi hazırlayın.

Reaktif	Numune başına miktar (μL)	Son konsantrasyon
%50 Sakkaroz	200	25%
1M Tris-HCl pH 8,0	8	20 mM
3M KCl	18.7	140 mM
1M MgCl2	4	10 mM
100 mg/mL CHX	0.4	0.1 mg/mL
Proteaz inhibitörü	1 tablet
Son cilt	400

Tablo 2: Sakkaroz yastığı ana karışımı tarifi.

3. Numuneyi 400 μL sakkaroz yastığına yükleyin ve TLA120 rotorlu santrifüjü 245.000 x g ve 4 °C'de 90 dakika boyunca santrifüj yapın.
4. Süpernatantı bir vakum pompası ile hızlı bir şekilde çıkarın ve 150 μL lizis tamponu ile peletleri yerleştirin. Peletleri 4 °C'de ve 300 RPM'de 1 saat sallayarak yeniden askıya alın.
5. Artık peleti pipetle bağlayarak ve yeni bir 1,5 mL tüpe aktararak yeniden askıya alın.
   NOT: Toplam translatomun ribozom profilinin çıkarılması için genellikle 100-200 μg toplam RNA yeterlidir. Ribozom-yeni doğan zincir komplekslerinin en yaygın kirleticisi olan rRNA kontaminasyonunu azaltmak için rRNA tükenme adımı eklenebilir¹¹ (daha fazla ayrıntı için tartışmaya bakınız).

3. İmmünopurifikasyon numunesinin işlenmesi
   1. Örnek başına 100-400 μL afinite bağlayıcı matrisi (% 70 EtOH'de 1: 1 antikor konjuge boncuklar) 3 x 1 mL lizis tamponu (DNaz I ve proteaz inhibitörleri olmadan) ile yıkayın; Lizis tamponundaki afinite matrisini yeniden askıya alın ve ardından 5 dakika boyunca 4 ° C'de dönen bir karışım rafı ile 30 RPM'de döndürün. 3.000 x g, 4 °C'de 30 s santrifüjleme ile çökeltin. Üst sıvıyı atın. Üç kez tekrarlayın.
   2. İmmünopurifikasyon numunelerini, A260 nm RNaz I birimi başına 10 U, afinite bağlayıcı matris (örneğin, numune başına 100-400 μL GFP-TRAP) ile birlikte sindirin.
   3. Proteini 4 ° C'de afinite matrisine bağlamak için dönen bir karışım rafı ile 30 RPM'de 25 dakika döndürün.
   4. Yıkama tamponu ana karışımını Tablo 3'te ayrıntılı olarak açıklandığı şekilde hazırlayın.

Reaktif	Numune başına miktar (μL)	Son konsantrasyon
10 mg/mL CHX	50	0.1 mg/mL
1M Tris-HCl pH 8,0	100	20 mM
3M KCl	233	140 mM
1M MgCl2	50	10 mM
1 milyon PMSF	5	1 mM
NP-40 Serisi	0.5	0.01%
Proteaz inhibitörü	2 tablet
%50 Gliserol	1,000	10%
Son cilt	5,000

Tablo 3: Yıkama tamponu ana karışımı için tarif.

5. Afinite bağlama matrisini, her seferinde ~ 1 dakika boyunca, karışım rafında 30 RPM'de, 4 ° C'de döndürerek, 1 mL yıkama tamponu ile üç kez yıkayın.
6. 4 °C'de 30 s için 3.000 x g'de santrifüjleme ile çökeltin. Üst sıvıyı atın.
7. 1 mL yıkama tamponunda, her seferinde 5 dakika boyunca, karışım rafında 30 RPM'de, 4 °C'de dönerek iki kez daha yıkayın.
8. 3.000 x g ve 4 °C'de 30 s santrifüjleme ile çökeltin.
9. Aynı miktarda 2x numune tamponu ile protein elüsyonu için 50 μL boncuk kullanın. RNA ekstraksiyonu için boncukların geri kalanını kullanın.
10. Boncukları peletlemek ve üst sıvıyı atmak için 3.000 x g, 4 °C'de 30 s santrifüj.
11. Sıvı azotta dondurun ve -80 °C'de saklayın. Bu örnekleri sonraki RNA ekstraksiyonu için kullanın.
    DURMA NOKTASI: Numuneler gece boyunca -80 °C'de veya daha uzun süre saklanabilir. Bu bir durma noktası olabilir.
12. Her adımın afinite saflaştırma adımının başarısını batı lekesi veya Coomassie boyaması ile alikotlarla (karıştırmadan sonra hacimce ~% 10) değerlendirin. Benzeşim matrisine spesifik olmayan bağlanma denetimi olarak etiketsiz bir WT suşunda her zaman sahte IP kullanın.
    NOT: Yüksek spesifik olmayan arka plan, artan tuz/deterjan konsantrasyonları ile ek yıkama adımlarıyla aşılabilir. Geçici etkileşim, çeşitli çapraz bağlayıcı ajanların tedavisi ile stabilize edilebilir, örneğin, canlı hücrelerin paraformaldehit (PFA) tedavisi - 2-5 dakika boyunca büyüme ortamına% 0.4 -% 1 PFA eklenmesi, ardından 3 dakika boyunca glisin (0.3 M) söndürülmesi şiddetle tavsiye edilir.
    DİKKAT: Paraformaldehit şüpheli bir kanserojendir. Paraformaldehit hızla buharlaştığından ve aşındırıcı olduğundan, kimyasal bir güvenlik başlığında çalışın ve iki kat eldiven giyin.

5. Derin dizileme için cDNA kütüphanesi hazırlığı

1. RNA ekstraksiyonu
   NOT: Olası RNA veya DNA tükenmesini önlemek için RNaz içermeyen yapışmaz 1,5 mL tüplerle çalışın.
   1. 4.2.5 ve 4.3.12 adımlarındaki numuneleri buz üzerinde çözün ve 10 mM Tris-HCl pH 7.0 ile numuneleri 700 μL'lik son hacme kadar askıya alın.
      DİKKAT: Asit-fenol ve kloroform uçucu ve zararlıdır. Kimyasal bir güvenlik başlığında çalışın.
   2. 0,7 mL Toplam RNA veya IP salınımlarına 40 μL %20 SDS ekleyin. Birkaç kez kapatın ve ters çevirin. Protein çökeltisi numuneleri beyaza çevirmelidir.
   3. Numunelere 0,75 mL önceden ısıtılmış asit-fenol:kloroform ekleyin. Tüpleri sıkıca kapatın ve termal karıştırıcıda 1.400 RPM'de 5 dakika ve 65 ° C'de çalkalayın. Örnekleri buz üzerinde 5 dakika soğutun.
   4. Tüpü adım 5.1.3'ten itibaren santrifüj yapın. 2 dakika boyunca 20.000 x g'de . Üst sulu tabakayı taze bir tüpe aktarın ve 0.7 mL asit-fenol:kloroform ekleyin.
   5. Oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatın, bazen girdap yapın. 20.000 x g'de 2 dakika santrifüj. Üst sulu tabakayı taze bir tüpe aktarın ve 0.6 mL kloroform ve vorteks ekleyin.
   6. 20.000 x g'de 1 dakika santrifüj. Üst sulu tabakayı taze bir tüpe aktarın.
   7. 78 μL 3 M NaOAc, pH 5.5, 2 μL GlycoBlue ve 0.75 mL izopropanol ekleyerek nükleik asitleri çökeltin. Vorteksi 5 dakika boyunca iyice yıkın. -80 °C'de en az 1 saat veya -20 °C'de 16 saat inkübe edin.
   8. 20.000 x g ve 4 ° C'de 30 dakika santrifüj yapın ve süpernatanı atın. Peletleri buz gibi soğuk 0.75 mL% 80 etanol ile yıkayın. Kapsamlı bir yıkama için tüpleri ters çevirin. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 20.000 x g'de santrifüj yapın ve ardından süpernatanı atın.
   9. 450 x g, 4 °C'de 20 s boyunca döndürün ve kalan etanolleri çıkarın ve sıvıları atın. Peleti açık kapakla 65 °C'de 5 dakika kurulayın. Numuneleri aşağıdaki gibi yeniden askıya alın: IP için numuneyi 10 mM Tris-HCl, pH 7.0'ın 10 μL'sinde yeniden askıya alın. Toplam translatom analizi için, numuneyi 10 mM Tris-HCl, pH 7.0'lık 20 μL'de yeniden askıya alın.
      DURMA NOKTASI: RNA -80 °C'de aylarca saklanabilir.
2. Florometri ile toplam RNA konsantrasyonunu ölçme
   NOT: cDNA kütüphanesini yeni nesil dizileme için hazırlarken aşağıdaki tüm malzemeler ve yüzeyler RNaz içermeyen olmalıdır. RNA örneklerini tutarken eldiven giyin.
   1. 1 μL asit fenol ekstrakte edilmiş toplam RNA'yı 10 mM Tris-HCl, pH 7.0'ın 9 μL'sinde seyreltin. Üreticinin web sitesinde belirtildiği gibi bir florometre kullanarak sayısallaştırın.
   2. 50 μg RNA içeren numuneleri 10 μL 10 mM Tris-HCl, pH 7.0 ile seyreltin.
      NOT: IP örneklerini ölçmeyin, bir sonraki adım için her şeyi kullanın.
3. Jel saflaştırmalı ribozom korumalı ayak izi parçaları
   1. % 15'lik bir TBE-üre poliakrilamid jeli ayarlayın ve 1x TBE çalışma tamponuna batırın. Örnek yüklemeden önce 200 V'ta 30 dakika çalıştırın. Her numuneye 20 μL 2x TBE-üre numune tamponu ekleyin.
      NOT: Beklenen bant boyutu 25-35 nt civarındadır.
   2. 10 bp DNA merdivenini çözün ve örnekleri (merdiven değil) 80 ° C'de 2 dakika boyunca denatüre edin ve ardından buz üzerinde soğutun. Her numuneyi diğer tüm şeride yükleyin. Jeli 200 V'ta 50-70 dakika çalıştırın.
   3. 60 mL 1x TBE tamponunda 6 μL SYBR Gold (10.000 x konsantre) seyreltin ve ışık korumalı kutularda 15-20 dakika boyunca sallarken lekeleyin. Jeli boyarken, etiketli 1,5 mL tüplerde steril bir neşter ve 0,5 mL jel kırıcı tüpler hazırlayın.
   4. İstenilen bantları steril bir neşterle tüketin (taze bir neşter kullanın veya numuneler arasında iyice temizleyin) ve her jel parçasını bir jel kırıcı tüpe yerleştirin.
   5. Jelde numune kalıntısı kalmadığından emin olmak için jelin görüntüsünü alın.
   6. 20.000 x g'de kesilmiş dilimler içeren tüpleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüj edin ve kalan jel parçalarını jel kırıcı borudan 1,5 mL tüpe aktarın.
   7. 0,5 mL'lik 10 mM Tris, pH 7,0 ekleyin. 1.400 RPM'de bir termal karıştırıcıda 70 ° C'de 10 dakika boyunca çalkalayın.
   8. Geniş delikli pipet ucuna sahip bir selüloz asetat kolonuna aktarın ve 4 °C'de 3 dakika boyunca 20.000 x g'da santrifüj yapın.
   9. Akışı yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın ve buz üzerinde soğutun.
   10. Nükleik asitleri çökeltmek için şunları ekleyin: 550 μL IPA, 55 μL 3 M NaOAc ve 2 μL GlikoMavi ve vorteks iyice karıştırmak için. Numuneleri en az 1 saat boyunca -80 °C'ye yerleştirin.
   11. 20.000 x g ve 4 °C'de en az 1 saat santrifüj yapın ve süpernatanı atın. Peletleri 0.75 mL buz soğuk% 80 etanol ile yıkayın. Peletler alttan ayrılana kadar iyice yıkamak için tüpleri ters çevirin. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 20.000 x g'de tekrar santrifüj yapın ve süpernatanı atın.
   12. 20 s için 450 x g, 4 ° C'de döndürün ve kalan etanolleri çıkarın. Peletleri açık kapakla 65 °C'de 5 dakika kurulayın.
   13. 10 mM Tris, pH 7.0'dan 15 μL ekleyin ve peletleri iyice askıya alın. 20 s için 450 x g, 4 °C'de döndürün ve numuneyi yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın.
       DURMA NOKTASI: Saflaştırılmış RNA birkaç ay boyunca -80 °C'de saklanabilir.
4. Defosforilasyon
   1. Her numune için aşağıdaki karışımdan 3 μL kullanın: ATP'siz 2 μL 10x T4 polinükleotid kinaz reaksiyon tamponuna 1 μL RNaz inhibitörü ekleyin. Her numuneye 2 μL T4 polinükleotid kinaz ekleyin. Pipetle iyice karıştırın ve titremeden 2 saat boyunca 37 °C'de inkübe edin.
   2. Enzimi inaktive etmek için, numuneyi 10 dakika boyunca 75 ° C'de inkübe edin ve 20 s için 450 x g, 4 ° C'de aşağı doğru döndürün.
   3. Nükleik asidi çökeltmek için, 2 μL GlycoBlue, 550 μL IPA ve 55 μL 3 M NaOAc ekleyin.
   4. Vorteks, iyice karıştırmak ve numuneleri -80 ° C'de en az 1 saat soğutmak için vorteks.
      DURMA NOKTASI: Numuneler gece boyunca -80 °C'de veya daha uzun süre saklanabilir.
   5. 5.3.11-5.3.13 arasındaki adımları yineleyin.
      DURMA NOKTASI: Defosforile RNA -80 °C'de aylarca saklanabilir.
5. Biyoanalizör kullanarak niceleme
   1. 1 μL numune ve 4 μL DEPC ile arıtılmış suyu karıştırarak her RNA numunesinin 1: 4 seyreltilmesini sağlayın.
      DİKKAT: DEPC bir kanserojendir. Eldiven giyin ve dikkatli çalışın.
   2. Bir Biyoanalizör Küçük RNA Çipi / TapeStation çalıştırın. Üreticinin protokolünü izleyin.
      NOT: Beklenen ribozom korumalı RNA fragman boyutu 28-30 nt civarındadır.
6. Linker-1 ile Ligate 3' sonu
   1. 5 pmol küçük RNA fragmanını 10 mM Tris, pH 7.0 ile 10 μL'ye seyreltin. Numuneleri 80 ° C'de 2 dakika boyunca denatüre edin ve buz üzerinde soğutun.
   2. Ana karışımı Tablo 4'te ayrıntılı olarak açıklandığı gibi hazırlayın ve numune başına 29 μL kullanın.

Reaktif	Numune başına miktar (μL)	Son konsantrasyon
%50 steril filtrelenmiş PEG 8000	16	20%
cesaret	4	10%
10× T4 RNA ligaz 2 tamponu	4	1 adet
SUPERase-In RNaz İnhibitörü	2	2 U
10 mM adenile bağlayıcı 3-L1	0.1	25 μM
DEPC ile arıtılmış su	2.9
Son cilt	29

Tablo 4: 3' uç ligasyon ana karışımı için tarif.

3. 1 μL T4 RNA ligaz 2 ekleyin ve iyice karıştırmak için hafifçe pipet ekleyin. 2 saat boyunca 23 °C'de inkübe edin.
4. Nükleik asitleri çökeltmek için şunları ekleyin: 550 μL IPA, 500 μL 10 mM Tris, pH 7.0, 55 μL 3 M NaOAc ve 2 μL GlycoBlue. Vorteksi iyice karıştırın ve numuneleri en az 1 saat boyunca -80 ° C'ye yerleştirin.
   DURMA NOKTASI: Numuneleri gece boyunca -80 °C'de veya daha uzun süre saklayın.
5. 5.3.2-5.3.12 arasındaki adımları yineleyin.
6. Peleti 6 μL 10 mM Tris, pH 7.0 içinde yeniden askıya alın. 20 s için 450 x g, 4 °C'de döndürün ve numuneyi yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın.
   DURMA NOKTASI: Numuneler -80 °C'de aylarca saklanabilir.

7. 3' bağlantılı ayak izlerinin jel saflaştırılması
   1. % 10'luk bir TBE-üre poliakrilamid jeli ayarlayın ve 1x TBE çalışan tampona batırın. Örnek yüklemeden önce 200 V'ta 30 dakika çalıştırın. Her numuneye 6 μL 2x TBE-üre numune tamponu ekleyin.
      NOT: Beklenen bant boyutu 71-73 nt civarındadır.
   2. 5.3.2-5.3.13 arasındaki adımları yineleyin.
      DURMA NOKTASI: Numuneler -80 °C'de aylarca saklanabilir.
8. ssDNA oluşturmak için 3ʹ bağlantılı ayak izi parçalarını ters transkripte edin
   1. Tablo 5'te ayrıntılı olarak açıklandığı gibi bir ana karışım hazırlayın ve numune başına 3 μL kullanın.

Reaktif	Numune başına miktar (μL)	Son konsantrasyon
10 mM dNTP'ler	1	0,5 mM
25 μM Bağlayıcı L(rt)	0.5	625 nM
DEPC ile arıtılmış su	1.5
Son cilt	3

Tablo 5: Nükleik asitlerin denatürasyonundan önce ters transkripsiyon tamponu ana karışımı için tarif.

2. Vorteks yapın ve numuneyi aşağı doğru döndürün.
3. Numuneleri 5 dakika boyunca 65 °C'de inkübe edin.
4. Buz üzerinde soğuk örnekler.
5. Tablo 6'da ayrıntılı olarak açıklandığı gibi bir ana karışım hazırlayın ve numune başına 6 μL kullanın. Vorteks yapın ve numuneyi aşağı doğru döndürün. Her numuneye 1 μL Üst Simge III ekleyin ve iyice karıştırmak ve 50 °C'de 30 dakika boyunca inkübe etmek için hafifçe pipet ekleyin.

Reaktif	Numune başına miktar (μL)	Son konsantrasyon
5× FS arabellek	4	1 adet
SUPERase-In RNaz İnhibitörü	1	2 U
DTT 0.1 milyon	1	5 mM
Son cilt	6

Tablo 6: Nükleik asitlerin denatürasyonundan sonra ters transkripsiyon tampon ana karışımı için tarif.

6. RNA'yı hidrolize eden ve ters transkripsiyonu söndüren 2.3 μL 1 N NaOH ekleyin.
   DİKKAT: NaOH oldukça aşındırıcıdır. Eldiven ve göz koruması kullanın.
7. Numune pembeye dönene kadar 95 ° C'de 15 dakika boyunca kuluçkaya yatırın.
8. % 10'luk bir TBE-üre poliakrilamid jeli ayarlayın ve 1x TBE çalışan tampona batırın. Örnek yüklemeden önce 200 V'ta 30 dakika çalıştırın. Her numuneye 23 μL 2x TBE-üre numune tamponu ekleyin.
   NOT: Beklenen DNA bandı boyutu 115-117 nt'dir.
9. 5.3.2-5.3.12 arasındaki adımları yineleyin.
10. Peletin 10 mM Tris, pH 8.0'da 15 μL'de yeniden askıya alınması. 20 s için 450 x g, 4 °C'de döndürün ve numuneyi yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın.
    DURMA NOKTASI: Numuneler -80 °C'de aylarca saklanabilir.

9. ssDNA döngüselleştirme
   1. Aşağıdaki ana karışımı hazırlayın ve Tablo 7'de ayrıntılı olarak açıklandığı gibi numune başına 4 μL yükleyin.

Reaktif	Numune başına miktar (μL)	Son konsantrasyon
10× CircLigase II tamponu	2	1 adet
5 M Betain (isteğe bağlı)	1	0,25 milyon
50 mM MnCl2	1	2,5 mM
Son cilt	4

Tablo 7: ssDNA sirkülarizasyon ana karışımı için tarif.

2. Her numuneye 1 μL CircLigase II ssDNA ligaz ekleyin ve 60 ° C'de 1 saat inkübe edin.
   NOT: Bu adımın verimliliği, 1 saatlik inkübasyondan sonra her numuneye 1 μL CircLigase II ssDNA ligaz eklenerek arttırılabilir.
3. 10 dakika boyunca 80 ° C'de inkübe ederek enzimi etkisiz hale getirin.
4. Buz üzerinde soğutun ve PCR amplifikasyonuna devam edin veya -80 ° C'de saklayın.
   DURMA NOKTASI: Numuneler -80 °C'de yıllarca saklanabilir.

10. PCR amplifikasyonu
    1. Aşağıdaki PCR ana karışımını hazırlayın ve Tablo 8'de ayrıntılı olarak açıklandığı gibi numune başına 82 μL yükleyin.

Reaktif	Numune başına miktar (μL)	Son konsantrasyon
DEPC ile arıtılmış su	61.6
5× Phusion HF reaksiyon tamponu	17.6	1 adet
10 mM dNTP'ler	1.8	200 μM
100 μM PCR ileri astar	0.2	225 nM
HF Phusion polimeraz	0.8	1.6 U
Son cilt	82

Tablo 8: PCR amplifikasyon master karışımı için tarif.

2. Ana karışım içeren her tüpe, 5 μL dairesel DNA ekleyin.
   NOT: Dairesel DNA örneklerinin geri kalanını -80 ° C'de saklayın.
3. Her numuneye farklı bir 1 μL 20 μM PCR ters barkod astarı ekleyin (bkz. Tablo 9) ve iyice karıştırmak için vorteks.
4. Her tüpü dört ayrı PCR tüpüne ayırın, her biri farklı sayıda PCR döngüsü için kullanılacaktır.
5. Tablo 10'da ayrıntılı olarak açıklandığı gibi aşağıdaki programa göre bir PCR reaksiyonu çalıştırın.

Devir	Denatüre (98 °C)	Tavlama (60 °C)	Uzatma (72 °C)
1	30 Saniye
2-16	10 Saniye	10 Saniye	5 sn.

Tablo 10: PCR reaksiyonu için PCR programı.

6. 8, 9, 10 ve 11. döngülerden sonra ilk deneme olarak PCR tüplerini çıkarın (IP örnekleri için döngüler 9 ila 15 arasında değişir). Her döngüden sonra, programı duraklatın, bir aliquot çıkarın ve buza koyun ve ardından programı hızla devam ettirin.
   NOT: Döngü sayısı, her reaksiyondaki dairesel DNA miktarına göre ayarlanmalıdır. Bir örnek ve daha fazla açıklama için Şekil 4'e bakın.
7. Her 17 μL reaksiyona, 3.5 μL 6x DNA yükleme boyası ekleyin.
8. 10 bp DNA merdivenini çözün.
9. Jel-elektroforez ile boyut ayrımı için,% 8 TBE poliakrilamid 1x TBE çalışma tamponuna batırın ve her farklı döngü numarasının numunelerini bitişik kuyucuklara yükleyin ve jeli 180 V'ta 50 dakika boyunca çalıştırın.
10. 60 mL 1x TBE tamponunda 6 μL SYBR Gold (10.000 x konsantre) seyreltin ve ışık korumalı kutularda 15-20 dakika boyunca sallarken lekeleyin.
11. Jeli boyarken, etiketli 1,5 mL tüplerde steril bir neşter ve 0,5 mL jel kırıcı tüpler hazırlayın.
12. Lekeli nükleik asitlerin görüntüsünü alın.
13. İstenilen bandı steril neşter ile beklenen 174-176 bp bant boyutunda kesin ve jel dilimini hazırlanan 0,5 mL jel kırıcı tüpe yerleştirin (numuneler arasında iyice temizleyin ve RNase inaktive edici madde kullanın veya yeni bir bıçağa geçin).
14. Tüpleri 20.000 x g ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüj edin ve ardından kalan jel parçalarını 0,5 mL jel kırıcı tüpünden 1,5 mL tüpe aktarın.
15. 500 μL 10 mM Tris, pH 8.0 ekleyin ve 1.400 RPM'de termal karıştırıcıda 10 dakika ve 70 °C boyunca çalkalayın.
16. Çözünmüş jeli, geniş delikli pipet ucuna sahip bir selüloz asetat kolonuna aktarın.
17. Kolonu 20.000 x g ve 4 ° C'de 3 dakika boyunca santrifüj edin ve akışı yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın ve buz üzerinde soğutun.
18. Nükleik asidi çökeltmek için şunu ekleyin: 550 μL IPA, 32 μL 5 M NaCl, 1 μL 0.5 M EDTA ve 2 μL GlikoMavi ve vorteks iyice karıştırmak için.
19. Numuneleri -80 °C'de en az 1 saat veya gece boyunca -20 °C'de saklayın.
    DURMA NOKTASI: Numuneler gece boyunca -80 °C'de veya daha uzun süre saklanabilir.
20. 5.3.11-5.3.12 arasındaki adımları yineleyin.
21. 10 mM Tris'in 11 μL'sinde yeniden askıya alın, pH 8.0. 20 s için 450 x g, 4 °C'de döndürün ve numuneyi yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın.
    DURMA NOKTASI: Numuneler -80 °C'de yıllarca saklanabilir.

11. Biyoanalizör ile boyut dağılımını ölçme
    1. 1 μL numuneyi 4 μL DEPC ile arıtılmış su ile karıştırarak her numunenin 1:4 seyreltilmesini sağlayın.
    2. Bioanalyzer Small RNA Chip'i çalıştırın. Üreticinin protokolünü izleyin.
       NOT: Beklenen uzunluk 175 ± 5 bp'dir.
12. DNA konsantrasyonunu florometre ile ölçün
    1. Üreticinin tavsiyelerine göre bir florometre ile dsDNA yüksek hassasiyetli konsantrasyon kontrolü yapın.
    2. Illumina tavsiyelerine göre çok sayıda ve dizi numunesi (Index Adapters Pooling Guide¹²).

6. Veri analizi

1. Ek dosyada ayrıntılı olarak açıklandığı gibi analiz gerçekleştirin.

Sonuçlar

Bu protokolün akış şemasında gösterildiği gibi (Şekil 1), hücreler log fazına büyütüldü ve daha sonra filtrasyon ile hızlı bir şekilde toplandı ve kriyojenik öğütme ile lize edildi. Lisat daha sonra ikiye ayrıldı: biri toplam ribozom korumalı mRNA ayak izleri için, diğeri ise etiketli protein-ribozom-yeni doğan zincir komplekslerini aşağı çekmek için afinite saflaştırması yaptığımız seçilmiş ribozom korumalı mRNA ayak izleri için.

Tartışmalar

Burada, protokol, yakın kodon çözünürlüğünde ko-translasyonel etkileşimleri yakalamak için Seçici Ribozom Profilleme yaklaşımını detaylandırmaktadır. Ribozom, kalabalık sitoplazmaya yeni zincir oluşumunu koordine etmek için bir merkez olarak yükseldiğinden, bu, fonksiyonel bir proteom sağlamak ve çeşitli hastalıkları incelemek için gereken çeşitli ko-translasyonel etkileşimleri tanımlamak ve karakterize etmek için çok önemli bir yöntemdir. Bugüne kadar, SeRP bu etkileşimleri doğrud...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
3'-Phosphorylated 28 nt RNA control oligonucleotide	IDT	custom order	RNase free HPLC purification; 5'-AUGUAGUCGGAGUCGAGGCGC GACGCGA/3Phos/-3'
Absolute ethanol	VWR	20821
Acid phenol–chloroform	Ambion	AM9722
Antibody: mouse monclonal anti-HA	Merck	11583816001	12CA5
Aprotinin	Roth	A162.3
ATP*	NEB	P0756S	10 mM
Bacto agar	BD	214030
Bacto peptone	BD	211820
Bacto tryptone	BD	211699
Bacto yeast extract	BD	212720
Bestatin hydrochloride	Roth	2937.2
Chloroform	Merck	102445
CircLigase II ssDNA Ligase*	Epicentre	CL9025K	100 U/μL
Colloidal Coomassie staining solution	Roth	4829
cOmplete, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets	Roche Diagnostics	29384100
Cycloheximide	Biological Industries	A0879
DEPC treated and sterile filtered water*	Sigma	95284
D-Glucose anhydrous	Merck	G5767-500G
Diethylpyrocarbonate	Roth	K028
Dimethylsulfoxide*	Sigma-Aldrich	276855
DNA ladder, 10 bp O'RangeRuler*	Thermo Fisher Scientific	SM1313
DNA loading dye*	Thermo Fisher Scientific	R0631	6×
DNase I, recombinant	Roche	4716728001	RNAse free
dNTP solution set*	NEB	N0446S
EDTA*	Roth	8043
Glycerol	VWR	24388.260.
Glycine solution	Sigma-Aldrich	67419-1ML-F	1 M
GlycoBlue	Ambion	AM9516	15 mg/mL
HEPES	Roth	HN78.3
HF Phusion polymerase*	NEB	M0530L
HK from S. cerevisiae	Sigma-Aldrich	H6380-1.5KU
Hydrochloric acid	AppliChem	A1305
Isopropanol	Sigma-Aldrich	33539
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside	Roth	CN08
Kanamycin	Roth	T832.4
KCl	Roth	6781.1
KH2PO4	Roth	3904.1
Leupeptin	Roth	CN33.4
Linker L(rt)	IDT	custom order
Liquid nitrogen
MgCl2	Roth	KK36.3
Na2HPO4	Roth	P030.2
Na2HPO4·2H2O	Roth	T879.3
NaCl*	Invitrogen	AM97606	5 M
NaH2PO4·H2O	Roth	K300.2
NHS-activated Sepharose 4 fast-flow beads	GE Life Sciences	17090601
Nonidet P 40 substitute	Sigma	74385
Pepstatin A	Roth	2936.2
Phenylmethyl sulfonyl fluoride	Roth	6367
Precast gels	Bio-Rad	5671034	10% and 12%
RNase I	Ambion	AM2294
SDS, 20%	Ambion	AM9820	RNase free
Sodium acetate*	Ambion	AM9740	3 M, pH 5.5
Sodium azide	Merck	S8032-100G
Sodium chloride	Roth	9265
Sodium hydroxide*	Sigma	S2770	1 N
Sucrose	Sigma-Aldrich	16104
SUPERase-In RNase Inhibitor	Ambion	AM2694
Superscript III Reverse Transciptase*	Invitrogen	18080-044
SYBR Gold*	Invitrogen	S11494
T4 polynucleotide kinase*	NEB	M0201L
T4 RNA ligase 2*	NEB	M0242L
TBE polyacrylamide gel*	Novex	EC6215BOX	8%
TBE–urea polyacrylamide gel*	Novex	EC68752BOX	10%
TBE–urea polyacrylamide gel*	Novex	EC6885BOX	15%
TBE–urea sample buffer*	Novex	LC6876	2×
Tris	Roth	4855
Tris*	Ambion	AM9851	1 M, pH 7.0
Tris*	Ambion	AM9856	1 M, pH 8.0
UltraPure 10× TBE buffer*	Invitrogen	15581-044
* - for library preparation
gasket and spring clamp , 90 mm,	Millipore	XX1009020
ground joint flask 1 L ,	Millipore	XX1504705