Identification globale des réseaux d’interaction co-translationnelle par profilage sélectif des ribosomes

Résumé

Les interactions co-traductionnelles jouent un rôle crucial dans les modifications de la chaîne naissante, le ciblage, le pliage et les voies d’assemblage. Nous décrivons ici le profilage sélectif des ribosomes, une méthode d’analyse directe in vivo de ces interactions dans le modèle eucaryote Saccharomyces cerevisiae.

Résumé

Ces dernières années, il est devenu évident que les ribosomes non seulement décodent notre ARNm, mais guident également l’émergence de la chaîne polypeptidique dans l’environnement cellulaire encombré. Les ribosomes fournissent la plate-forme pour la liaison contrôlée spatialement et cinétiquement des facteurs de ciblage membranaire, modifiant les enzymes et pliant les chaperons. Même l’assemblage en complexes oligomères d’ordre élevé, ainsi que les étapes de formation du réseau protéine-protéine, ont récemment été découverts pour être coordonnés avec la synthèse.

Nous décrivons ici le profilage sélectif des ribosomes, une méthode développée pour capturer les interactions co-translationnelles in vivo. Nous détaillerons les différentes étapes de purification d’affinité requises pour capturer les complexes de chaîne naissante de ribosomes avec des interacteurs co-traductionnels, ainsi que les étapes d’extraction de l’ARNm, d’exclusion de taille, de transcription inverse, de séquençage en profondeur et d’analyse de données volumineuses, nécessaires pour déchiffrer les interactions co-traductionnelles en résolution proche du codon.

Introduction

Lerofilage de l’ibosome RR (SeRP) est la seule méthode, à ce jour, qui capture et caractérise les interactions co-translationnelles, in vivo, de manière directe ^1,2,3,4,5,6. SeRP permet un profilage global des interactions de n’importe quel facteur avec la traduction des ribosomes en résolution proche du codon ^2,7.

La méthode repose sur la congélation éclair des cellules en croissance et la préservation de la traduction active. Les lysats cellulaires sont ensuite traités avec de la RNase I pour digérer tout l’ARNm dans la cellule, à l’exception des fragments d’ARNm protégés par les ribosomes appelés « empreintes de ribosomes ». L’échantillon est ensuite divisé en deux parties; une partie est directement utilisée pour l’isolement de toutes les empreintes ribosomiques cellulaires, représentant toute la traduction en cours dans la cellule. La deuxième partie est utilisée pour la purification d’affinité du sous-ensemble spécifique de ribosomes associés à un facteur d’intérêt, par exemple: enzymes modificatrices, facteurs de translocation, chaperons de repliement et interactions d’assemblage complexe. Les empreintes ribosomiques purifiées par affinité sont collectivement appelées interactome. Ensuite, les ARNm protégés par les ribosomes sont extraits et utilisés pour la génération de bibliothèque d’ADNc, suivie d’un séquençage en profondeur.

L’analyse comparative des échantillons totaux de translatome et d’interactome permet d’identifier tous les orfs associés au facteur d’intérêt, ainsi que la caractérisation de chaque profil d’interaction orf. Ce profil rapporte les séquences précises d’apparition et de terminaison de l’engagement à partir desquelles on peut déduire les codons décodés et les résidus respectifs de la chaîne polypeptidique émergente, ainsi que sur les variations de vitesse des ribosomes au cours de ^{l’interaction 7,8}. La figure 1 illustre le protocole sous forme de schéma.

Figure 1 : Vue d’ensemble du protocole SeRP. Ce protocole peut être effectué dans son intégralité dans un délai de 7 à 10 jours. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Protocole

1. Génération de souches pour le profilage sélectif des ribosomes

NOTE: Lerofiling Ribosome P(SeRP) est une méthode qui repose sur la purification d’affinité des facteurs d’intérêt, pour évaluer leur mode d’interaction avec les complexes de chaînes naissantes de ribosomes. La recombinaison homologue⁹, ainsi que les méthodes basées sur CRISPR/Cas9¹⁰ sont utilisées pour fusionner divers facteurs d’intérêt avec des étiquettes pour les purifications d’affinité. Ces étiquettes sont GFP, pour les purifications d’affinité de piège GFP, TAP-tag pour les purifications de perles d’IgG-Sepharose ainsi que AVI-Tag purifié par avidine ou streptavidine, pour énumérer quelques exemples réussis de ces dernières années.

1. Effectuer des tests de croissance ou fonctionnels pour valider que le marquage n’a pas eu d’impact sur la fonction des protéines. L’étiquetage des terminaux N’par rapport à C’doit être évalué.
   REMARQUE: Les ribosomes (ARNr), ainsi que de nombreux domaines de liaison aux ribosomes dans divers facteurs, sont très chargés, ce qui rend les étiquettes très chargées (telles que la polyhistidine) impréférables à utiliser, car elles peuvent conduire à une fausse découverte ou à un mode de liaison modifié.

2. Croissance de la culture

1. Cultiver les cultures de levure construites (basées sur la souche BY4741), contenant les protéines marquées souhaitées, soit dans un milieu riche en extrait de levure liquide-peptone-dextrose (YPD), soit dans un milieu minimal de dextrose synthétique (SD) (1,7 g/L de base d’azote de levure avec sulfate d’ammonium ou 1,7 g/L de base d’azote de levure sans sulfate d’ammonium avec 1 g/L d’acide glutamique monosodique, 2 % de glucose et complété par un mélange complet ou approprié d’acides aminés).
2. Cultiver 250 à 500 mL de culture cellulaire à 0,5 OD₆₀₀ (mi-log), à 30 °C, dans un milieu approprié.

3. Collecte et lyse des cellules

1. Collectez rapidement les cellules par filtration sous vide sur une membrane de buvard de nitrocellulose de 0,45 μm avec un système de filtrage en verre (porte-filtre en verre avec entonnoir en verre de 1 L, base et capuchon en verre, écran en acier inoxydable, joint et pince à ressort, 90 mm; fiole à joint de terre 1 L).
2. Flash congèle les cellules collectées, en grattant les cellules granulées avec une spatule et en les immergeant immédiatement dans un tube de 50 mL rempli d’azote liquide.
   POINT D’ARRÊT: Les cellules peuvent être conservées à -80 ° C pendant 3-4 semaines.
3. Effectuer la lyse cellulaire par broyage cryogénique dans un broyeur mélangeur : deux fois pendant 2 min à 30 Hz, avec 1 mL du tampon de lyse (voir tableau 1). Refroidir dans l’azote liquide entre les broyages.

Réactif	Quantité par échantillon (μL)	Concentration finale
10 mg/mL DE CHX (cycloheximide)	220	0,5 mg/mL
1M Tris-HCl pH 8,0	88	20 mM
3M KCl	205.7	140 mM
1M MgCl2	26.4	6 mM
1M PMSF	4.4	1 mM
NP-40	4.4	0.10%
Inhibiteur de la protéase	2 comprimés
DNase I	8.8	0,02 U/mL
Volume final	4,400

Tableau 1 : Recette du mélange maître tampon de lyse.

REMARQUE: Le tampon de lyse peut être modifié pour contenir plus d’inhibiteurs de la protéase (tels que la bestatine, la leupétine, l’aprotinine, etc.) au cas où la protéine d’intérêt serait très instable, mais il est important d’éviter l’EDTA afin de maintenir les petites et grandes sous-unités du ribosome assemblées au cours des étapes suivantes. Pour des raisons similaires, maintenez toujours au moins 6 mM de MgCl₂ dans la solution tampon.

ATTENTION : Le HCl est très corrosif et le PMSF est toxique. Portez des gants et manipulez-les avec soin.

4. Centrifuger pendant 2 min à 30 000 x g, 4 °C pour éliminer le lysat et recueillir le surnageant.

4. Purification des complexes ribosomes-chaînes naissantes pour SeRP

1. Pour chaque expérience, divisez le surnageant en deux parties; chacun dans un tube de microcentrifugation différent : échantillon d’ARN total (~200 μL) et échantillon d’immunopurification (IP) (~700 μL) échantillons de translatome.
2. Traitement de l’échantillon d’ARN total
   1. Digérer l’échantillon d’ARN total à l’aide de 10 U de RNase I pendant 25 min à 4 °C; tourner à 30 tr/min avec un rack de mélange rotatif.
      REMARQUE: Les conditions de digestion peuvent être calibrées à l’aide du profilage des polysomes pour assurer qu’il n’y a pas de pic de sur- ou de sous-digestion des monosomes.
   2. Préparer le mélange principal de coussin de saccharose tel que décrit dans le tableau 2.

Réactif	Quantité par échantillon (μL)	Concentration finale
50% de saccharose	200	25%
1M Tris-HCl pH 8,0	8	20 mM
3M KCl	18.7	140 mM
1M MgCl2	4	10 mM
100 mg/mL CHX	0.4	0,1 mg/mL
Inhibiteur de la protéase	1 comprimé
Volume final	400

Tableau 2 : Recette du mélange maître de coussin de saccharose.

3. Charger l’échantillon sur 400 μL du coussin de saccharose et centrifuger dans un rotor TLA120 pendant 90 min à 245 000 x g et à 4 °C.
4. Retirez rapidement le surnageant à l’aide d’une pompe à vide et superposez les pastilles avec un tampon de lyse de 150 μL. Remettre en suspension les granulés en agitant pendant 1 h à 4 °C et à 300 tr/min.
5. Remettre en suspension la pastille résiduelle par pipetage et transférer dans un nouveau tube de 1,5 mL.
   REMARQUE: 100-200 μg d’ARN total est généralement suffisant pour le profilage des ribosomes du translatome total. On peut ajouter une étape d’épuisement de l’ARNr afin de réduire la contamination par l’ARNr, qui est le contaminant le plus répandu des complexes de chaînes ribosomes-naissantes purifications d’affinité¹¹ (voir la discussion pour plus de détails).

3. Traitement de l’échantillon d’immunopurification
   1. Laver 100-400 μL de la matrice de liaison d’affinité (billes conjuguées aux anticorps 1:1 dans 70% EtOH) par échantillon avec 3 x 1 mL de tampon de lyse (sans DNase I et inhibiteurs de la protéase); remettez en suspension la matrice d’affinité dans le tampon de lyse, puis faites pivoter à 30 tr/min avec un rack de mélange rotatif à 4 °C pendant 5 min. Précipiter par centrifugation pendant 30 s à 3 000 x g, 4 °C. Jetez le liquide supérieur. Répétez trois fois.
   2. Digérer des échantillons d’immunopurification en utilisant 10 U par unité A260 nm de RNase I, ainsi qu’une matrice de liaison d’affinité (par exemple, 100-400 μL de GFP-TRAP par échantillon).
   3. Faire pivoter pendant 25 min à 30 tr/min avec un rack de mélange rotatif pour lier la protéine à la matrice d’affinité, à 4 °C.
   4. Préparez le mélange maître tampon de lavage comme indiqué dans le tableau 3.

Réactif	Quantité par échantillon (μL)	Concentration finale
10 mg/mL CHX	50	0,1 mg/mL
1M Tris-HCl pH 8,0	100	20 mM
3M KCl	233	140 mM
1M MgCl2	50	10 mM
1M PMSF	5	1 mM
NP-40	0.5	0.01%
Inhibiteur de la protéase	2 comprimés
50% Glycérol	1,000	10%
Volume final	5,000

Tableau 3 : Recette du mélange maître tampon de lavage.

5. Lavez la matrice de liaison d’affinité trois fois avec 1 mL de tampon de lavage, à chaque fois pendant environ 1 min, en tournant dans la grille de mélange à 30 tr / min, à 4 ° C.
6. Précipiter par centrifugation à 3 000 x g pendant 30 s à 4 °C. Jetez le liquide supérieur.
7. Lavez deux fois de plus dans un tampon de lavage de 1 mL, à chaque fois pendant 5 min, en tournant dans le rack de mélange à 30 tr /min, à 4 °C.
8. Précipiter par centrifugation pendant 30 s à 3 000 x g et 4 °C.
9. Utilisez 50 μL de billes pour l’élution des protéines avec la même quantité de tampon d’échantillon 2x. Utilisez le reste des perles pour l’extraction de l’ARN.
10. Centrifuger pendant 30 s à 3 000 x g, 4 °C pour granuler les billes et jeter le liquide supérieur.
11. Congeler dans de l’azote liquide et conserver à -80 °C. Utilisez ces échantillons pour l’extraction ultérieure de l’ARN.
    POINT D’ARRÊT : Les échantillons peuvent être conservés à -80 °C pendant la nuit ou plus longtemps. Cela peut être un point d’arrêt.
12. Évaluez le succès de l’étape de purification d’affinité par western blot ou coloration de Coomassie avec des aliquotes (~10% en volume, après mélange) de chaque étape. Utilisez toujours une adresse IP fictive sur une souche WT non marquée comme contrôle de la liaison non spécifique à la matrice d’affinité.
    REMARQUE: Un fond non spécifique élevé peut être surmonté par des étapes de lavage supplémentaires avec des concentrations croissantes de sel / détergent. L’interaction transitoire peut être stabilisée par divers agents de réticulation, par exemple, le traitement par paraformaldéhyde (PFA) des cellules vivantes - l’ajout de 0,4% à 1% de PFA au milieu de croissance pendant 2 à 5 minutes, suivi d’une trempe à la glycine (0,3 M) pendant 3 minutes, est fortement recommandé.
    ATTENTION : Le paraformaldéhyde est un cancérogène présumé. Étant donné que le paraformaldéhyde s’évapore rapidement et est corrosif, travaillez dans une hotte de sécurité chimique et portez deux couches de gants.

5. Préparation de la bibliothèque d’ADNc pour le séquençage en profondeur

1. Extraction de l’ARN
   REMARQUE: Travailler avec des tubes antiadhésifs de 1,5 mL sans RNase pour prévenir un éventuel épuisement de l’ARN ou de l’ADN.
   1. Décongeler les échantillons des étapes 4.2.5 et 4.3.12 sur de la glace et remettre en suspension des échantillons avec 10 mM Tris-HCl pH 7,0 jusqu’à un volume final de 700 μL.
      ATTENTION : L’acide-phénol et le chloroforme sont volatils et nocifs. Travailler dans une hotte de sécurité chimique.
   2. Ajouter 40 μL de FDS à 20 % à 0,7 mL d’ARN total ou d’élutions IP. Fermez et inversez plusieurs fois. La précipitation des protéines devrait rendre les échantillons blancs.
   3. Ajouter 0,75 mL d’acide-phénol:chloroforme préchauffé aux échantillons. Scellez hermétiquement les tubes et secouez-les dans un mélangeur thermique à 1 400 tr/min pendant 5 min et à 65 °C. Refroidir les échantillons sur la glace pendant 5 min.
   4. Centrifuger le tube à partir de l’étape 5.1.3. à 20 000 x g pendant 2 min. Transférer la couche aqueuse supérieure dans un tube frais et y ajouter 0,7 mL d’acide-phénol:chloroforme.
   5. Incuber pendant 5 min à température ambiante, parfois en vortexant. Centrifuger pendant 2 min à 20 000 x g. Transférer la couche aqueuse supérieure dans un tube frais et y ajouter 0,6 mL de chloroforme et de vortex.
   6. Centrifuger pendant 1 min à 20 000 x g. Transférer la couche aqueuse supérieure dans un tube frais.
   7. Précipiter les acides nucléiques en ajoutant 78 μL de 3 M NaOAc, pH 5,5, 2 μL de GlycoBlue et 0,75 mL d’isopropanol. Vortex à fond pendant 5 min. Incuber pendant au moins 1 h à -80 °C ou 16 h à -20 °C.
   8. Centrifuger pendant 30 min à 20 000 x g et à 4 °C et jeter le surnageant. Lavez les granulés avec 0,75 mL d’éthanol glacé à 80 %. Inverser les tubes pour un lavage en profondeur. Centrifuger à 20 000 x g pendant 5 min à 4 °C, puis jeter le surnageant.
   9. Tourner à 450 x g, 4 °C pendant 20 s et retirer l’éthanol restant et jeter les liquides. Sécher la pastille avec un couvercle ouvert pendant 5 min à 65 °C. Remettre en suspension les échantillons comme suit: pour IP, remettre l’échantillon en suspension dans 10 μL de 10 mM Tris-HCl, pH 7,0. Pour l’analyse du translatome total, remettre l’échantillon en suspension dans 20 μL de 10 mM Tris-HCl, pH 7,0.
      POINT D’ARRÊT : L’ARN peut être stocké à -80 °C pendant des mois.
2. Quantifier la concentration d’ARN total par fluorométrie
   REMARQUE : Tous les matériaux et surfaces suivants doivent être exempts de RNase lors de la préparation de la bibliothèque d’ADNc pour le séquençage de nouvelle génération. Lorsque vous manipulez des échantillons d’ARN, portez des gants.
   1. Diluer 1 μL d’ARN total extrait du phénol acide dans 9 μL de 10 mM de Tris-HCl, pH 7,0. Quantifier à l’aide d’un fluoromètre, comme indiqué sur le site Web du fabricant.
   2. Diluer les échantillons contenant 50 μg d’ARN avec 10 μL de 10 mM de Tris-HCl, pH 7,0.
      REMARQUE: Ne mesurez pas les échantillons IP, utilisez tout pour l’étape suivante.
3. Fragments d’empreinte protégés par le ribosome purifiant le gel
   1. Réglez un gel de polyacrylamide TBE-urée à 15% et immergez-le dans 1x tampon de fonctionnement TBE. Exécuter pendant 30 min à 200 V avant le chargement de l’échantillon. À chaque échantillon, ajoutez 20 μL de 2x tampon d’échantillon d’urée TBE.
      REMARQUE: La taille de bande prévue est d’environ 25-35 nt.
   2. Décongeler une échelle d’ADN de 10 pb et dénaturer les échantillons (pas l’échelle) à 80 °C pendant 2 min, puis refroidir sur la glace. Chargez chaque échantillon sur une autre voie. Faites fonctionner le gel pendant 50-70 min à 200 V.
   3. Diluer 6 μL d’or SYBR (10 000 x concentré) dans 60 mL de tampon 1x TBE et tacher tout en agitant dans des boîtes à l’abri de la lumière pendant 15 à 20 min. Pendant la coloration du gel, préparez un scalpel stérile et des tubes brise-gel de 0,5 mL dans des tubes étiquetés de 1,5 mL.
   4. Retirez les bandes souhaitées avec un scalpel stérile (utilisez-en un frais ou nettoyez bien entre les échantillons) et placez chaque morceau de gel dans un tube brise-gel.
   5. Prenez une image du gel pour vous assurer qu’aucun résidu d’échantillon n’est laissé dans le gel.
   6. Centrifuger les tubes contenant des tranches coupées à 20 000 x g pendant 5 min à 4 °C et transférer les morceaux de gel restants du tube brise-gel vers le tube de 1,5 mL.
   7. Ajouter 0,5 mL de Tris 10 mM, pH 7,0. Agiter dans un mélangeur thermique à 1 400 tr/min pendant 10 min à 70 °C.
   8. Transférer dans une colonne d’acétate de cellulose avec une pointe de pipette à large alésage et centrifuger à 20 000 x g pendant 3 min à 4 °C.
   9. Transférer l’écoulement dans un nouveau tube de 1,5 mL et refroidir sur la glace.
   10. Afin de précipiter les acides nucléiques, ajoutez: 550 μL d’IPA, 55 μL de 3 M NaOAc et 2 μL de GlycoBlue et de vortex à bien mélanger. Placer les échantillons à -80 °C pendant au moins 1 h.
   11. Centrifuger pendant au moins 1 h à 20 000 x g et 4 °C et jeter le surnageant. Lavez les granulés avec 0,75 mL d’éthanol glacé à 80 %. Inverser les tubes pour un lavage en profondeur jusqu’à ce que les granulés se séparent du fond. Centrifuger à nouveau à 20 000 x g pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnageant.
   12. Tourner à 450 x g, 4 °C pendant 20 s et retirer l’éthanol restant. Sécher les granulés avec un couvercle ouvert pendant 5 min à 65 °C.
   13. Ajouter 15 μL de Tris de 10 mM, pH 7,0 et remettre soigneusement les granulés en suspension. Tourner vers le bas à 450 x g, 4 °C pendant 20 s et transférer l’échantillon dans un nouveau tube de 1,5 mL.
       POINT D’ARRÊT: L’ARN purifié peut être stocké à -80 ° C pendant quelques mois.
4. Déphosphorylation
   1. Utilisez 3 μL du mélange suivant pour chaque échantillon : Ajouter 1 μL d’inhibiteur de la RNase dans 2 μL de tampon de réaction de polynucléotide kinase T4 sans ATP. Ajouter 2 μL de polynucléotide kinase T4 à chaque échantillon. Pipetter doucement pour bien mélanger et incuber à 37 °C pendant 2 h, sans secouer.
   2. Pour inactiver l’enzyme, incuber l’échantillon à 75 °C pendant 10 min et tourner vers le bas à 450 x g, 4 °C, pendant 20 s. Ajouter 0,5 mL de 10 mM Tris, pH 7,0.
   3. Pour précipiter l’acide nucléique, ajoutez 2 μL de GlycoBlue, 550 μL d’IPA et 55 μL de 3 M NaOAc.
   4. Vortex pour bien mélanger et refroidir les échantillons à -80 °C pendant au moins 1 h.
      POINT D’ARRÊT : Les échantillons peuvent être conservés à -80 °C pendant la nuit ou plus longtemps.
   5. Répétez les étapes 5.3.11 à 5.3.13.
      POINT D’ARRÊT: L’ARN déphosphorylé peut être stocké à -80 ° C pendant des mois.
5. Quantification à l’aide d’un bioanalyseur
   1. Effectuer une dilution 1:4 de chaque échantillon d’ARN en mélangeant 1 μL d’échantillon et 4 μL d’eau traitée au DEPC.
      ATTENTION : Le DEPC est cancérigène. Portez des gants et travaillez avec précaution.
   2. Exécutez un bioanalyseur Small RNA Chip/TapeStation. Suivez le protocole du fabricant.
      REMARQUE: La taille attendue des fragments d’ARN protégés par les ribosomes est d’environ 28-30 nt.
6. Ligate 3' avec Linker-1
   1. Diluer 5 pmol de petits fragments d’ARN à 10 μL avec 10 mM de Tris, pH 7,0. Dénaturer les échantillons à 80 °C pendant 2 min et refroidir sur la glace.
   2. Préparer le mélange principal comme indiqué dans le tableau 4 et utiliser 29 μL par échantillon.

Réactif	Quantité par échantillon (μL)	Concentration finale
50% de PEG 8000 filtré stérile	16	20%
DMSO	4	10%
Tampon 10× ARN ligase 2 T4	4	1x
Inhibiteur de la RNase SUPERase-In	2	2 U
Linker adénylé 10 mM 3-L1	0.1	25 μM
Eau traitée au DEPC	2.9
Volume final	29

Tableau 4 : Recette du mélange maître de ligature finale de 3'.

3. Ajouter 1 μL d’ARN T4 ligase 2 et pipeter doucement pour bien mélanger. Incuber à 23 °C pendant 2 h.
4. Afin de précipiter les acides nucléiques, ajoutez: 550 μL d’IPA, 500 μL de Tris de 10 mM, pH 7,0, 55 μL de 3 M NaOAc et 2 μL de GlycoBlue. Vortex pour bien mélanger et placer les échantillons à -80 °C pendant au moins 1 h.
   POINT D’ARRÊT : Conservez les échantillons à -80 °C pendant la nuit ou plus longtemps.
5. Répétez les étapes 5.3.2 à 5.3.12.
6. Remettre en suspension la pastille dans 6 μL de 10 mM Tris, pH 7,0. Tourner vers le bas à 450 x g, 4 °C pendant 20 s, et transférer l’échantillon dans un nouveau tube de 1,5 mL.
   POINT D’ARRÊT: Les échantillons peuvent être conservés à -80 °C pendant des mois.

7. Purification en gel des empreintes liées à 3'
   1. Réglez un gel de polyacrylamide TBE-urée à 10% et immergez-le dans 1x tampon de fonctionnement TBE. Exécuter pendant 30 min à 200 V avant le chargement de l’échantillon. À chaque échantillon, ajoutez 6 μL de 2x tampon d’échantillon d’urée TBE.
      REMARQUE: La taille de bande prévue est d’environ 71-73 nt.
   2. Répétez les étapes 5.3.2 à 5.3.13.
      POINT D’ARRÊT: Les échantillons peuvent être conservés à -80 °C pendant des mois.
8. Transcrire à l’envers 3ʹ fragments d’empreinte liés pour générer de l’ADNSs
   1. Préparer un mélange principal comme indiqué dans le tableau 5 et utiliser 3 μL par échantillon.

Réactif	Quantité par échantillon (μL)	Concentration finale
10 mM dNTPs	1	0,5 mM
Linker L(rt) de 25 μM	0.5	625 nM
Eau traitée au DEPC	1.5
Volume final	3

Tableau 5 : Recette du mélange maître tampon de transcription inverse avant la dénaturation des acides nucléiques.

2. Vortex et rotation de l’échantillon.
3. Incuber des échantillons à 65 °C pendant 5 min.
4. Refroidir les échantillons sur la glace.
5. Préparer un mélange maître comme indiqué dans le tableau 6 et utiliser 6 μL par échantillon. Vortex et rotation de l’échantillon. Ajouter 1 μL d’exposant III à chaque échantillon et pipeter doucement pour bien mélanger et incuber pendant 30 min à 50 °C.

Réactif	Quantité par échantillon (μL)	Concentration finale
5× Tampon FS	4	1x
Inhibiteur de la RNase SUPERase-In	1	2 U
TNT 0,1 M	1	5 mM
Volume final	6

Tableau 6 : Recette du mélange maître tampon de transcription inverse après dénaturation des acides nucléiques.

6. Ajouter 2,3 μL de 1 N NaOH, ce qui hydrolyse l’ARN et éteint la transcription inverse.
   ATTENTION : Le NaOH est très corrosif. Portez des gants et une protection oculaire.
7. Incuber pendant 15 min à 95 °C, jusqu’à ce que l’échantillon devienne rose.
8. Réglez un gel de polyacrylamide TBE-urée à 10% et immergez-le dans 1x tampon de fonctionnement TBE. Exécuter pendant 30 min à 200 V avant le chargement de l’échantillon. À chaque échantillon, ajoutez 23 μL de 2x tampon d’échantillon d’urée TBE.
   REMARQUE: La taille prévue de la bande d’ADN est de 115-117 nt.
9. Répétez les étapes 5.3.2 à 5.3.12.
10. Remettre en suspension la pastille dans 15 μL de 10 mM Tris, pH 8,0. Tourner vers le bas à 450 x g, 4 °C pendant 20 s et transférer l’échantillon dans un nouveau tube de 1,5 mL.
    POINT D’ARRÊT: Les échantillons peuvent être conservés à -80 °C pendant des mois.

9. Circularisation de l’ADNs ssDNA
   1. Préparer le mélange maître suivant et charger 4 μL par échantillon, comme indiqué dans le tableau 7.

Réactif	Quantité par échantillon (μL)	Concentration finale
10× Tampon CircLigase II	2	1x
5 M Bétaïne (facultatif)	1	0,25 m
50 mM MnCl2	1	2,5 mM
Volume final	4

Tableau 7 : Recette du mélange maître de circularisation de l’ADNSS .

2. Ajouter 1 μL de circLigase II ssDNA ligase à chaque échantillon et incuber pendant 1 h à 60 °C.
   REMARQUE: L’efficacité de cette étape peut être augmentée en ajoutant 1 μL de CircLigase II ssDNA ligase à chaque échantillon après 1 h d’incubation.
3. Inactiver l’enzyme en incubant à 80 °C pendant 10 min.
4. Refroidir sur la glace et continuer à l’amplification PCR ou stocker à -80 °C.
   POINT D’ARRÊT: Les échantillons peuvent être conservés à -80 ° C pendant des années.

10. Amplification PCR
    1. Préparez le mélange maître PCR suivant et chargez 82 μL par échantillon, comme indiqué dans le tableau 8.

Réactif	Quantité par échantillon (μL)	Concentration finale
Eau traitée au DEPC	61.6
5× Tampon de réaction PHusion HF	17.6	1x
10 mM dNTPs	1.8	200 μM
Amorce avant PCR 100 μM	0.2	225 nM
HF Phusion polymérase	0.8	1,6 U
Volume final	82

Tableau 8 : Recette du mélange maître d’amplification PCR.

2. À chaque tube contenant le mélange maître, ajouter 5 μL d’ADN circularisé.
   REMARQUE: Conservez le reste des échantillons d’ADN circularisés à -80 ° C.
3. Ajouter un autre 1 μL de 20 μM d’amorce de code-barres inverse PCR à chaque échantillon (voir le tableau 9) et un vortex pour bien mélanger.
4. Aliquotez chaque tube dans quatre tubes PCR distincts, chacun sera utilisé pour un nombre différent de cycles PCR.
5. Exécutez une réaction PCR selon le programme suivant, comme détaillé dans le tableau 10.

Cycle	Dénature (98 °C)	Recuit (60 °C)	Étendre (72 °C)
1	30 s
2-16	10 s	10 s	5 s

Tableau 10 : Programme de PCR pour la réaction par PCR.

6. Après les cycles 8, 9, 10 et 11, retirez les tubes PCR (pour les échantillons IP, les cycles vont de 9 à 15) comme première tentative. Après chaque cycle, mettez le programme en pause, sortez une aliquote et mettez-la sur la glace, puis reprenez rapidement le programme.
   REMARQUE: Le nombre de cycles doit être ajusté en fonction de la quantité d’ADN circularisé dans chaque réaction. Reportez-vous à la figure 4 pour un exemple et des éclaircissements supplémentaires.
7. À chaque réaction de 17 μL, ajoutez 3,5 μL de colorant à charge d’ADN 6x.
8. Décongeler une échelle d’ADN de 10 pb.
9. Pour la séparation des tailles par électrophorèse sur gel, immergez 8% de polyacrylamide TBE dans 1x tampon de fonctionnement TBE et chargez les échantillons de chaque numéro de cycle différent dans des puits adjacents et faites couler le gel pendant 50 min à 180 V.
10. Diluer 6 μL d’or SYBR (10 000 x concentré) dans 60 mL de tampon 1x TBE et tacher tout en agitant dans des boîtes à l’abri de la lumière pendant 15 à 20 min.
11. Pendant la coloration du gel, préparez un scalpel stérile et des tubes brise-gel de 0,5 mL dans des tubes étiquetés de 1,5 mL.
12. Prenez une image des acides nucléiques colorés.
13. Coupez la bande souhaitée avec une taille de bande prévue de 174-176 bp avec le scalpel stérile et placez la tranche de gel dans le tube de gel de 0,5 mL préparé (nettoyez soigneusement entre les échantillons et utilisez un agent inactivant RNase, ou passez à une nouvelle lame).
14. Centrifugez les tubes pendant 5 min à 20 000 x g et 4 °C, puis transférez les morceaux de gel restants du tube de 0,5 mL de brise-gel vers le tube de 1,5 mL.
15. Ajouter 500 μL de Tris de 10 mM, pH 8,0 et agiter dans un mélangeur thermique à 1 400 tr/min pendant 10 min et 70 °C.
16. Transférer le gel dissous dans une colonne d’acétate de cellulose avec une pointe de pipette à large alésage.
17. Centrifuger la colonne pendant 3 min à 20 000 x g et 4 °C et transférer l’écoulement dans un nouveau tube de 1,5 mL et refroidir sur glace.
18. Pour précipiter l’acide nucléique, ajoutez : 550 μL d’IPA, 32 μL de 5 M NaCl, 1 μL de 0,5 M EDTA et 2 μL de GlycoBlue et de vortex à bien mélanger.
19. Conservez les échantillons pendant au moins 1 h à -80 °C ou -20 °C pendant la nuit.
    POINT D’ARRÊT : Les échantillons peuvent être conservés à -80 °C pendant la nuit ou plus longtemps.
20. Répétez les étapes 5.3.11 à 5.3.12.
21. Remettre en suspension dans 11 μL de 10 mM Tris, pH 8,0. Tourner vers le bas à 450 x g, 4 °C pendant 20 s et transférer l’échantillon dans un nouveau tube de 1,5 mL.
    POINT D’ARRÊT: Les échantillons peuvent être conservés à -80 ° C pendant des années.

11. Quantifier la distribution de taille par bioanalyseur
    1. Effectuer une dilution 1:4 de chaque échantillon en mélangeant 1 μL d’échantillon avec 4 μL d’eau traitée au DEPC.
    2. Exécutez la puce à petit ARN Bioanalyzer. Suivez le protocole du fabricant.
       REMARQUE: La longueur prévue est de 175 ± 5 pb.
12. Quantifier la concentration d’ADN par fluoromètre
    1. Effectuez un contrôle de concentration haute sensibilité dsDNA avec un fluoromètre conformément aux recommandations du fabricant.
    2. Échantillons multiplex et séquentiels selon les recommandations d’Illumina (Guide de regroupement des adaptateurs d’index¹²).

6. Analyse des données

1. Effectuer l’analyse détaillée dans le fichier supplémentaire.

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Résultats

Comme l’illustre l’organigramme de ce protocole (Figure 1), les cellules ont été cultivées en phase logarithmique, puis collectées rapidement par filtration et lysées par broyage cryogénique. Le lysat a ensuite été divisé en deux: l’un pour les empreintes totales d’ARNm protégées par les ribosomes et l’autre pour les empreintes d’ARNm protégées par les ribosomes sélectionnées, sur lesquelles nous avons effectué une purification d’affinité pour abaisser les comp...

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Discussion

Ici, le protocole détaille l’approche de profilage sélectif des ribosomes pour capturer les interactions co-traductionnelles dans une résolution proche du codon. Au fur et à mesure que le ribosome devient une plaque tournante pour coordonner l’émergence de la chaîne naissante dans le cytoplasme surpeuplé, il s’agit d’une méthode cruciale pour identifier et caractériser les diverses interactions co-translationnelles nécessaires pour assurer un protéome fonctionnel, ainsi que pour étudier diverses mala...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
3'-Phosphorylated 28 nt RNA control oligonucleotide	IDT	custom order	RNase free HPLC purification; 5'-AUGUAGUCGGAGUCGAGGCGC GACGCGA/3Phos/-3'
Absolute ethanol	VWR	20821
Acid phenol–chloroform	Ambion	AM9722
Antibody: mouse monclonal anti-HA	Merck	11583816001	12CA5
Aprotinin	Roth	A162.3
ATP*	NEB	P0756S	10 mM
Bacto agar	BD	214030
Bacto peptone	BD	211820
Bacto tryptone	BD	211699
Bacto yeast extract	BD	212720
Bestatin hydrochloride	Roth	2937.2
Chloroform	Merck	102445
CircLigase II ssDNA Ligase*	Epicentre	CL9025K	100 U/μL
Colloidal Coomassie staining solution	Roth	4829
cOmplete, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets	Roche Diagnostics	29384100
Cycloheximide	Biological Industries	A0879
DEPC treated and sterile filtered water*	Sigma	95284
D-Glucose anhydrous	Merck	G5767-500G
Diethylpyrocarbonate	Roth	K028
Dimethylsulfoxide*	Sigma-Aldrich	276855
DNA ladder, 10 bp O'RangeRuler*	Thermo Fisher Scientific	SM1313
DNA loading dye*	Thermo Fisher Scientific	R0631	6×
DNase I, recombinant	Roche	4716728001	RNAse free
dNTP solution set*	NEB	N0446S
EDTA*	Roth	8043
Glycerol	VWR	24388.260.
Glycine solution	Sigma-Aldrich	67419-1ML-F	1 M
GlycoBlue	Ambion	AM9516	15 mg/mL
HEPES	Roth	HN78.3
HF Phusion polymerase*	NEB	M0530L
HK from S. cerevisiae	Sigma-Aldrich	H6380-1.5KU
Hydrochloric acid	AppliChem	A1305
Isopropanol	Sigma-Aldrich	33539
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside	Roth	CN08
Kanamycin	Roth	T832.4
KCl	Roth	6781.1
KH2PO4	Roth	3904.1
Leupeptin	Roth	CN33.4
Linker L(rt)	IDT	custom order
Liquid nitrogen
MgCl2	Roth	KK36.3
Na2HPO4	Roth	P030.2
Na2HPO4·2H2O	Roth	T879.3
NaCl*	Invitrogen	AM97606	5 M
NaH2PO4·H2O	Roth	K300.2
NHS-activated Sepharose 4 fast-flow beads	GE Life Sciences	17090601
Nonidet P 40 substitute	Sigma	74385
Pepstatin A	Roth	2936.2
Phenylmethyl sulfonyl fluoride	Roth	6367
Precast gels	Bio-Rad	5671034	10% and 12%
RNase I	Ambion	AM2294
SDS, 20%	Ambion	AM9820	RNase free
Sodium acetate*	Ambion	AM9740	3 M, pH 5.5
Sodium azide	Merck	S8032-100G
Sodium chloride	Roth	9265
Sodium hydroxide*	Sigma	S2770	1 N
Sucrose	Sigma-Aldrich	16104
SUPERase-In RNase Inhibitor	Ambion	AM2694
Superscript III Reverse Transciptase*	Invitrogen	18080-044
SYBR Gold*	Invitrogen	S11494
T4 polynucleotide kinase*	NEB	M0201L
T4 RNA ligase 2*	NEB	M0242L
TBE polyacrylamide gel*	Novex	EC6215BOX	8%
TBE–urea polyacrylamide gel*	Novex	EC68752BOX	10%
TBE–urea polyacrylamide gel*	Novex	EC6885BOX	15%
TBE–urea sample buffer*	Novex	LC6876	2×
Tris	Roth	4855
Tris*	Ambion	AM9851	1 M, pH 7.0
Tris*	Ambion	AM9856	1 M, pH 8.0
UltraPure 10× TBE buffer*	Invitrogen	15581-044
* - for library preparation
gasket and spring clamp , 90 mm,	Millipore	XX1009020
ground joint flask 1 L ,	Millipore	XX1504705